NF-κB通路對牙齦間充質(zhì)干細胞分泌炎性因子能力影響的研究

張洋，劉杰，石海剛，李曉光，張維，劉娜，徐璐璐

·論著·

NF-κB通路對牙齦間充質(zhì)干細胞分泌炎性因子能力影響的研究

張洋，劉杰，石海剛，李曉光，張維，劉娜，徐璐璐

目的探討炎癥作用下NF-κB通路對人牙齦間充質(zhì)干細胞（GMSCs）分泌炎性因子能力的影響。方法體外分離純化培養(yǎng)正常組織來源的GMSCs。在相同培養(yǎng)條件下，GMSCs被分成3組。應(yīng)用梯度濃度TNF-α（0、10、20 ng/ml）誘導(dǎo)12 h。Annexin V-FITC/PI雙染檢測3組間GMSCs凋亡率差異。應(yīng)用Western blot檢測NLK、I-κBα、P-IκBα在NF-κB激活通路中的表達，Real-Time PCR檢測TNF-α、IL-1β在GMSCs加入抑制劑BAY 11-7082后基因表達變化。結(jié)果凋亡檢測顯示，GMSCs凋亡率與TNF-α濃度呈正相關(guān)（P＜0.05）；Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，NLK、I-κBα表達隨TNF-α濃度增加而降低（P＜0.05），而P-IκBα表達量呈顯著增高趨勢（P＜0.01）。PCR檢測結(jié)果顯示，隨外源性TNF-α濃度升高，10 ng/ml組與20 ng/ml組GMSCs的TNF-α與IL-1β基因表達量也顯著升高（P＜0.01）。TNF-α誘導(dǎo)組加入NF-κB抑制劑BAY 11-7082后檢測GMSCs，10 ng/ml組與20 ng/ml組IL-1β與TNF-α基因表達量下降，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論GMSCs中NLK在炎性環(huán)境下表達量降低，炎性因子可以通過NF-κB通路增強牙齦間充質(zhì)干細胞中TNF-α和IL-1β的表達。

腫瘤壞死因子-α；牙齦間充質(zhì)干細胞；炎癥；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

牙齦炎是口腔最常見的疾病，常常表現(xiàn)為牙齦出血、紅腫。而在牙齦炎癥反應(yīng)中，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與牙周組織疾病密切相關(guān)［1］，是牙齦炎癥與免疫反應(yīng)中重要的細胞因子［2-3］。TNF-α可以激活NF-κB信號通路，前期研究已經(jīng)證實使用脂多糖（LPS）體外刺激牙周膜細胞可以分泌產(chǎn)生炎性因子［4］，但通過調(diào)控NF-κB通路能否抑制牙齦間充質(zhì)干細胞（GMSCs）TNF-α和IL-1β的分泌，進而改善牙齦炎癥狀態(tài)尚無研究。NLK是NF-κB負向調(diào)節(jié)因子，與NF-κB活性有密切關(guān)系。本研究主要通過研究GMSCs的NF-κB通路激活后分泌炎性因子TNF-α、IL-1β的表達，探討炎癥作用下NF-κB通路對牙齦間充質(zhì)干細胞分泌炎性因子能力影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例收集樣本均來源于2014～2015年解放軍總醫(yī)院就診患者，正常牙齦組織GMSCs來源于20～25歲拔除阻生齒需切除的無炎癥齦瓣。本課題選取的所有患者均排除家族遺傳病史、慢性感染性疾病史、全身系統(tǒng)性疾病、特殊藥物服用史及吸煙史，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，每位患者均簽署了知情同意書。

1.1.2 主要材料與儀器L-DMEM培養(yǎng)基（美國Gibico公司），胎牛血清（美國Gibico公司），PBS（美國Gibico公司），GAPDH引物（深圳華大基因公司），Anti-β-actin、羊抗兔IgG（美國Abcam公司），PrimeScriptTM實時定量多聚酶鏈反應(yīng)試劑盒、Premix Ex TaqTM試劑盒（日本Takara公司）；細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（美國Corning公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國ThermoForma公司），超凈工作臺（北京長城空氣凈化設(shè)備工程公司），Centrifuge 5810R低溫離心機（德國Eppendorf公司），流式細胞儀（美國Beckman-Coulter公司），Bio-Rad IQ5 Real-Time PCR檢測系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），全自動生化分析儀（日本Hitachi公司）。

1.2 方法

1.2.1 GMSCs分離培養(yǎng)純化選取拔除第三磨牙、經(jīng)患者同意剪取的牙齦齦瓣進行GMSCs細胞的原代培養(yǎng)［4］。將剪下的牙齦組織用剪剪碎，0.5%胰酶消化，PBS液體反復(fù)沖洗3～4次，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化30 min，收集至離心管中，將組織接種于小皿中，置蓋玻片，加10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞生長達80%匯合時可消化傳代，低密度接種法進行純化。

