HPLC法同時測定氯苯醇溶液中氯霉素和鹽酸苯海拉明的含量Δ

劉　珊，蔣琳蘭，謝新民，晏　明，李　冬，李騰霞，李　輝，林蘭蘭，韓麗萍（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣州510010）

HPLC法同時測定氯苯醇溶液中氯霉素和鹽酸苯海拉明的含量Δ

劉珊＊，蔣琳蘭，謝新民，晏明，李冬，李騰霞，李輝，林蘭蘭，韓麗萍#（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣州510010）

目的：建立同時測定氯苯醇溶液中氯霉素和鹽酸苯海拉明含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil C18，流動相為含0.01 mol/L庚烷磺酸鈉的磷酸鹽緩沖液-乙腈（66.5∶33.5，V/V），柱溫為35℃，流速為1 ml/min，檢測波長為鹽酸苯海拉明258 nm、氯霉素277 nm，進樣量為10 μl。結(jié)果：氯霉素、鹽酸苯海拉明檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為34.8～139.4 μg/ml（r=0.999 8）、93.0～930.5 μg/ml（r=0.999 8）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.70%～104.02%、96.72%～101.72%，RSD分別為2.2%、1.6%（n=9）。結(jié)論：該方法專屬性強、結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好，適用于氯苯醇溶液的質(zhì)量控制。

氯苯醇溶液；氯霉素；鹽酸苯海拉明；含量

氯苯醇溶液是由氯霉素、鹽酸苯海拉明和75%乙醇等配制而成，具有抗菌消炎作用，為皮膚科較常用的醫(yī)院制劑，臨床上主要用于痤瘡（青春痘）、脂溢性皮炎、毛囊炎、痱子等的治療，在我院臨床應(yīng)用已有10余年。其中的氯霉素屬抑菌性廣譜抗菌藥物，鹽酸苯海拉明屬于抗組胺藥物。本研究中，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)［1-2］，建立了以高效液相色譜法（HPLC）同時測定氯苯醇溶液中氯霉素和鹽酸苯海拉明含量的方法，旨在為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1　材料

1.1儀器

1100型HPLC儀，包括二元泵、自動進樣裝置、二極管陣列檢測器（DAD）、柱溫箱等（美國安捷倫公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；BP211D型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2藥品與試劑

氯霉素對照品（批號：130555-201203，純度＞99.8%）、鹽酸苯海拉明對照品（批號：100066-199705，純度＞99.8%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；氯苯醇溶液（我院制劑室自制，批號：141009、141223、150415）；磷酸二氫鉀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；乙腈（色譜純，美國迪馬公司）；甲醇（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；三乙胺（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（分析純，北京化工廠）；庚烷磺酸鈉（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠）；水為自制純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件[3]

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：含0.01 mol/L庚烷磺酸鈉的磷酸鹽緩沖液（6.8 g磷酸二氫鉀，加0.01 mol/L庚烷磺酸鈉溶液溶解后，定容至1 L，加入三乙胺5 ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.45）-乙腈（66.5∶33.5，V/V）；柱溫：35℃；流速：1 ml/min；檢測波長：鹽酸苯海拉明258 nm、氯霉素277 nm；進樣量：10 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液 （1）氯霉素測定用供試品溶液：精密量取樣品1 ml，置于100 ml量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。（2）鹽酸苯海拉明測定用供試品溶液：取樣品適量，濾過，即得。

特色小鎮(zhèn)的繁榮開辟了道路方向，體育產(chǎn)業(yè)的崛起提供了資金支撐，旅游產(chǎn)業(yè)的郁勃創(chuàng)造了融合的機會，這都對體育特色小鎮(zhèn)的建設(shè)起到了極大的推動作用，為體育特色小鎮(zhèn)的長遠(yuǎn)發(fā)展奠定了物質(zhì)文化基礎(chǔ)。體育產(chǎn)業(yè)不再是一種孤立的產(chǎn)業(yè)形態(tài)，通過“體育+旅游”模式打造出的體育特色小鎮(zhèn)，融合了新技術(shù)、新業(yè)態(tài)，體育產(chǎn)業(yè)跨界融合的創(chuàng)新載體，是體育特色小鎮(zhèn)的核心發(fā)展模式，也是推進供給側(cè)改革的有效處方。體育特色小鎮(zhèn)的構(gòu)建為各項產(chǎn)業(yè)跨界融合提供了借力點，為破解城鄉(xiāng)二元結(jié)構(gòu)提供了有益的探索方式，為新型城鎮(zhèn)化建設(shè)提供了新思路，為未來體育的發(fā)展發(fā)揮了重要的行為導(dǎo)向作用。

