HPLC法同時(shí)測定丹知青娥片中4種成分的含量Δ

楊　帆，于卉娟，王亞靜，楊君君，張波泳，王躍飛#，柴　欣（.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院/天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　30093；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津　300457）

HPLC法同時(shí)測定丹知青娥片中4種成分的含量Δ

楊帆1，2＊，于卉娟1，2，王亞靜1，楊君君1，2，張波泳1，2，王躍飛1，2#，柴欣1，2（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院/天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津300457）

目的：建立同時(shí)測定丹知青娥片中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Eclipse XDB-C18，流動(dòng)相分別為甲醇-水（51∶49，V/V）（等度洗脫分析補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素）、乙腈-0.1%甲酸水溶液（12∶88，V/V）（等度洗脫分析補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷），流速為1.0 ml/min，檢測波長為246 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為3.138～200.8、3.175～203.2、3.181～101.8、3.169～101.4 μg/ml（r均為0.999 9）；定量限分別為0.627 5、0.635 0、3.181 0、3.169 0 ng，檢測限分別為0.251 0、0.254 0、1.273 0、1.268 0 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率分別為95.68%～102.80%（RSD=2.4%，n=6）、95.91%～102.10%（RSD=2.3%，n=6）、98.64%～99.13%（RSD=0.23%，n=6）、100.20%～101.70%（RSD=0.69%，n=6）。結(jié)論：該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測定丹知青娥片中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷的含量。

丹知青娥片；含量測定；補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂素；補(bǔ)骨脂苷；異補(bǔ)骨脂苷；高效液相色譜法

丹知青娥片由鹽補(bǔ)骨脂、鹽杜仲、丹參和知母4味中藥材組成，是基于臨床經(jīng)驗(yàn)方開發(fā)的中藥6類新藥。該方在經(jīng)典名方青娥丸基礎(chǔ)上，將核桃仁和大蒜替換為丹參和知母，主要用于婦女更年期綜合征的治療。雌激素樣作用是丹知青娥片發(fā)揮治療作用的主要藥效機(jī)制，因此具有雌激素樣作用的化學(xué)成分是丹知青娥片的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。鹽補(bǔ)骨脂是丹知青娥片中的重要藥材，其含有的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素等具有抗腫瘤和雌激素樣作用等［1-3］多種藥理活性。2015年版《中國藥典》（一部）［4］規(guī)定：鹽補(bǔ)骨脂藥材“含量測定”項(xiàng)下，以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總量為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制。

補(bǔ)骨脂中除了含有補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，還含有大量的補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷［5］。本課題組研究得出補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷在腸道菌群的代謝作用下發(fā)生脫糖基反應(yīng)生成補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，可導(dǎo)致補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素被大量吸收，血藥濃度增加，半衰期延長［6］；高濃度的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素易導(dǎo)致肝臟損害，因此在提取工藝設(shè)計(jì)時(shí)除去了補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷，避免口服丹知青娥片后大量生成補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，防止肝臟損害的發(fā)生。

因此，本課題組在建立丹知青娥片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的過程中，重點(diǎn)關(guān)注了補(bǔ)骨脂可能引起的安全性問題，采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定丹知青娥片中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷的含量，以期為丹知青娥片的質(zhì)量控制提供參考。

1　材料

1.1儀器

e2695型HPLC儀，包括2998型光電二極管陣列（PDA）檢測器、Empower色譜工作站（美國 Waters公司）；XS 205型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；AL 204型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；HS-6150D型超聲波清洗器（天津恒奧科技發(fā)展有限公司，功率：150 W，頻率：40 kHz）；TGL-16C型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2藥品與試劑

丹知青娥片（天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制，編號：S1～S4，規(guī)格：0.63 g/片；取S1樣品200片粉碎供方法學(xué)研究用；取S2～S4樣品各20片粉碎供含量測定用）；補(bǔ)骨脂素對照品（批號：110739-201115，純度＞98%）、異補(bǔ)骨脂素對照品（批號：110738-201313，純度＞98%）均購自于中國食品藥品檢定研究院；補(bǔ)骨脂苷對照品（純度＞98%）、異補(bǔ)骨脂苷對照品（純度＞98%）為本課題組實(shí)驗(yàn)室自制；甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸為分析純，水為超純水。