1.2.2 GMSCs凋亡檢測用不同濃度的TNF-α（分別為0、10、20 ng/ml）處理P3代GMSCs，每組誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。調(diào)整細胞數(shù)為1×106/ml，1000 r/min離心5 min，棄上清液；PBS洗1次，1000 r/min離心5 min；室溫下100 μl標記溶液吹懸細胞，避光孵育10～15 min；500～1000 r/min離心5 min，PBS洗1次；避光加入熒光（FITC/PI）溶液，4℃孵育20 min，并不時振動；流式細胞儀分析，激發(fā)光波長488 nm，分別用波長為515 nm和560 nm濾器檢測FITC/PI熒光。

1.2.3 Real Time PCR檢測采用PrimeScriptTMRT-PCRKit試劑盒合成cDNA，引物見表1，定量PCR采用Takara公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，各組體系配置完成后，應(yīng)用Bio-Rad IQ5熒光檢測儀進行檢測。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s，1個循環(huán)，95℃變性5 s和60℃退火和延伸20 s，40個循環(huán)。mRNA的表達采用相對表達量進行比較，即目的基因相對于管家基因GAPDH的表達量所增加的倍數(shù)進行比較，采用2-ΔCt法計算各mRNA的相對表達量。

1.2.4 TNF-α與IL-1β mRNA水平將P3代GMSCs分成3組，應(yīng)用不同濃度NF-κB抑制劑BAY 11-7082［5］誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h后，分別提取3組RNA，Real-Time PCR檢測TNF-α與IL-1β mRNA水平。其中對照組不加BAY 11-7082，另外兩組的BAY 11-7082濃度為2 μM。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.13 組GMSCs細胞形態(tài)學(xué)觀察加入TNF-α后，細胞形態(tài)隨TNF-α濃度的增加而發(fā)生變化，雖然細胞均為長梭形，且呈螺旋形克隆生長，但對照組細胞的通透性和折光性較好，細胞外基質(zhì)分泌物較少，細胞狀態(tài)優(yōu)于加入炎性因子的兩組。

2.2 凋亡檢測結(jié)果如圖1所示，對照組凋亡率為4.83%，10 ng/ml組為12.47%，而20 ng/ml組則達到20.16%?？梢婋STNF-α濃度的升高，GMSCs細胞凋亡率增加（P＜0.05）。

2.3 Western blot檢測結(jié)果在TNF-α誘導(dǎo)下，與對照組相比，隨TNF-α濃度增加，GMSCs的NLK和I-κBα mRNA表達降低（P＜0.05），而P-IκBα mRNA表達量增高（P＜0.05）。見圖2、表2。

2.4 Real-Time PCR檢測結(jié)果（1）與對照組相比，隨外源性TNF-α濃度升高，GMSCs的TNF-α與IL-1β mRNA表達量顯著升高（P＜0.01，表3）。（2）TNF-α（10、20 ng/ml）誘導(dǎo)組加入BAY 11-7082后誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h，GMSCs的IL-1β與TNF-α mRNA表達量下降，但與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表4）。

