葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化及Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的影響

王曉暉，羅向霞，史曉偉，張定華

甘肅省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730050

葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化及Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的影響

王曉暉，羅向霞，史曉偉，張定華

甘肅省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730050

目的：探討葛根素（Pue）對(duì)高糖培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖、分化及Ⅰ型膠原mRNA（CollⅠmRNA）表達(dá)的影響，為臨床治療糖尿病骨質(zhì)疏松癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：取出生24 h內(nèi)的SD大鼠的顱骨，體外分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞，待細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞，隨機(jī)分為正常組、高糖組（葡萄糖濃度22 mmol/L）、葛根素各濃度組（葛根素濃度分別為10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）、高糖加葛根素各濃度組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)48 h，隔天換液并加藥。測(cè)定成骨細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞內(nèi)ALP活性以及CollⅠmRNA表達(dá)情況。結(jié)果：與正常組比較，葛根素各濃度組細(xì)胞增殖、細(xì)胞ALP活性、細(xì)胞CollⅠmRNA表達(dá)均顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；高糖組、高糖+葛根素各濃度組明顯低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與高糖組比較，高糖+葛根素各濃度組細(xì)胞增殖、細(xì)胞ALP活性、細(xì)胞CollⅠmRNA表達(dá)均顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論：高糖情況下抑制成骨細(xì)胞的增殖、分化和Ⅰ型膠原表達(dá)，但加入葛根素后能提高成骨細(xì)胞的增殖、分化和Ⅰ型膠原表達(dá)，說(shuō)明葛根素對(duì)糖尿病骨質(zhì)疏松癥有治療作用。

葛根素；成骨細(xì)胞；增殖；分化；Ⅰ型膠原；新生SD大鼠；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

目前全世界大約有2億人患骨質(zhì)疏松癥，在繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中，內(nèi)分泌性骨質(zhì)疏松癥是重要的類(lèi)型[1]。糖尿病性骨質(zhì) 疏 松 癥 (Diabeticosteoporosis， DOP)是 指 糖 尿 病(diabetesmellitus，DM)患者并發(fā)骨量減少和骨組織的顯微結(jié)構(gòu)遭到破壞，骨脆性增加，容易發(fā)生骨折的一種全身代謝性骨病，是DM發(fā)生在骨骼系統(tǒng)的慢性并發(fā)癥[2]，目前尚無(wú)有效治療方案。研究發(fā)現(xiàn)，葛根中含有多種異黃酮成分，包括葛根素(Puerarin，Pue)、大豆苷和大豆黃酮等，這些成分有明顯的降糖、降脂作用[3]，同時(shí)改善患者骨質(zhì)代謝，對(duì)于骨質(zhì)疏松有明顯的防治作用。臨床觀察表明葛根素可明顯減輕糖尿病骨質(zhì)疏松癥狀[4]，但其治療制未明。為此，本研究擬通過(guò)培養(yǎng)成骨細(xì)胞，添加不同濃度葛根素，觀察其對(duì)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞的增殖、分化及Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的影響，研究其可能的作用機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生24 h的SD大鼠10只(甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，合格證編號(hào)：2014315)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，超凈工作臺(tái)(中國(guó)杭州凈化設(shè)備廠)，GeneAmp全自動(dòng)PCR儀(美國(guó)ABI公司)，酶標(biāo)儀(日本Bio-RAD Model 550)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板(美國(guó)Costar公司)，紫外分光光度儀(上海天美儀器公司)，CK-40型OLYMPUS倒置光相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑葛根素(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，MEM干粉培養(yǎng)基(GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(上海華美公司)，四甲基偶氮唑鹽(美國(guó)Sigma公司)，對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽(南京建成生物工程研究所)，PCR引物(大連寶生物生物工程有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(大連寶生物生物工程有限公司兩步法試劑盒DRR014A)，RNA提取試劑盒RNAiso Reagent(大連寶生物生物工程有限公司兩步法試劑盒D312)。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1成骨細(xì)胞的培養(yǎng)取出生24 h內(nèi)的SD大鼠的顱骨，徹底剝離骨膜等軟組織，置入含DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，修剪成1～3 mm3大小的骨片，加入胰酶在37℃環(huán)境下振蕩消化2～3 min，再加入等體積的含15%胎牛血清DMEM終止消化。吹打細(xì)胞，收集消化液，在4℃，1000 r/min條件下離心10 min使細(xì)胞沉淀。沉淀細(xì)胞放置于含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)的培養(yǎng)皿內(nèi)，并以約5×104/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3天換液1次。

