硫酸鹽還原菌對(duì)煤系地下水水質(zhì)的影響

劉 碩,葛曉光,漆 春,趙廣秀

(合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

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硫酸鹽還原菌對(duì)煤系地下水水質(zhì)的影響

劉 碩,葛曉光,漆 春,趙廣秀

(合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

我國黃淮平原地區(qū)的煤田中,礦井井下揭露的地下水礦化度多在2～4 g/L,優(yōu)勢(shì)離子一般為SO42-,但有些礦井充水地層SO42-含量卻很低。SO42-含量低的潘北礦煤系地下水中含有硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB),地下水在SRB作用下能發(fā)生脫硫酸作用。文章以實(shí)驗(yàn)的方法研究發(fā)現(xiàn)SRB能利用煤作為碳源,使地下水水質(zhì)發(fā)生變化。脫硫酸作用后礦井水pH值升高,礦化度降低,硬度降低,SO42-、Ca2+及Mg2+質(zhì)量濃度降低,CO32-和HCO3-質(zhì)量濃度升高,Cl-、Na+、K+質(zhì)量濃度不變。

硫酸鹽還原菌;硫酸鹽;脫硫酸作用;地下水;水質(zhì)

在我國黃淮平原地區(qū)的煤田中,礦井井下揭露的地下水礦化度多在2～4 g/L,優(yōu)勢(shì)離子一般為SO42-[1]。但有些礦井充水地層SO42-含量卻很低,如淮南礦區(qū)的潘北礦。這種SO42-低值異?，F(xiàn)象與通常的水文地質(zhì)化學(xué)規(guī)律相悖[2]。脫硫酸作用是一項(xiàng)基本的水文地球化學(xué)作用[3],通常發(fā)生在含有機(jī)質(zhì)的還原環(huán)境中,該作用是由硫酸鹽還原細(xì)菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)導(dǎo)致的[4-6]。已有相關(guān)研究證實(shí)這類地下水中存在硫酸鹽還原菌[2,5,7-8],雖然證實(shí)了煤系地下水可發(fā)生脫硫酸作用[9],但是對(duì)該作用對(duì)煤系地下水水質(zhì)影響的研究并不深入。本文以實(shí)驗(yàn)的方法,選取SO42-含量異常的潘北礦礦井水作為菌種來源,研究硫酸鹽還原菌對(duì)SO42-含量正常的濉肖礦區(qū)劉橋二礦礦井水水質(zhì)的改變,以確認(rèn)造成兩礦礦井水水質(zhì)差異的部分原因?yàn)槊摿蛩嶙饔谩?/p>

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品采集

菌樣取自淮南礦區(qū)潘北礦-490 m深井,終孔層位在石炭系太原組,水溫38.4 ℃,水質(zhì)為Na-Cl·HCO3-型,水略有臭味。用2個(gè)滅菌后的500 mL磨口玻璃瓶接取鉆孔水,充滿后蓋緊瓶塞,用PTEE膠帶纏封瓶口,通過便攜式保溫箱攜帶,當(dāng)天送往實(shí)驗(yàn)室,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

水樣取自濉肖礦區(qū)劉橋二礦-650 m深井,終孔層位在二疊系煤系砂巖含水層,水溫39.2 ℃,水質(zhì)為Ca-SO42-型。煤樣取自劉橋二礦下二疊系山西組煤層,取樣方法為刻槽法,煤樣所在層位距離水樣所在含水層法向距離約15 m。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

將含菌礦井水取5 mL接種進(jìn)Postgate B[10]培養(yǎng)基中,放入恒溫培養(yǎng)箱(SKP-01B型)40 ℃厭氧培養(yǎng)5 d。采用平皿壓層厭氧法[11],用Postgate E[10]培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的分離。用Postgate C[10]培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的擴(kuò)大繁殖。如此反復(fù)進(jìn)行3次分離純化,可得到1株較純菌株,命名為S890。

