高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定丹參中6種化學(xué)成分的含量

程茜菲

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，咸陽(yáng) 712046)

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·中藥及天然藥物·

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定丹參中6種化學(xué)成分的含量

程茜菲

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，咸陽(yáng) 712046)

目的 建立高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定丹參中迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量的方法。方法 采用Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以甲酸水和乙腈進(jìn)行梯度洗脫；柱溫30 ℃；流速1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。結(jié)果 迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的線性范圍分別為：0.336～3.36 μg(r=0.999 9)，4.772～47.72 μg(r=0.999 8)，0.019 3～0.192 8 μg(r=0.999 8)，0.072～0.72 μg(r=0.999 7)，0.077 2～0.772(r=0.999 8)和0.174 4～1.744 μg(r=0.999 9)；平均加樣回收率分別為：100.2%，100.4%，98.6%，100.0%，99.3%和99.1%，RSD值分別為1.58%，1.25%，1.09%，1.21%，1.10%和1.06%。結(jié)論 該法同時(shí)測(cè)定了丹參中迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA6種化學(xué)成分的含量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

丹參；迷迭香酸；丹酚酸B；二氫丹參酮Ⅰ；隱丹參酮；丹參酮Ⅰ；丹參酮ⅡA；高效液相色譜法

A.stract:Objective To establish a method for the simultaneous determination of rosmarinic acid，salvianolic acid B，dihydrotanshinone Ⅰ，clyptotanshinon，tanshinoneⅠand tanshinone ⅡA in RadixSalviaemiltiorrhiza. Methods The chromatograhic separation was performed on Thermo C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm)； the column temperature was maintained at 30 ℃；the separation was achieved by a linear gradient elution;the moblie phase was a mixture of solvent A(acetonitrile) and solvent B(formic acid aqueous).The flow rate was 1 mL·min-1；the UV detection wavelength was 270 nm. Result Rosmarinic acid，salvianolic acid B，dihydro-tanshinone Ⅰ，clyptotanshinon，tanshinoneⅠand tanshinone ⅡA showed good linearity in the ranges of 0.336-3.36 μg(r=0.999 9)，and 4.772-47.72 μg(r=0.999 8)，0.019 3-0.192 8 μg(r=0.999 8)，0.072-0.72 μg(r=0.999 7)，0.077 2-0.772 μg(r=0.999 8)，and 0.174 4-1.744 μg(r=0.999 9)，respectively.The average recoveries were 100.2%(1.58%)，100.4%(1.25%)，98.6%(1.09%)，100.0%(1.21%)，99.3%(1.10%)，and 99.1%(1.06%)，respectively.Conclusion The present method is simple and has satisfactory efficacy；it could be used for simultaneously determing rosmarinic acid，salvianolic acid B，dihydrotanshinoneⅠ，clyptotanshinon，tanshinoneⅠand tanshinone ⅡA components inSalviamiltiorrhiza.

丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功效[1]。丹參中主要含有水溶性的酚酸類和脂溶性的二萜醌類化學(xué)成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參中的酚酸類和二萜醌類成分均具有顯著的生理活性[2-4]。本文中水溶性成分迷迭香酸[5]、丹酚酸B[6]和脂溶性成分隱丹參酮[7]、二氫丹參酮Ⅰ[8]、丹參酮Ⅰ[9]、丹參酮ⅡA[10-11]經(jīng)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)藥理活性較好，由于《中國(guó)藥典》(2010年版)中以丹酚酸B和丹參酮ⅡA2個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)丹參質(zhì)量的優(yōu)劣，有一定的片面性，因此以多個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)丹參質(zhì)量?jī)?yōu)劣更有說(shuō)服力。本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫法，建立了同時(shí)測(cè)定丹參中迷迭香酸、丹酚酸B、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA等6種化學(xué)成分的方法，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為丹參藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695-2996高效液相色譜儀(美國(guó)沃特斯公司)；Empower色譜工作站；FA1104B電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；KQ-500DB超聲波清洗機(jī)(上海越眾儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 迷迭香酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111871-201404)；丹酚酸B(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111562-201514)；二氫丹參酮Ⅰ(寶雞市辰光生物科技有限公司，批號(hào)20121209)；隱丹參酮(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110852-200806)；丹參酮Ⅰ(寶雞市辰光生物科技有限公司，批號(hào)20121007)；丹參酮ⅡA(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110766-201520)。丹參藥材分別產(chǎn)自四川(DS1，購(gòu)自四川)和河南(DS2，購(gòu)自鄭州；DS3，購(gòu)自西安)，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室鑒定為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)的干燥根及根莖。乙腈為色譜純(Fisher公司)；水為娃哈哈純凈水；甲酸(西安鑫寶佳業(yè)化工有限公司，分析純)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為甲酸水(0.4 mL·L-1)，梯度洗脫：0～15 min：10%～25%A；15～25 min：25%～26%A；25～40 min：26%～43%A；40～60 min：43%～74%A；60～65 min：74%～84%A；65～70 min：84%～85%。流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；進(jìn)樣量為10 μL；供試品溶液和混合對(duì)照品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖

