改進(jìn)HPLC法測(cè)定吲哚美辛腸溶片中的有關(guān)物質(zhì)

李　超（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶　401121）

改進(jìn)HPLC法測(cè)定吲哚美辛腸溶片中的有關(guān)物質(zhì)

李超＊（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶401121）

目的：改進(jìn)高效液相色譜法測(cè)定吲哚美辛腸溶片中2-甲基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-乙酸（以下簡(jiǎn)稱雜質(zhì)Ⅰ）和4-氯苯甲酸（以下簡(jiǎn)稱雜質(zhì)Ⅱ）的含量。方法：色譜柱為Phenomenex Phenyl-Hexyl，流動(dòng)相為10 g/L醋酸溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.262 2～5.243 0、0.252 5～5.050 0 μg/ml（r均為0.999 8）；定量限分別為1.12、0.48 ng，檢測(cè)限分別為0.340、0.146 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ的加樣回收率分別為99.71%～100.52%（RSD=0.28%，n=9）、100.84%～102.14%（RSD= 0.47%，n=9）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、快速，可用于吲哚美辛腸溶片中雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ的含量測(cè)定。

高效液相色譜法；吲哚美辛腸溶片；2-甲基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-乙酸；4-氯苯甲酸

吲哚美辛為吲哚乙酸類非甾體消炎藥［1］，臨床上主要用于抗炎、抗風(fēng)濕及解熱鎮(zhèn)痛等［2］。其作用機(jī)制為通過(guò)抑制環(huán)氧化酶，從而減少前列腺素的合成，制止炎癥組織痛覺(jué)神經(jīng)沖動(dòng)的形成，抑制炎性反應(yīng)［3］，也可用于癌癥發(fā)熱并有一定的抗腫瘤作用，可抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡［4-7］。但該藥不良反應(yīng)較多，主要為胃腸道反應(yīng)，也有哮喘［8-11］、致粒細(xì)胞缺乏［12］等不良反應(yīng)的報(bào)道。2-甲基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-乙酸（以下簡(jiǎn)稱雜質(zhì)Ⅰ）和4-氯苯甲酸（以下簡(jiǎn)稱雜質(zhì)Ⅱ）為吲哚美辛的工藝雜質(zhì)，不可避免，而且是引起不良反應(yīng)的主要因素。2010年版《中國(guó)藥典》（二部）［13］和2015年版《中國(guó)藥典》（二部）［14］收載了吲哚美辛腸溶片，均采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定有關(guān)物質(zhì)的含量，且兩版藥典中對(duì)吲哚美辛腸溶片有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法一致，無(wú)修訂，但該方法不能有效檢出吲哚美辛腸溶片的雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ。為更好地控制該藥的質(zhì)量，筆者參考2015年版《英國(guó)藥典》中吲哚美辛有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法［15］，對(duì)2015年版《中國(guó)藥典》（二部）中吲哚美辛腸溶片有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)。

1　材料

1.1儀器

e2695型HPLC儀，包括2489型紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）；XP205型萬(wàn)分之一電子天平（瑞士萬(wàn)通有限公司）。

1.2藥品與試劑

吲哚美辛腸溶片（A廠，批號(hào)：140502、131201、150201，規(guī)格：25 mg/片；B廠，批號(hào)：150401、150101、150601，規(guī)格：25 mg/片；C廠，批號(hào)：1407006、1402002、1502002，規(guī)格：25 mg/片；D廠，批號(hào)：141002、140701、141102、150601，規(guī)格：25 mg/片；E廠，批號(hào)：140804、150501、140502、141105，規(guī)格：25 mg/片；F廠，批號(hào)：A141002、A130703、A150103，規(guī)格：25 mg/片；G廠，批號(hào)：17140202、130801、1715003，規(guī)格：25 mg/片；H廠，批號(hào)：20150102，規(guī)格：25 mg/片；I廠，批號(hào)：140201，規(guī)格：25 mg/片；J廠，批號(hào)：815001、824001、774001，規(guī)格：25 mg/片）；雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品（西亞試劑有限責(zé)任公司，批號(hào)：B55980，純度：98%）；雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌罚ㄌ旖蚴泄鈴?fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20150417，純度：100%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Phenomenex Phenyl-Hexyl（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動(dòng)相：10 g/L醋酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2溶液的配制

2.2.1混合對(duì)照品溶液精密稱取雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品和雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌犯骷s12.5 mg，精密稱定，置于同一10 ml量瓶中，加50%乙腈溶解并稀釋制成每1 ml含雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ各5 μg的混合對(duì)照品溶液。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Gradient edution program