本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)裝置采用容積為500 mL的磨口錐形瓶,設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照組,編號(hào)為A、B、C組。將所取煤樣放入干燥箱(DHG-9010-2SA型)在110 ℃下干燥5 h。磨成粉末(JP-150A-8粉碎機(jī)),過200目篩[1],稱取20 g,用聚丙烯無紡布包裹3層,用自鎖式尼龍?jiān)鷰Юυ?將包好的煤樣放入錐形瓶中。取500 mL水樣放入錐形瓶?jī)?nèi),用紗布密封瓶口。將密封好的錐形瓶和瓶塞放入滅菌器(YXQ.SG41.280手提式)在0.15 MPa下高溫滅菌30 min[12],待錐形瓶冷卻后去掉密封的紗布,在瓶塞處涂抹凡士林,蓋上瓶塞,放入無菌操作箱浸泡煤粉2 h。浸泡后加入1 g FeCl2粉末,放入超聲波清洗器(KQ-300DE型)中加速溶解,溶解后接種[12]2 mL純化后的菌種。接種后以200～300 mL/min的流量通入高純氮(99.99%)置換培養(yǎng)基中的溶解氧(dissolved oxygen,DO),直到DO(AZ-8403溶氧儀)值小于0.2 mg/L后密封。密封時(shí)在瓶口處涂抹凡士林,保證良好的密封性,密封后放入培養(yǎng)箱(SKP-01B型)內(nèi)培養(yǎng)。

每天測(cè)量培養(yǎng)液的pH值(AZ8686pH筆)、氧化還原電位(oxidation-reduction potential,ORP)(CL200筆式ORP計(jì))和各離子質(zhì)量濃度(包括SO42-、硫化物、Cl-、Na+、K+、Ca2+、Mg2+)。由于測(cè)CO32-和HCO3-質(zhì)量濃度取樣量較大,所以只在第1天和第5天測(cè)量。pH值、ORP的測(cè)量和取樣過程均在有機(jī)玻璃真空手套箱中進(jìn)行以保證厭氧環(huán)境。

第5天將3組錐形瓶用漩渦混合器進(jìn)行震蕩,待固液混合均勻每瓶抽取50 mL溶液分裝到5個(gè)10 mL的離心管中,以5 000 r/min離心5 min(DM0412離心機(jī)),去清后取得固體沉淀。離心后每組取其中1管沉淀直接冷凍干燥[13]48 h(FD-1C-50冷凍干燥機(jī)),做X射線光電子能譜分析(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)(ESCALAB25型X射線光電子能譜儀,美國Thermo);再將1管沉淀冷凍干燥48 h,進(jìn)行掃描電子顯微鏡分析(scanning electron microscope,SEM)(SU8020場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本Hitachi);將剩余的3管沉淀固定、脫水、冷凍干燥[14-15]后進(jìn)行SEM分析。做SEM時(shí)固體樣品處理方法不同是因?yàn)閷?duì)細(xì)菌做掃描電鏡必須進(jìn)行固定、脫水。

離子成分定量分析:SO42-和Cl-質(zhì)量濃度用離子色譜法測(cè)量(IC6200型離子色譜儀);硫化物質(zhì)量濃度用亞甲基藍(lán)分光光度法測(cè)量[16-17];CO32-和HCO3-質(zhì)量濃度用鹽酸滴定法測(cè)量[18];陽離子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+)質(zhì)量濃度用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry,ICP-OES)(PQ900,德國耶拿)測(cè)量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果分析

將新采集的潘北礦礦井水和培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液冷藏保存寄往上海生物工程公司進(jìn)行高通量基因測(cè)序,從而確定細(xì)菌種屬并分類。

潘北礦礦井水細(xì)菌按門分類結(jié)果見表1所列,其中變形菌門細(xì)分到綱。

表1 細(xì)菌群落在門分類水平的細(xì)菌組成

提取DNA后,使用細(xì)菌的16S rRNA通用引物對(duì)所提取DNA進(jìn)行聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,擴(kuò)增區(qū)域?yàn)榧?xì)菌的V3—V4區(qū)。PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的通用引物。PCR結(jié)束后,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳,采用生工瓊脂糖回收試劑盒(cat:SK8131)對(duì)DNA進(jìn)行回收。利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量,利用Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行基因測(cè)序。經(jīng) PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序后,將獲得的基因序列在GenBank DNA 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST對(duì)比,確定細(xì)菌的種屬并分類[19-23]。

將實(shí)驗(yàn)第5天所采集菌樣的檢測(cè)結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST相似性檢測(cè),比對(duì)GenBankDNA序列數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行同源分析,選取一批與該菌株同源性高的菌株序列,應(yīng)用MEGA5.1軟件中的NJ法建立系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖1所示。