A.供試品溶液；B.混合對(duì)照品；1.迷迭香酸；2.丹酚酸B；3.二氫丹參酮Ⅰ；4.隱丹參酮；5.丹參酮Ⅰ；6.丹參酮ⅡA

Fig.1 HPLC chromatograms

A.sample；B.control；1.rosmarinic acid；2.salvianolic acid B；3.dihydro tanshinone Ⅰ；4.cryptotanshinone；5.tanshinone Ⅰ；6.tanshinone ⅡA

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)照品迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA適量，精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，使其完全溶解，分別制得對(duì)照品溶液。分別精密吸取各溶液適量，加體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，稀釋至1 mL含迷迭香酸168 μg、丹酚酸B 2 386 μg、二氫丹參酮Ⅰ9.64 μg、隱丹參酮36 μg、丹參酮Ⅰ38.6 μg、丹參酮ⅡA 87.2 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末0.5 g，精密稱定，置于25 mL具塞錐形瓶中，精密加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，稱定質(zhì)量，超聲提取45 min，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性范圍考察 將混合對(duì)照品溶液分別精密吸取2，4，8，10，15和20 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。橫坐標(biāo)(X)為進(jìn)樣量，縱坐標(biāo)(Y)為峰面積，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。迷迭香酸：Y=1 000 000X+1 003.3，r=0.999 9，在0.336～3.36 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；丹酚酸B：Y=787 522X-10 672，r=0.999 8，在4.772～47.72 g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；二氫丹參酮 Ⅰ：Y=3 000 000X-1 278.8，r=0.999 8，在0.019 3～0.192 8 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；隱丹參酮:Y=5 000 000X-4 700.8，r=0.999 7，在0.072～0.72 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；丹參酮 Ⅰ：Y=2 000 000X-11 182，r=0.999 8，在0.077 2～0.772范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；丹參酮ⅡA：Y=5 000 000X+591.44，r=0.999 9，在0.174 4～1.744 μg范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 吸取混合對(duì)照品溶液適量，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA6個(gè)對(duì)照品峰面積的RSD值分別為0.96%，0.39%，0.85%，0.50%，0.43%和0.30%，結(jié)果表明，該系統(tǒng)精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取樣品溶液(四川產(chǎn)丹參)，在0，2，4，8，12和24 h，按照2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得6個(gè)對(duì)照品峰面積的RSD值分別為1.01%(迷迭香酸)，1.55%(丹酚酸B)，0.76%(二氫丹參酮Ⅰ)，1.22%(隱丹參酮)，0.69%(丹參酮Ⅰ)和0.41%(丹參酮ⅡA)，結(jié)果表明，該溶液24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取樣品粉末(四川產(chǎn)丹參)0.5 g，精密稱定6份，按照2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得樣品中6種化學(xué)成分含量的RSD值分別為1.26%(迷迭香酸)，1.36%(丹酚酸B)，0.80%(二氫丹參酮Ⅰ)，0.73%(隱丹參酮)，0.53%(丹參酮Ⅰ)和0.67%(丹參酮ⅡA)，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取樣品粉末(DS1，已知含量)0.5 g，精密稱定6份，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，再分別加入適量迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA對(duì)照品，精密加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，按照2.3項(xiàng)下方法制備溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果測(cè)得迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA回收率分別為100.2%(RSD值為1.58%)，100.4%(RSD值為1.25%)，98.6%(RSD值為1.09%)，100.0%(RSD值為1.21%)，99.3%(RSD值為1.10%)和99.1%(RSD值為1.06%)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test