2.2.2對照品溶液 （1）氯霉素對照品貯備液和對照品溶液：精密稱取氯霉素對照品8.71 mg，置于10 ml量瓶中，加入1ml甲醇溶解后，加入流動相稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.871 mg/ml的氯霉素對照品貯備液。精密稱取氯霉素對照品10.08 mg，置于100 ml量瓶中，加入1 ml甲醇溶解后，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，制成每1 ml中含100.8μg的氯霉素對照品溶液。（2）鹽酸苯海拉明對照品貯備液和對照品溶液：精密稱取鹽酸苯海拉明對照品18.61 mg，置于10 ml量瓶中，加入適量水溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為1.861 mg/ml的鹽酸苯海拉明對照品貯備液。精密稱取鹽酸苯海拉明對照品10.12 mg，置于20 ml量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，制成每1 ml中含506μg的鹽酸苯海拉明對照品溶液。

2.2.3陰性對照溶液 （1）氯霉素陰性對照溶液：參照氯苯醇溶液處方稱取除氯霉素外的其他成分和輔料，按處方和制備工藝制成氯霉素陰性樣品，精密量取1 ml置于100 ml量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，制成氯霉素陰性對照溶液。（2）鹽酸苯海拉明陰性對照溶液：參照氯苯醇溶液處方稱取除鹽酸苯海拉明外的其他成分和輔料，按處方和制備工藝制成鹽酸苯海拉明陰性樣品，精密量取1 ml置于100 ml量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，制成鹽酸苯海拉明陰性對照溶液。

2.3專屬性試驗

精密吸取“2.2”項下氯霉素和鹽酸苯海拉明對照品溶液、氯霉素和鹽酸苯海拉明測定用供試品溶液、氯霉素和鹽酸苯海拉明陰性對照溶液各10 μl，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，供試品在與對照品相應(yīng)保留時間處均有相同的色譜峰出現(xiàn)，而陰性對照在該保留時間處均無色譜峰出現(xiàn)，表明其他成分對目標(biāo)成分測定無干擾，該方法專屬性好。

圖1　高效液相色譜圖A.鹽酸苯海拉明對照品；B.鹽酸苯海拉明測定用供試品；C.鹽酸苯海拉明陰性對照；D.氯霉素對照品；E.氯霉素測定用供試品；F.氯霉素陰性對照；1.鹽酸苯海拉明；2氯霉素Fig 1　HPLC chromatogramsA.reference substance of diphenhydramine hydrochloride；B.test sample of diphenhydramine hydrochloride；C.negative control of diphenhydramine hydrochloride；D.reference substance of chloramphenicol；E.test sample of chloramphenicol；F.negative control of chloramphenicol；1.diphenhydramine hydrochloride；2.chloramphenicol

2.4線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.2”項下的氯霉素對照品貯備液40、60、80、100、120、140、160 μl和鹽酸苯海拉明對照品貯備液50、100、200、250、300、400、500 μl，各置于1 ml量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，分別取10 μl按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得氯霉素回歸方程為y=17 070x－42.843（r=0.999 8）、鹽酸苯海拉明回歸方程為y=821x－9.097 2（r=0.999 8）。結(jié)果表明，氯霉素、鹽酸苯海拉明檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為34.8～139.4、93.0～930.5 μg/ ml。

2.5精密度試驗

2.6穩(wěn)定性試驗

取“2.2.1”項下氯霉素測定用供試品溶液和鹽酸苯海拉明測定用供試品溶液（批號：141009）各適量，分別于室溫放置0、1、2、3、5、7、9、11、13、20 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，氯霉素和鹽酸苯海拉明峰面積的RSD分別為0.91%、0.95%（n=10），表明兩種供試品溶液在室溫放置20 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗

取同一批號樣品（批號：141009）適量，共6份，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算兩種成分含量。結(jié)果，氯霉素、鹽酸苯海拉明含量的RSD分別為1.71%、1.10%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗

取批號為141009的樣品（含氯霉素9.186 8 mg/ml）1 ml，置于10 ml量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取50 μl，共9份，分別置于1 ml量瓶中，每3份一組加入低、中、高質(zhì)量的氯霉素對照品，再加入流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過；取批號為141009的樣品（含鹽酸苯海拉明0.408 3 mg/ml）500 μl，共9份，分別置于1 ml量瓶中，每3份一組加入低、中、高質(zhì)量的鹽酸苯海拉明對照品，再加入流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過。取上述兩種加樣回收率試驗溶液按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1　加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）Tab 1　Results of recovery test（n=9）