圖1 菌株S890和相關(guān)菌的基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

檢測(cè)結(jié)果表明,煤系地下水中細(xì)菌種類非常豐富,其中變形菌約占總數(shù)的87%。變形菌中α變形菌約占9%；β變形菌約占16.4%；γ變形菌約占19%；δ變形菌約占5.21%,ε變形菌約占37.39%。

其中δ變形菌中的Desulfovibrio屬于SRB類,約占細(xì)菌總數(shù)的4%。

分離提純培養(yǎng)后的S890的基因序列為:

GGGGAATATTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAAGGTCCTCGGATCGTA

AACCTCTGTCAGGAGGGAAGAACCGCCACGGTGCTAATCAGCCGTGGTCTGACGGTACCTCCAAAGGAAGCA

CCGGCTAACCCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATCACTGGGCGTAAA

GCGCACGTAGGCTGCTTGGTAAGTCAGGGGTGAAAGCCCGCGGCTCAACCGAGGAATTGCCTTTGATACTGC

CGAGCTAGAGTCCGGGAGA GGGTAGTGGAATTCCAGGTGTAGGAGTGAAATCCGTAGAGAGCTGGAGGAA

CATCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACCGGTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACA。

從基因發(fā)育樹可以看出,菌株S890與Desulfovibriopigro及Desulfovibriopiger序列的吻合度最高,因此S890應(yīng)屬于脫硫弧菌屬Desulfovibriosp.。

2.2 XPS結(jié)果分析

對(duì)第5天處理后的3組固體沉淀充分混合后進(jìn)行XPS分析,得到了針對(duì)S元素的S2p結(jié)合能-豐度關(guān)系譜圖。S元素的結(jié)合能-豐度譜圖用XPSPEAK4.1分峰軟件進(jìn)行分峰,分峰結(jié)果如圖3所示。圖3中FeS在161.2 eV處成峰;SO42-在168.5 eV處成峰[24-25]。從分峰結(jié)果可以看出S元素主要以FeS和SO42-形式存在,固體沉淀中FeS占優(yōu)。

圖2 S元素結(jié)合能-豐度譜圖

2.3 SEM結(jié)果分析

將第5天處理所得2類固體樣品噴金做掃描電鏡。掃描電鏡照片如圖3所示,圖3中，細(xì)菌大多為短弧狀,大小在(0.4～0.8 μm)×(1.5～2.0 μm),固體成分為絮狀膠體,未看到結(jié)晶。

圖3 掃描電鏡照片

2.4 離子成分變化結(jié)果分析

將每天所測(cè)離子成分繪制成Piper三線圖,如圖4所示。其中第2～4天的HCO3-和CO32-質(zhì)量濃度采用內(nèi)插法計(jì)算求得。從圖4可以看出在培養(yǎng)過程中Na++K+質(zhì)量濃度穩(wěn)定;Ca2+和Mg2+質(zhì)量濃度降低;Cl-質(zhì)量濃度較穩(wěn)定;HCO3-和CO32-質(zhì)量濃度升高;SO42-質(zhì)量濃度大幅降低。硫化物質(zhì)量濃度升高,多以沉淀形式存在,其質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化如圖5所示。

圖4 離子Piper三線圖

圖5 硫化物質(zhì)量濃度隨時(shí)間的變化

2.5 pH值和ORP結(jié)果分析

在整個(gè)培養(yǎng)過程中每天測(cè)量pH值和ORP,測(cè)量結(jié)果繪制成折線圖,如圖6所示。從圖6可以看出,整個(gè)過程pH值升高,最高可達(dá)8.9;ORP降低,最低達(dá)到了-460 mV。

圖6 pH值、ORP隨時(shí)間變化曲線

3 結(jié)果討論

硫酸鹽還原細(xì)菌(SRB)是一類形象和營養(yǎng)多樣化、利用硫酸鹽作為有機(jī)物異化作用電子受體的兼性厭氧微生物。SRB會(huì)將硫酸鹽還原為硫化物,并產(chǎn)生CO2和OH-。反應(yīng)過程[26-27]如圖7所示。