成分稱樣量/g樣品含量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%迷迭香酸0.50121.002400.841.85248101.2100.201.580.50411.008200.841.8381298.80.50221.004400.841.86036101.90.50341.006800.841.8434499.60.50261.005200.841.8292498.10.50161.003200.841.85664101.6丹酚酸B0.501225.9600023.5849.68148100.6100.41.250.504126.1100023.5849.3598898.60.502226.0100023.5849.87296101.20.503426.0800023.5849.4713699.20.502626.0300023.5849.72790100.50.501625.9800023.5850.03160102.0二氫丹參酮Ⅰ0.50120.100240.110.2072797.398.61.090.50410.100820.110.21104100.20.50220.100440.110.2085798.30.50340.100680.110.2101399.50.50260.100520.110.2082197.90.50160.100320.110.2084598.3隱丹參酮0.50120.200480.200.40328101.4100.01.210.50410.201640.200.4006499.50.50220.200880.200.3976898.40.50340.201360.200.3995699.10.50260.201040.200.40244100.70.50160.200640.200.40284101.1丹參酮Ⅰ0.50120.150360.690.8320898.899.31.100.50410.151230.690.85020101.30.50220.150660.690.8296298.40.50340.151020.690.8389599.70.50260.150780.690.8304398.50.50160.150480.690.8328998.9丹參酮ⅡA0.50120.501200.430.9269099.099.11.060.50410.504100.430.9250797.90.50220.502200.430.9240398.10.50340.503400.430.9303999.30.50260.502600.430.93604100.80.50160.501600.430.9290299.4

2.9 樣品含量測(cè)定 取不同批號(hào)丹參藥材粉末0.5 g，精密稱定，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6種化合物的含量測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Determination results of 6 compounds

樣品編號(hào)迷迭香酸/%丹酚酸B/%二氫丹參酮Ⅰ/%丹參酮Ⅰ/%隱丹參酮/%丹參酮ⅡA/%DS10.205.180.020.030.040.10DS20.294.050.060.060.050.11DS30.284.460.030.070.030.08

3 討論

3.1 提取條件的選擇 對(duì)樣品的制備方法進(jìn)行分析，先對(duì)不同溶劑、相同溶劑不同體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行考察選取提取溶劑，再對(duì)提取方法、提取時(shí)間進(jìn)行研究，最終確定制備方法為用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇超聲提取45 min。

3.2 流動(dòng)相的選擇 分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水和乙腈-磷酸水等溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相，最終采用乙腈-甲酸水溶劑系統(tǒng)洗脫，丹參藥材中6種化學(xué)成分具有良好的分離效果和較好的峰形。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別對(duì)6種成分進(jìn)行紫外掃描，確定其最大吸收波長(zhǎng)；對(duì)混合對(duì)照品溶液和樣品采用DAD檢測(cè)器進(jìn)行190～400 nm的全波長(zhǎng)掃描，由于6種化學(xué)成分的最大吸收波長(zhǎng)不同，綜合考慮，在270 nm處，各成分均有較大吸收、峰形好，因此選擇270 nm為供試品溶液的檢測(cè)波長(zhǎng)。

經(jīng)方法學(xué)研究結(jié)果表明，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定丹參中迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA6種化學(xué)成分的含量，具有良好的精密度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性，簡(jiǎn)便易行，可為丹參藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

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Simultaneous determination of six components in Radix Salvia miltiorrhiza by HPLC

CHENG Qianfei

(Shaanxi Institute of International Trade & Commerce，Xianyang 712046，China)

RadixSalviamiltiorrhiza；rosmarinic acid；salvianolic acid B；dihydrotanshinoneⅠ； clyptotanshinon；tanshinoneⅠ；tanshinoneⅡA；HPLC

陜西省中醫(yī)管理局中醫(yī)藥科研課題項(xiàng)目(編號(hào)：ZY10)

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.001

R927.2

A

1004-2407(2016)06-0551-04

2016-03-21)