2.2形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)48 h后將貼壁細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，然后PBS洗滌3次，常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)按比例配制BCIP/NBT染色工作液，48孔板每孔加100 μL上述BCIP/NBT染色液，室溫避光孵育5～30 min，直至顯色至預(yù)期深淺，去除工作液，用蒸餾水洗滌終止顯色。在倒置顯微鏡下，計(jì)數(shù)每孔成骨細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)，并計(jì)數(shù)細(xì)胞ALP染色陽(yáng)性率。

2.3細(xì)胞的分組及給藥待細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞，每孔200 uL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。隨機(jī)分為正常組、高糖組(葡萄糖濃度22 mmol/L)、葛根素各濃度組(葛根素濃度分別為10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)、高糖加葛根素各濃度組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)48 h，隔天換液并加藥。

2.4MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖能力細(xì)胞傳至第1代用0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA消化計(jì)數(shù)后，用含10%小牛血清MEM培養(yǎng)基以2×103/孔密度接種于96孔板內(nèi)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后鏡下觀察細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，去掉上清液進(jìn)行細(xì)胞分組及給藥72 h后，用MTT法分析細(xì)胞增殖情況，結(jié)果以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處讀取酶活性測(cè)得OD值表示。

2.5PNPP法檢測(cè)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）活性細(xì)胞的培養(yǎng)及給藥方法同2.4，給藥結(jié)束后，用對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉(PNPP)法分析細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性情況，結(jié)果以酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)處讀取酶活性測(cè)得OD值表示。

2.6RT-PCR方法檢測(cè)成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA（CollⅠmRNA） 的表達(dá)細(xì)胞傳至第1代用0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA消化計(jì)數(shù)后，用含10%小牛血清MEM培養(yǎng)基以5×104/孔密度以每瓶5 mL加入100 mL培養(yǎng)瓶，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后鏡下觀察細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后再培養(yǎng)10天，去掉上清液，加入Trizol試劑提取總RNA，37℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min，85℃反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)5 s，后4℃1 h，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)CollⅠmRNA的相對(duì)表達(dá)量。CollⅠmRNA的引物徐序列：上游引物TACAGCACGCTT GTGGATG，下游引物TTGGGATGGAGGGAGTTTA，片段大小為320 bp。內(nèi)參基因GAPDH引物是：上游TGAACGG GAAGCTCACTGG，下游TCCACCACCCTGTTGCTGTA，片段大小為200 bp。RT-PCR的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10s；94℃變性5 s，退火30 s，共40循環(huán)；溶解曲線94℃60 s，57.6℃30 s，94℃30 s，1個(gè)循環(huán)。經(jīng) 1.7%瓊脂糖凝膠電泳分離。分離產(chǎn)物用YLN-2000凝膠成像分析系統(tǒng)分析吸光度，以GAPDH作內(nèi)參，以目的基因吸光度比內(nèi)參基因吸光度代表目的基因的相對(duì)含量。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析，定量資料用(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3　結(jié)果

3.1成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定見(jiàn)圖1和圖2。倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)第3天的大鼠成骨細(xì)胞呈三角形、多邊形、長(zhǎng)梭形，胞漿豐富，胞核較圓，輪廓清晰。ALP定性染色對(duì)其進(jìn)行鑒定，可見(jiàn)成骨細(xì)胞胞漿藍(lán)染，呈陽(yáng)性。