圖7 硫酸鹽還原反應(yīng)過程

這個(gè)過程是在厭氧條件下強(qiáng)酸鹽變?yōu)榱巳跛猁},并產(chǎn)生了OH-,所以培養(yǎng)基pH值升高。細(xì)菌在分解代謝過程中消耗了SO42-和碳源,生成了S2-和CO2。

培養(yǎng)基pH值升高,會(huì)破壞水中的碳酸平衡,當(dāng)pH>8.34時(shí)HCO3-會(huì)轉(zhuǎn)化為CO32-,水中的Ca2+和Mg2+會(huì)使之沉淀,導(dǎo)致Ca2+、Mg2+、CO32-、HCO3-質(zhì)量濃度降低。由于細(xì)菌的分解代謝作用,將碳源分解生成了CO2,且生成量遠(yuǎn)多余于CO32-、HCO3-的沉淀量,所以最后溶液中CO32-、HCO3-質(zhì)量濃度升高。細(xì)菌代謝消耗了SO42-,產(chǎn)生的CO32-、HCO3-和S2-會(huì)被Ca2+、Mg2+和重金屬離子沉淀,所以總礦化度降低。Ca2+、Mg2+質(zhì)量濃度降低使水的硬度降低。

脫硫酸作用的還原產(chǎn)物主要以FeS形式存在,在40 ℃時(shí)FeS在pH值為 6.5～12.5,Eh(ORP)為-300～-700 mV時(shí)穩(wěn)定,如圖8所示[28-32]。

圖8 40 ℃時(shí)Fe-S系統(tǒng)Eh-pH圖

將所得結(jié)果與礦井地下水水質(zhì)資料結(jié)合分析可知:封閉性較好的煤系地層,地下水處于還原環(huán)境,有利于SRB生存,這些礦井一般SO42-質(zhì)量濃度較低,CO32-、HCO3-質(zhì)量濃度相對(duì)較高,Ca2+、Mg2+質(zhì)量濃度相對(duì)較低;封閉條件較差的礦井,地下水還原環(huán)境不好,不利于SRB生存,這些礦井一般SO42-質(zhì)量濃度較高,CO32-、HCO3-質(zhì)量濃度相對(duì)較低,Ca2+、Mg2+質(zhì)量濃度相對(duì)較高。地下水水質(zhì)資料見表2所列[1]。

表2 各礦井地下水水質(zhì)情況 mg/m3

4 結(jié) 論

基因檢測(cè)結(jié)果表明，還原環(huán)境較好的潘北煤礦煤系地下水中細(xì)菌種類豐富,存在硫酸鹽還原菌。硫酸鹽還原菌能利用煤粉浸出液作為碳源,利用礦井水作為反應(yīng)底物,且作用后會(huì)使環(huán)境的氧化還原電位降低,形成還原環(huán)境。

在硫酸鹽還原菌作用下煤系地下水的水質(zhì)發(fā)生變化:pH值升高,SO42-、Ca2+及Mg2+質(zhì)量濃度降低,CO32-、HCO3-質(zhì)量濃度升高,總礦化度降低,硬度降低。

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(責(zé)任編輯 張淑艷)

Effect of sulfate-reducing bacteria on groundwater quality in coal measures

LIU Shuo,GE Xiaoguang,QI Chun,ZHAO Guangxiu

(School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

In the coal mine of Huang-Huai Plain in China, the groundwater salinity of underground mine is mostly at 2-4 g/L, and the advantage ion is SO42-generally. But the content of SO42-at some water filling formations is very low. There are sulfate-reducing bacteria(SRB) in the groundwater of Panbei coal mine with low content of SO42-. Desulfurization can occur under the action of SRB. In this paper, it was found that SRB could use coal as carbon source to change the groundwater quality. After the desulfurization, the pH value increased, the salinity, water hardness and the content of SO42-, Ca2+and Mg2+decreased, the content of CO32-and HCO3-increased, and the content of Cl-, Na+and K+was unchanged.

sulfate-reducing bacteria(SRB); sulfate; desulfurization; groundwater; water quality

2015-06-10；

2015-07-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41172216)

劉 碩(1989-),女,河北保定人,合肥工業(yè)大學(xué)碩士生;

葛曉光(1956-),男,安徽淮南人,博士,合肥工業(yè)大學(xué)教授,碩士生導(dǎo)師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2016.10.021

P641.11

A

1003-5060(2016)10-1401-06