1.3藥材

補(bǔ)骨脂對照藥材（批號：121056-200904）購于中國食品藥品檢定研究院。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（51∶49，V/V）［等度洗脫12 min（補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素）］、乙腈-0.1%甲酸水溶液（12∶88，V/V）［等度洗脫20 min（補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷）］；流速：1 ml/min；檢測波長：246 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液①補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的混和對照品溶液（混合對照品溶液A）。取補(bǔ)骨脂素對照品、異補(bǔ)骨脂素對照品各適量，精密稱定，分別置于10 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度濃度分別為1.004、1.016 mg/ml的單一對照品溶液。精密量取上述單一對照品溶液各2 ml，置于同一10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為200.8、203.2 μg/ml的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素混合對照品溶液，置于－20℃冰箱中，備用。②補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷的混合對照品溶液（混合對照品溶液B）。取補(bǔ)骨脂苷對照品、異補(bǔ)骨脂苷對照品各適量，精密稱定，分別置于10 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為1.018、1.014 mg/ml的單一對照品溶液。精密量取上述單一對照品溶液各1 ml，置于同一10 ml量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為101.8、101.4 μg/ml的補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷混和對照品溶液，置于－20℃冰箱中，備用。

2.2.2供試品溶液①供試品溶液A。取樣品0.5 g，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加入適量甲醇，超聲提取15 min，取出，放至室溫，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，以半徑為6 cm、14 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液A，供測定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素用。②供試品溶液B。取樣品粉末0.5 g，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加入75%甲醇適量，超聲提取20 min，取出，放至室溫，稀釋至刻度，搖勻，以半徑為6 cm、14 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液B，供測定補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷用。

2.2.3陰性對照溶液①陰性對照溶液A。按樣品的制備工藝和配方比例取缺補(bǔ)骨脂的陰性樣品粉末0.3 g，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加入適量甲醇，超聲提取15 min，取出，放至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，以半徑為6 cm、14 000 r/min離心10 min，取上清液，即得陰性對照溶液A，供測定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素用。②陰性對照溶液B。按樣品的制備工藝和配方比例取缺補(bǔ)骨脂的陰性樣品粉末0.25 g，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加入75%甲醇適量，超聲提取20 min，取出，放至室溫，用75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，以半徑為6 cm、14 000 r/min離心10 min，取上清液，即得陰性對照溶液B，供測定補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷用。

2.2.4對照藥材供試品溶液①對照藥材供試品溶液A。取補(bǔ)骨脂對照藥材粉末0.5 g，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加入適量甲醇，超聲提取15 min，取出，放至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，以半徑為6 cm、14 000 r/min離心10 min，取上清液，即得對照藥材供試品溶液A，供測定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素用。②對照藥材供試品溶液B。取補(bǔ)骨脂對照藥材粉末0.5 g，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加入適量75%甲醇，超聲提取20 min，取出，放至室溫，用75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，以半徑為6 cm、14 000 r/min離心10 min，取上清液，即得對照藥材供試品溶液B，供測定補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷用。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液、對照藥材供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度均＞1.5；理論板數(shù)以補(bǔ)骨脂素峰計(jì)均≥5 000；補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷的保留時(shí)間分別約為5.545、6.402、9.937、11.687 min。陰性對照溶液在相應(yīng)出峰位置無干擾，且供試品溶液、各對照品溶液和對照藥材供試品溶液均在相同位置出峰，表明此為補(bǔ)骨脂藥材的真實(shí)投料。

2.4線性關(guān)系考察

（1）取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液A適量，加甲醇逐級稀釋2、4、8、16、32、64倍，得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。精密吸取上述系列混合對照品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的回歸方程和線性范圍，見表1。（2）取“2.2.1”項(xiàng)下混和對照品溶液B適量，加75%甲醇逐級稀釋2、4、8、16、32倍，得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。精密吸取上述系列混合對照品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷的回歸方程和質(zhì)量濃度線性范圍，見表1。

2.5定量限與檢測限考察

分別取“2.2.1”項(xiàng)下兩種混合對照品溶液各適量，逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測限（LOD），結(jié)果詳見表2。