3.2各組成骨細(xì)胞增殖結(jié)果比較見(jiàn)表1。與正常組比較，葛根素各濃度組OD值均顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；高糖組、高糖+葛根素各濃度組明顯低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。與高糖組比較，高糖+葛根素各濃度組OD值均顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

圖1　成骨細(xì)胞形態(tài) (40×)

圖2　ALP化學(xué)染色 (40×)

表1　各組成骨細(xì)胞增殖結(jié)果比較(±s，n=8)

表1　各組成骨細(xì)胞增殖結(jié)果比較(±s，n=8)

與正常組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與高糖組比較，③P＜0.05，④P＜0.01

組別正常組高糖組葛根素各濃度組濃度(mol/L)高糖+葛根素各濃度組10-810-710-610-810-710-6O D值0.561±0.063 0.245±0.018②0.745±0.085②④0.737±0.030②④0.735±0.016②④0.442±0.025①④0.436±0.036①③0.429±0.045①③

3.3各組成骨細(xì)胞ALP活性結(jié)果比較見(jiàn)表2。與正常組比較，葛根素各濃度組細(xì)胞ALP活性顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)；高糖組、高糖+葛根素各濃度組細(xì)胞ALP活性明顯低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。與高糖組比較，高糖+葛根素各濃度組細(xì)胞ALP活性均顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

3.4各組成骨細(xì)胞CollⅠmRNA表達(dá)結(jié)果比較見(jiàn)表3。與正常組比較，葛根素各濃度組細(xì)胞CollⅠmRNA表達(dá)顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)；高糖組、高糖+葛根素各濃度組細(xì)胞CollⅠmRNA表達(dá)明顯低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。與高糖組比較，高糖+葛根素各濃度組細(xì)胞CollⅠmRNA表達(dá)均顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表2　各組成骨細(xì)胞ALP活性結(jié)果比較(±s，n=8)

表2　各組成骨細(xì)胞ALP活性結(jié)果比較(±s，n=8)

與正常組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與高糖組比較，③P＜0.05，④P＜0.01

組別正常組高糖組葛根素各濃度組濃度(mol/L)高糖+葛根素各濃度組10-810-710-610-810-710-6O D值1.091±0.041 0.54±0.023②1.378±0.026②④1.308±0.026①④1.268±0.030①④0.665±0.023①④0.609±0.014①③0.621±0.022①③

表3　各組成骨細(xì)胞CollⅠmRNA表達(dá)結(jié)果比較(±s，n=8)

表3　各組成骨細(xì)胞CollⅠmRNA表達(dá)結(jié)果比較(±s，n=8)

與正常組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與高糖組比較，③P＜0.05，④P＜0.01

組別正常組高糖組葛根素各濃度組濃度(mol/L)高糖+葛根素各濃度組10-810-710-610-810-710-6O D值0.801±0.043 0.453±0.032②1.154±0.024②④0.958±0.036①④0.864±0.010①④0.625±0.023①④0.529±0.024①③0.516±0.022①③

4　討論

隨著老齡化程度的加劇、飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣的改變，DM發(fā)病率及檢出率日趨增高，預(yù)計(jì)2025年全球DM發(fā)病人數(shù)將超過(guò)3億，我國(guó)將達(dá)3800萬(wàn)[5]。DM作為一種代謝性疾病，嚴(yán)重影響骨代謝和骨改建，造成骨喪失，是骨質(zhì)疏松癥的重要原因之一。DOP作為DM的慢性并發(fā)癥之一，是一種以骨量減少、骨質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，骨脆性增加，易于發(fā)生骨折的全身性骨骼疾病。研究發(fā)現(xiàn)[6]，DM患者骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率為50%左右，并且隨著年齡增加、胰島功能衰竭，合并DOP的危險(xiǎn)性也隨之增加?，F(xiàn)如今，DOP因其高發(fā)病率、致殘率和致死率日益受到醫(yī)學(xué)界的重視。大量研究表明，DOP除與性別、年齡、病程等因素有關(guān)外，與患者胰島素不足、胰島素生長(zhǎng)因子-1缺乏、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)積累等因素有關(guān)[7]。