2.2.2供試品溶液取樣品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于吲哚美辛50 mg），精密稱定，置于50 ml量瓶中，加50%乙腈適量，超聲處理10 min，使其溶解，放冷，加50%乙腈定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液取50%乙腈溶液作為陰性對(duì)照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞2；理論板數(shù)以吲哚美辛峰計(jì)為50 000。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1　高效液相色譜圖A.供試品；B.混合對(duì)照品；C.陰性對(duì)照；1.雜質(zhì)Ⅰ；2.雜質(zhì)Ⅱ；3.吲哚美辛Fig 1　HPLC chromatogramsA.test sample；B.mixed reference substance；C.negative control；1.impurityⅠ；2.impurityⅡ；3.indometacin

2.4破壞性試驗(yàn)

（1）光破壞：精密稱取樣品細(xì)粉適量，分別置于1 500 lx燈下照射24 h，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備光破壞試驗(yàn)溶液。（2）熱破壞：精密稱取樣品細(xì)粉適量，置于120℃烘箱中烘烤24 h，取出后冷卻至室溫，再取上述烘烤后的細(xì)粉適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備熱破壞試驗(yàn)溶液。（3）酸破壞：精密稱取樣品細(xì)粉適量，加2 mol/L鹽酸溶液5 ml，于室溫下放置80 min，再加2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備酸破壞試驗(yàn)溶液。（4）堿破壞：精密稱取樣品細(xì)粉適量，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml，于室溫下放置8 min，加0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至中性，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備堿破壞試驗(yàn)溶液。（5）氧化破壞：精密稱取樣品細(xì)粉適量，加30%過(guò)氧化氫溶液10 ml，搖勻，于室溫下放置2 h，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備氧化破壞試驗(yàn)溶液。分別取上述破壞試驗(yàn)溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖2。由圖2可知，樣品在酸堿條件下不穩(wěn)定，能夠降解出雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ；在光破壞、熱破壞和氧化破壞條件下比較穩(wěn)定，不易被破壞。

圖2　破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.酸破壞；B.堿破壞；C.氧化破壞；D.光破壞；E熱破壞；1.雜質(zhì)Ⅰ；2.雜質(zhì)Ⅱ；3.吲哚美辛Fig 2　HPLC chromatograms of destructive testA.sample destroyed by acid；B.sample destroyed by alkali；C.sample destroyed by oxidation；D.sample destroyed by light；E.sample destroyed by heating；1.impurityⅠ；2.impurityⅡ；3.indometacin

2.5線性關(guān)系考察

取雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品和雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌犯骷s25 mg，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加50%乙腈溶解并定容，搖勻，作為單一對(duì)照品貯備液。分別取上述單一對(duì)照品貯備液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得雜質(zhì)Ⅰ的回歸方程為y=17 756x－983.32（r=0.999 8）、雜質(zhì)Ⅱ的回歸方程為y=42 670x－1 637（r=0.999 8）。結(jié)果表明，雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.262 2～5.243 0、0.252 5～5.050 0 μg/ml。

2.6定量限與檢出限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限分別為1.12、0.48 ng；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限分別為0.340、0.146 ng。

2.7精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ峰面積的RSD分別為0.22%、0.10%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ峰面積的RSD分別為0.67%、0.70%（n=5），表明供試品溶液在室溫下8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：1715003）適量，除去包衣后研細(xì)，稱取約2片細(xì)粉（約相當(dāng)于吲哚美辛50 mg），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ峰面積的RSD分別為0.81%、0.75%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：1715003）適量，除去包衣后研細(xì)，取約2片細(xì)粉（約相當(dāng)于吲哚美辛50 mg），精密稱定，分別置于50 ml量瓶中，分別加入“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0 ml，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得系列溶液。取上述系列溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab 2　Results of recovery tests（n=9）

2.11樣品含量測(cè)定

分別取28批樣品各適量，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ的含量，結(jié)果詳見(jiàn)表3。

3　討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

筆者曾考察了檢測(cè)波長(zhǎng)（228、240和254 nm），發(fā)現(xiàn)在228 nm和240 nm波長(zhǎng)處，系統(tǒng)基線不穩(wěn)定，影響了雜質(zhì)的檢測(cè)，而在254 nm波長(zhǎng)處基線穩(wěn)定且雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果也較好。因此，本試驗(yàn)最終選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2破壞性試驗(yàn)條件的確定

在進(jìn)行酸破壞試驗(yàn)時(shí)，筆者曾用1、2、6 mol/L的鹽酸溶液進(jìn)行酸破壞。結(jié)果顯示，1 mol/L的鹽酸溶液基本無(wú)法破壞出雜質(zhì)，說(shuō)明破壞條件不夠劇烈；6 mol/L的鹽酸溶液破壞出的雜質(zhì)峰過(guò)大，以至于主峰吲哚美辛的峰面積過(guò)?。ǎ?0%），說(shuō)明條件過(guò)于劇烈。因此，最終采用2 mol/L的鹽酸溶液進(jìn)行酸破壞試驗(yàn)，主峰的峰面積適宜（占80%左右），說(shuō)明該破壞試驗(yàn)條件適用，且破壞出的雜質(zhì)能被有效檢出。