2.6精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下兩種混合對照品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，測得日內(nèi)精密度；再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，連續(xù)進(jìn)樣3 d，記錄峰面積，測得日間精密度。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積日內(nèi)精密度的RSD分別為0.25%、0.17%（n=6）；日間精密度的RSD分別為1.3%、1.6%（n=6）；而補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷均未檢出。表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖1　高效液相色譜圖A.陰性對照溶液A；B.供試品溶液A；C.補(bǔ)骨脂素對照品溶液；D.異補(bǔ)骨脂素對照品溶液；E.對照藥材供試品溶液A；F.陰性對照溶液B；G.供試品溶液B；H.補(bǔ)骨脂苷對照品溶液；I.異補(bǔ)骨脂苷對照品溶液；J.對照藥材供試品溶液B；1.補(bǔ)骨脂素；2.異補(bǔ)骨脂素；3.補(bǔ)骨脂苷；4.異補(bǔ)骨脂苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.reference substance solution A；B.test sample solution A；C.reference substance solution of psoralen；D.reference substance solution of isopsoralen；E.test sample solution of control medicine A；F.negative reference substance solution B；G.test sample solution B；H.reference substance solution of psoralenoside；I.reference substance solution of isopsoralenoside；J.test sample solution of control medicine B；1.psoralen；2.isopsoralen；3.psoralenoside；4.isopsoralenosid

表1　回歸方程與線性范圍Tab 1　Regression equations and linear ranges

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液A、B各適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD分別為1.8%、1.3%（n=7）；補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷均未檢出。表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表2　檢測限與定量限測定結(jié)果Tab 2　Determination results of detection limit and quantitation limit

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（編號：S1）粉末適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液A和供試品溶液B的方法制備不同的供試品溶液，各6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算平均含量。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的平均含量分別為1.10、1.00 mg/g，RSD分別為1.2%、0.93%（n=6）；而補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷均未檢出。表明本方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（編號：S1）粉末適量，共6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別置于25 ml量瓶中，分別精密加入補(bǔ)骨脂素對照品溶液1.4 ml、異補(bǔ)骨脂素對照品溶液1.2 ml、混合對照品溶液B 1.6 ml，分別按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液A和供試品溶液B的方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見表3。

表3　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 3　Results of recovery tests（n=6）

2.10樣品含量測定

取3個(gè)編號的樣品粉末各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液A和供試品溶液B的方法分別制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品中各成分含量（每片樣品質(zhì)量按0.63 g計(jì)），結(jié)果詳見表4。

3　討論

3.1丹知青娥片中檢測指標(biāo)的選擇

表4　樣品含量測定結(jié)果（n=2，mg/片）Tab 4　Results of contents determination of samples（n=2，mg/tablet）

鹽補(bǔ)骨脂是丹知青娥片中的主藥之一，有文獻(xiàn)報(bào)道測定制劑或藥材中補(bǔ)骨脂素或異補(bǔ)骨脂素含量［7-9］，但鮮有文獻(xiàn)報(bào)道制劑中補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷的檢測。近年來，補(bǔ)骨脂的肝臟毒性受到研究人員的廣泛關(guān)注。有文獻(xiàn)報(bào)道了給予去卵巢術(shù)造模的每只SD大鼠每日灌服補(bǔ)骨脂水提液4 ml（內(nèi)含補(bǔ)骨脂生藥約1.6 g）12周，肝細(xì)胞出現(xiàn)混濁腫脹和脂肪變性，個(gè)別區(qū)域可見肝細(xì)胞壞死［10］；人在服用不同劑量的補(bǔ)骨脂或含有補(bǔ)骨脂的中成藥后會(huì)引起急性膽汁淤積型肝炎或急性肝炎［11-12］，補(bǔ)骨脂中的補(bǔ)骨脂素或異補(bǔ)骨脂素等相關(guān)成分可能是引起肝臟毒性的主要化學(xué)成分。Wang X［13］等研究表明，雄性大鼠連續(xù)灌胃28 d（40 mg/kg）補(bǔ)骨脂素或異補(bǔ)骨脂素，表現(xiàn)出一定的肝臟毒性。補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷在腸道菌群作用下可轉(zhuǎn)化為補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，因此本課題組對丹知青娥片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素進(jìn)行含量測定，對補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷進(jìn)行限量檢查研究，以期為丹知青娥片的質(zhì)量控制提供參考。

3.2提取條件的優(yōu)化

3.2.1補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素提取條件的優(yōu)化在開展丹知青娥片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測定時(shí)，本課題組考察了提取溶劑（50%甲醇、75%甲醇、甲醇）、溶劑體積（10、25 ml）、提取時(shí)間（10、15、20 min）3個(gè)因素對丹知青娥片中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素提取的影響，以優(yōu)選最佳的供試品溶液制備方法。結(jié)果表明，甲醇作為提取溶劑提取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量（分別為1.09、0.964 mg/g）明顯優(yōu)于50%甲醇和75%甲醇提取效果；不同體積的甲醇提取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量基本一致，故甲醇的提取體積選擇25 ml；進(jìn)一步考察了超聲時(shí)間對補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素提取效率的影響，結(jié)果基本一致，故超聲處理時(shí)間選擇15 min。