研究表明葛根素是中藥葛根的主要成分之一，它有類(lèi)似于雌激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。近些年葛根素的研究證實(shí)其可以作為防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的藥物，起到雌激素樣效應(yīng)，而且毒副作用相對(duì)較小[8]。葛根素具有擴(kuò)張心腦血管、增加心腦血流量、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗氧化、清除自由基和抑制缺血再灌注損傷等作用，具有活血化瘀的功效，在糖尿病的臨床治療中有一定的應(yīng)用[9]。本研究表明，葛根素能明顯改善高糖培養(yǎng)下成骨細(xì)胞的增殖和分化，增加ALP活性，促進(jìn)CollⅠmRNA的表達(dá)，減輕高糖環(huán)境對(duì)骨組織代謝及成骨細(xì)胞增殖分化的損傷，起到保護(hù)作用。

綜上所述，本研究表明高血糖狀態(tài)下，破骨/成骨活性的平衡被破壞，導(dǎo)致糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)生，而葛根素的有效活性成分異黃酮可恢復(fù)上述平衡，維持正常骨量和骨的生物學(xué)質(zhì)量，隨著現(xiàn)代醫(yī)藥科學(xué)研究的不斷深入，以葛根為原料的植物雌激素成為研發(fā)治療糖尿病性骨質(zhì)疏松癥新藥更好的選擇。

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Effect of Puerarin on Proliferation and Differentiation of Osteoblastic Cells and Expression of Type I Collagen mRNA

WANG Xiaohui，LUO Xiangxia，SHI Xiaowei，ZHANG Dinghua

Objective：To discuss the effect of puerarin on proliferation and differentiation of osteoblastic c ells cultured in high glucose and the expression of type I collagen mRNA，and provide experimental basis for the clinical treatment of diabetes and osteoporosis.Methods：Cranium of newborn SD rats within 24 hours was obtained，isolated and cultured in virto until becoming osteoblasts cells.When the forms of cells became stable，osteoblasts cells in exponential growth period were selected and divided into normal glucose group，high glucose group(22 mmol/L glucose)，the puerarin of different concentrations group(concentrations of puerarin being respectively 10-8mol/L，10-7mol/L，10-6mol/L)and high glucose combined with puerarin of different concentrations group.For each group，8 parallel holes were designed and all groups were cultured for 48 hours，adding medicine to each group after medium change the next day.Measured the ability of proliferation of osteoblastic cells，activity of alkaline phosphate(ALP)in cells and expression of Coll I mRNA.Results：Comparing with normal glucose group，OD level，activity of ALP in cells as well as expression of Coll I mRNA of the puerarin of different concentrations group were increased obviously(P＜0.05，P＜0.01)，and those of high glucose group and high glucose combined with puerarin of different concentrations group were significantly lower than those of normal glucose group(P＜0.05，P＜0.01).Comparing with high glucose group，OD level，activity of ALP in cells and expression of Coll I mRNA in cells of high glucose combined with puerarin of different concentrations group were all raised obviously，displaying significant difference (P＜0.05，P＜0.01).Conclusion：Under the condition of high glucose，the proliferation and differentiation of osteoblastic cells and expression of type I collagen mRNA will be inhibited，but after adding with puerarin，the efficacy can be improved，which suggests that purearin has therapeutic effect on diabetes and osteoporosis.

Puerarin；Osteoblastic cells；Proliferation；Differentiation；Type I collagen；Newborn SD rats；Cell culture

R285

A

0256-7415（2016）11-0221-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.11.094

2016-06-12

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1308RJZA136）

王曉暉（1970-），女，副主任醫(yī)師，研究方向：內(nèi)分泌及代謝性疾病。