在進(jìn)行堿破壞試驗(yàn)時(shí)，筆者曾用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液分別破壞2、8、15、30 min。結(jié)果顯示，15 min以上的破壞使得主峰吲哚美辛被破壞過(guò)多（＜50%），2 min的破壞時(shí)間過(guò)短，主峰吲哚美辛基本沒(méi)有被破壞。因此，最終確定8 min的破壞時(shí)間，破壞之后主峰的峰面積適宜（占80%左右），說(shuō)明該破壞試驗(yàn)條件適用，且破壞出的雜質(zhì)能被有效檢出。

其他光、熱和氧化破壞條件均沒(méi)有破壞出雜質(zhì)，說(shuō)明本品對(duì)光、熱和氧化條件比較穩(wěn)定。

表3　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3，%）Tab 3　Results of related substances determination of samples（n=3，%）

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、快速，可用于吲哚美辛腸溶片雜質(zhì)Ⅰ和雜質(zhì)Ⅱ的含量測(cè)定。

［1］呂長(zhǎng)淮.吲哚美辛片有關(guān)物質(zhì)檢查方法改進(jìn)［J］.中國(guó)藥房，2007，18（28）：2 216.

［2］徐輝，俞佳，呂良忠.吲哚美辛對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和凋亡作用的影響［J］.中國(guó)藥房，2015，26（31）：4 375.

［3］呂倩，李婷婷，李珂.紫外分光光度法測(cè)定吲哚美辛片含量及腸溶片的釋放度［J］.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，36（8）：884.

［4］孫麗平，段玉龍，侯俊卿，等.吲哚美辛栓在腫瘤生物治療中的應(yīng)用［J］.中國(guó)腫瘤臨床與康復(fù)，1998，5（4）：66.

［5］張桂英，段曉明，袁偉建，等.吲哚美辛誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制［J］.中華消化雜志，2000，20（4）：267.

［6］楊蕾，高歌.非甾體類抗炎藥對(duì)胃腸道惡性腫瘤的化學(xué)預(yù)防［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：腫瘤學(xué)分冊(cè)，2002，29（3）：221.

［7］張桂英，冷愛(ài)民，賀智民，等.消炎痛抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，1998，8（12）：1.

［8］火統(tǒng)武.吲哚美辛治過(guò)敏哮喘并休克1例［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（6）：527.

［9］劉艷娣.口服吲哚美辛致哮喘發(fā)作1例［J］.中國(guó)社區(qū)醫(yī)師，2012，38（5）：15.

［10］佟雪飛，郭海軍.直腸應(yīng)用吲哚美辛致過(guò)敏性哮喘［J］.藥物不良反應(yīng)雜志，2013，15（2）：107.

［11］梁書(shū)生，趙黎明.吲哚美辛致支氣管哮喘1例［J］.人民軍醫(yī)，2014，57（8）：861.

［12］龔巧燕，陳俞先，管玫.吲哚美辛腸溶片致粒細(xì)胞缺乏1例［J］.中國(guó)藥業(yè)，2014，23（7）：92.

［13］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部［S］.2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：347-348.

［14］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部［S］.2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：479-480.

［15］ British Pharmacopoeia Commission office.British Pharmacopeia.：European Pharmacopoeia VolumeⅡ［S］.2015：1 204-1 206.

（編輯：劉柳）

Determination of Related Substance in Indometacin Enteric-coated Tablet by Improving HPLC

LI Chao（Chongqing Institute For Food and Drug Control，Chongqing 401121，China）

OBJECTIVE：To improve HPLC for the contents determination of 2-methyl-5-methoxy-indole-3-acetic acid（impurityⅠ）and 4-chlorobenzoic（impurityⅡ）in Indometacin enteric-coated tablet.METHODS：The column was Phenomenex Phenyl-Hexyl with mobile phase of 10 g/L acetic acid solution-acetonitrile（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 254 nm，column temperature was 40℃，injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 0.262 2-5.243 0 μg/ml for impurityⅠ（r=0.999 8）and 0.252 5-5.050 0 μg/ml for impurityⅡ（r=0.999 8）；the limits of quantitation were 1.12 ng and 0.48 ng，limits of detection were 0.340 ng and 0.146 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 99.71%-100.52%（RSD=0.28%，n=9）and 100.84%-102.14%（RSD=0.47%，n= 9）.CONCLUSIONS：The method is accurate and rapid，and can be used for the contents determination of impurityⅠand impurityⅡin Indometacin enteric-coated tablet.

HPLC；Indometacin enteric-coated tablet；2-methyl-5-methoxy-indole-3-acetic acid；4-chlorobenzoic

R927.2

A

1001-0408（2016）27-3861-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.39

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥物分析。E-mail：179320851 @qq.com

（2016-01-21

2016-07-04）