2.9樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定并按外標(biāo)法計算其中氯霉素和鹽酸苯海拉明的含量，結(jié)果見表2。

3　討論

表2　樣品含量測定結(jié)果（n=2，mg/ml）Tab 2　Results of contents determination of samples（n=2，mg/ml）

采用紫外分光光度法對氯霉素對照品溶液和鹽酸苯海拉明對照品溶液在200～400 nm波長范圍進行掃描。結(jié)果顯示［1］，鹽酸苯海拉明在258 nm波長處有最大吸收峰、氯霉素在277 nm波長處有最大吸收峰，而鹽酸苯海拉明陰性對照在258 nm波長處無吸收、氯霉素陰性對照在277 nm波長處無吸收。故本試驗確定鹽酸苯海拉明測定波長為258 nm，氯霉素測定波長為277 nm。

原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，氯霉素采用C8色譜柱進行分析，筆者曾使用HQ sil C8（250 mm×4.6 mm，5 μm）對氯霉素進行含量測定，結(jié)果氯霉素峰保留時間超過15 min，且柱效不高。參考有關(guān)文獻(xiàn)［4］，改用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），此時氯霉素峰的保留時間不超過8.5 min。故本試驗最終采用該色譜柱進行測定。

本研究主要目的是對氯苯醇溶液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行提高，旨在更加準(zhǔn)確地測定該制劑中氯霉素和鹽酸苯海拉明的含量。筆者在供試品溶液的制備方法摸索過程中發(fā)現(xiàn)，由于氯苯醇中含氯霉素和鹽酸本海拉明的量差距較大，使用稀釋100倍的供試品溶液無法測定鹽酸苯海拉明的含量，故參考相關(guān)文獻(xiàn)［5-6］，測定氯霉素和鹽酸苯海拉明時，一個用不經(jīng)稀釋的氯苯醇溶液制備供試品溶液；另一個用經(jīng)稀釋的氯苯醇溶液制備供試品溶液。

綜上所述，本方法專屬性強、結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好，適用于氯苯醇溶液的質(zhì)量控制。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：29-31、1 029.

［2］中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部.中國人民解放軍醫(yī)療制劑規(guī)范［S］.2版.北京：人民軍醫(yī)出版社，2003：89、100.

［3］張燕，孫嵐.高效液相色譜法測定氯霉醇溶液含量［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2008，27（8）：986.

［4］邢蓉，鄧子熠，陳根德.高效液相色譜法同時測定止癢酊中三組成分的含量［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2005，25（3）：277.

［5］張軍，李瑞林.高效液相色譜法測鹽酸苯海拉明霜含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2012，27（1）：42.

［6］涂初芳，蔣藤川.高效液相色譜法測氯霉醇含量［J］.中國藥師，2010，13（12）：1 832.

Simultaneous Contents Determination of Chloramphenicol and Diphenhydramine Hydrochloride in ChlorobenzeneAlcohol Solution by HPLC

LIU Shan，JIANG Linlan，XIE Xinmin，YAN Ming，LI Dong，LI Tengxia，LI Hui，LIN Lanlan，HAN Liping（Dept. of Pharmacy，Guangzhou Genneral Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous contents determination of chloramphenicol and diphenhydramine hydrochloride in Chlorobenzene alcohol solution.METHODS：HPLC was performed on the column of Diamonsil C with mobile phase of phosphate buffer-acetonitrile（66.5∶33.5，V/V）containing 0.01 mol/L sodium heptane，column temperature was 35℃，flow rate was 1 ml/min，detection wavelength was 258 nm for diphenhydramine hydrochloride and 277 nm for chloramphenicol，the injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 34.8-139.4 μg/ml for chloramphenicol（r=0.999 8）and 93.0-930.5 μg/ml for diphenhydramine hydrochloride（r=0.999 8）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 97.70%-104.02%（RSD=2.2%，n=9）and 96.72%-101.72%（RSD=1.6%，n=9）.CONCLUSIONS：The method is specific，accurate with good precision，and suitable for the quality control of Chlorobenzene alcohol solution.

R927.2

A

1001-0408（2016）27-3847-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.34

軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項課題（No：14ZJZ03-3）；廣州市科技計劃項目（No.201509010012）

＊藥士。研究方向：中藥化學(xué)與制劑分析。E-mail：971607680 @qq.com

主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥事管理。E-mail：hliping@163.com

（2015-10-18

2016-08-18）