表1 擴增片斷所用引物序列

圖1 GMSCs Annexin V-FITC/PI雙染檢測結(jié)果

圖2 GMSCs的NLK與IκB-α和P-IκBα Western blot結(jié)果

表2 TNF-a誘導(dǎo)下3組GMSCs的NLK、I-κBa、P-IκBa的蛋白表達結(jié)果（n=3）

表3 在炎性因子TNF-α刺激下3組GMSCs的TNF-α與IL-1β基因表達（n=3）

表4 TNF-α誘導(dǎo)組加入BAY 11-7082后GMSCs 的IL-1β與TNF-α mRNA 表達（n=3）

3 討論

GMSCs由Zhang等［6］首次從牙齦中分離，并鑒定其具有干細胞特性，經(jīng)體內(nèi)和體外實驗顯示出較強的自我更新、調(diào)節(jié)免疫和多方向分化能力。本實驗從臨床上采集拔牙切除的正常齦瓣組織，體外培養(yǎng)純化得到GMSCs。最近有研究報道，炎性牙周組織中的間充質(zhì)干細胞可分泌IL-6、IL-17等細胞炎性因子，可能與牙周炎癥及牙周組織破壞相關(guān)［7］。TNF-α可誘導(dǎo)牙髓干細胞的NF-κB信號通路，導(dǎo)致牙髓細胞發(fā)生凋亡［8］。NF-κB通路與細胞凋亡有關(guān)，本實驗凋亡檢測證實，GMSCs在炎癥因子刺激下凋亡比率也大大增加，可以推斷NF-κB通路已經(jīng)被激活。一般情況下，NF-κB與抑制分子蛋白I-κBα結(jié)合，以失活狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中。在一系列的刺激下，IKK蛋白將I-κBα的兩個關(guān)鍵絲氨酸磷酸化，I-κBα隨即泛素化并被降解。釋放游離的NF-kB進入細胞核內(nèi)，激活一系列涉及多項生理、病理反應(yīng)的下游靶基因。NLK是NF-κB信號傳導(dǎo)的負向調(diào)節(jié)因子，它對于維持細胞的穩(wěn)定和活性是必須的。NLK可以與IKK復(fù)合物相互作用，競爭結(jié)合TAK1，從而抑制TNF-a誘導(dǎo)的NF-κB活化過程［9-10］。經(jīng)Western blot實驗顯示，NLK在炎性因子濃度升高時，表達量下降，進而有可能促進了NF-κB的活化，使炎性因子TNF-α與IL-1β表達含量顯著升高。BAY 11-7082是不可逆性I-κBα磷酸化抑制劑，可以增加I-κBα的穩(wěn)定性的，從而特異性阻斷NF-κB信號通路［11］。為進一步證實GMSCs分泌TNF-α、IL-1β與NF-κB信號通路有關(guān)，應(yīng)用抑制劑BAY 11-7082抑制NF-κB活性。Real-Time PCR結(jié)果顯示，TNF-α與IL-β基因表達量下降，與對照組無明顯差異（P＞0.05）。由于GMSCs在炎性因子刺激下可以激活NF-κB信號通路，增加TNF-α與IL-1β的表達。因此，調(diào)節(jié)和控制NF-κB信號通路對控制牙齦炎癥有重要意義，選擇特異性的NF-κB通路的抑制劑，可以為臨床治療提供新的途徑。

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Effects of NF-kappa B pathway on secretion ability of inflammatory cytokines in gingival mesenchymal stem cells

Zhang Yang1，Liu Jie2，Shi Haigang3，Li Xiaoguang1，Zhang Wei3，Liu Na1，Xu Lulu11.Stomatological Center，General Hospital of PLA，Beijing，100853，China；2.Xiaoxitian Outpatient Department of Hospital 309 of PLA，Beijing，100091，China；3.Technical Institute of Physics and Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Beijing，100101，China

ObjectiveTo investigate the effects of NF-kappa B pathway on the secretion ability of inflammatory cytokines in human gingival mesenchymal stem cells（GMSCs）.MethodsGMSCs derived from normal tissues were isolated and purified in vitro. GMSCs were divided into three groups under the same culture conditions and induced by TNF-α（0，10 ng/ml，and 20 ng/ml）for 12 h. The difference of apoptosis rate between the three groups was detected by Annexin V-FITC/PI double staining.Western blot analysis was used to detect the expression of NLK，I-κBα，and P-IκBα in the activation pathway of NF-κB.The gene expression changes of TNF-α and IL-1β in GMSCs after adding the inhibitor of BAY-11-7082 were detected by Real-Time PCR.ResultsApoptosis detection showed that the apoptosis rate of GMSCs was positively correlated with the concentration of TNF-α.Western blot results showed that compared with the expression in the control group，the expression of NLK and I-κBα decreased along with the increase of TNF-α concentration（P＜0.05）.P-IκBα expression had the obvious tendency of increase（P＜0.01）.The PCR results indicated that along with the increase of exogenous concentration，the TNF-α and IL-1β gene expression significantly increased in 10 ng/ml group and 20 ng/ml group（P＜0.01）.After the adding of inhibitor BAY 11-7082，the expression of IL-1β and TNF-α decreased in 10 ng/ml group and 20 ng/ml group，but the differences between those groups and the control group were not significant（P＞0.05）. ConclusionNLK expression decreases in inflammatory environment.The inflammatory factors can enhance the expression of TNF-α and IL-1β in gingival mesenchymal stem cells through the NF-κB pathway.

tumor necrosis factor-α；gingival mesenchymal stem cell；inflammation；nuclear factor-kappa B

R 781.41

A

1004-0188（2016）05-0465-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.05.001

2016-01-27）

國家自然科學(xué)基金（31200741，51473175）；北京科技新星計劃（Z14111000180000）；解放軍總醫(yī)院臨床科研扶持基金（2013FC-TSYS-2007）

100853北京，解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心（張洋，李曉光，劉娜，徐璐璐）；解放軍309醫(yī)院小西天門診部（劉杰）；中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所（石海剛，張維）

前兩位作者（張洋，劉杰）對本文有同等貢獻，均為第一作者

徐璐璐E-mail：xululu1977@126.com