3.2.2補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷提取條件的優(yōu)化在開展丹知青娥片中補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷的含量測定時(shí)，本課題組亦考察了提取溶劑（50%甲醇、75%甲醇、甲醇）、溶劑體積（10、25、50 ml）、提取時(shí)間（10、20、30 min）3個(gè)因素對丹知青娥片中補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷提取的影響，以優(yōu)選最佳的供試品溶液制備方法。結(jié)果表明，不同提取溶劑、不同溶劑體積、不同提取時(shí)間分別提取丹知青娥片中補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷，結(jié)果均未檢測到補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷。根據(jù)補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷的性質(zhì)，綜合考慮，選擇75%甲醇適量、超聲提取20 min作為補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷的提取條件。

3.3色譜柱的沖洗

丹知青娥片中含有大量的小極性成分，如丹參中的丹參酮類成分［14］、補(bǔ)骨脂中的補(bǔ)骨脂黃酮和補(bǔ)骨脂酚等成分［15］在色譜柱上強(qiáng)保留，在完成補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的分析（12 min）或者在完成補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷的分析（20 min）之后，都采用有機(jī)相梯度洗脫沖洗色譜柱，目的主要是為了洗脫色譜柱上強(qiáng)保留的低極性成分，避免對后續(xù)分析產(chǎn)生影響。

3.4含量限定的制訂

2015年版《中國藥典》（一部）鹽補(bǔ)骨脂的含量測定項(xiàng)下規(guī)定：鹽補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的總含量不得＜0.7%［4］，未規(guī)定鹽補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷的含量限度。本研究根據(jù)全國各地收集的補(bǔ)骨脂樣品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷的分析結(jié)果，進(jìn)一步結(jié)合毒理研究結(jié)果及生產(chǎn)放大的實(shí)際情況，科學(xué)合理地制訂補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量下限以及補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷的含量上限。

綜上所述，本方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于測定丹知青娥片中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷的含量。

［1］趙婷，朱汀瀅，吳斌.補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素測定［J］.中成藥，2015，37（5）：1 036.

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（編輯：劉柳）

Simultaneous Determination of 4Components in Danzhi Qing'e Tablet by HPLC

YANG Fan1，2，YU Huijuan1，2，WANG Yajing1，YANG Junjun1，2，ZHANG Boyong1，2，WANG Yuefei1，2，CHAI Xin1，2（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine/Institute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，Research and Development Center of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300457，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the contents determination of psoralen，isopsoralen，psoralenoside and isopsoralenoside in Danzhi qing'e tablet.METHODS：HPLC performed on the column of Eclipse XDB-C18with mobile phase of methanol-water（51∶49，V/V）（isocratic elution，for psoralen and isopsoralen）and acetonitrile-0.1%formic acid（12∶88，V/V）（isocratic elution，for psoralenoside and isopsoralenoside）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 246 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 3.138-200.8 μg/ml for psoralen（r=0.999 9），3.175-203.2 μg/ml for isopsoralen（r=0.999 9），3.181-101.8 μg/ml for psoralenoside（r=0.999 9）and 3.169-101.4 μg/ml for isopsoralenoside（r=0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；limits of quantitation were 0.627 5 ng，0.635 0 ng，3.181 0 ng and 3.169 0 ng，the limits of detection were 0.251 0 ng，0.254 0 ng，1.273 0 ng and 1.268 0 ng；recoveries were 95.68%-102.80%（RSD=2.4%，n=6），95.91%-102.10%（RSD=2.3%，n=6），98.64%-99.13%（RSD=0.23%，n=6）and 100.20%-101.70%（RSD=0.69%，n=6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate，and can be used for the simultaneous determination of psoralen，isopsoralen，psoralenoside and isopsoralenoside in Danzhi qing'e tablet.

Danzhi qing'e tablet；Content determination；Psoralen；Isopsoralen；Psoralenoside；Isopsoralenoside；HPLC

R917

A

1001-0408（2016）27-3832-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.29

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81403060）；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目（No.2014ZX09304307001）

＊碩士研究生。研究方向：中藥質(zhì)量分析。電話：022-59596161。E-mail：695068480@qq.com

副研究員，博士。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。E-mail：Wangyuefei_2006@hotmail.com

（2016-03-17

2016-06-14）