苗藥血人參的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

朱新宇，駱瀚超，何茂秋，胡朝陽，梁　妍，郝小燕（貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽　550025）

·藥物分析與檢定·

苗藥血人參的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

朱新宇＊，駱瀚超，何茂秋，胡朝陽，梁妍，郝小燕#（貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽550025）

目的：建立苗藥血人參藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：鑒別藥材性狀和顯微特征；采用薄層色譜法（TLC）對藥材進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定藥材中表兒茶素、2α，3α-epoxy-5，7，3′，4′-tetra-hydroxy-flavan-（4β→8）-epicatechin（成分A）的含量：色譜柱為Comatex TM C18，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為210 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為5 μl。結(jié)果：藥材性狀和粉末顯微鑒別圖譜清晰。血人參的TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離良好。表兒茶素、成分A檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.274 5～4.392 0 μg（r=0.999 6）、0.103 0～1.648 3 μg（r=0.999 4）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜3%；加樣回收率分別為99.76%～104.82%（RSD=2.42%，n=6）、97.98%～104.99%（RSD=2.75%，n=6）。結(jié)論：該研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于血人參的質(zhì)量控制。

血人參；生藥學(xué)鑒別法；薄層色譜法；高效液相色譜法；含量測定

血人參是豆科蝶形花亞科植物茸毛木藍(lán)Indigofera stachyoides Lindl.的根，為貴州省苗族用藥，收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，別名為山紅花、鐵刷子、紅苦刺。血人參主要分布在云南、貴州、四川、廣西等地，尤其在貴州貴陽、安順、黔東南、黔西南等地有較為廣泛的分布。血人參性溫，味微苦澀，有補(bǔ)氣攝血、滋陰補(bǔ)腎之功效，主治崩漏、跌打、風(fēng)濕、肝硬化、痢疾及疳積等［1-3］。在對其化學(xué)成分及生物活性研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)了有一定抗肝細(xì)胞損傷活性的2α，3α-epoxy-5，7，3′，4′-tetra-hydroxy-flavan-（4β→8）-epicatechin（成分A）以及可以輔助放療化療的化合物表兒茶素［4-7］。迄今為止，對于血人參藥材鑒別方法的相關(guān)研究文獻(xiàn)極少，因此筆者對血人參藥材進(jìn)行性狀和顯微特征鑒別，采用薄層色譜法（TLC）對其進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）測定藥材中表兒茶素和成分A的含量，以期為該藥材的后續(xù)質(zhì)量控制和研發(fā)提供參考。

1　材料

1.1儀器

DFT-200型粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；YS-100型雙目生物顯微鏡（日本Nikon公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；B-490型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；AE240型1/10萬電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；ZF-2型三用紫外分析儀（上海安亭電子儀器廠）；1100型HPLC儀（美國Agilent公司）；AY-120型電子分析天平（日本Shimadzu公司）；硅膠GF254薄層板（美國Merk公司）。

1.2試劑

表兒茶素對照品（貴州省食品藥品檢驗所，批號：800-2000014，純度：98%）；成分A對照品（筆者自制，以氫譜、碳譜確定結(jié)構(gòu)，HPLC測定純度為98%）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3藥材

血人參（見表1）經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院陳德媛研究員鑒定為真品。

2　方法與結(jié)果

2.1性狀鑒別

血人參根頭部形大而不規(guī)則，表面粗糙；下部較細(xì)長，表面有細(xì)微的縱皺紋；全體均有皮孔，外皮呈灰棕色，去皮后內(nèi)顯灰紫色。質(zhì)堅硬，斷面淡黃色，纖維性，稍有香氣，詳見圖1。

2.2顯微鑒別[8]

藥材粉末在顯微鏡下可見：①棕色塊多見，形狀大小不規(guī)則；②草酸鈣方晶極易察見；③泌細(xì)胞呈長管道狀，充滿黃色分泌物；④導(dǎo)管以網(wǎng)紋及梯紋為主；⑤淀粉粒類球或長圓形，臍點(diǎn)點(diǎn)狀，復(fù)粒2～8粒；⑥纖維分布較多，棕黃色，單個存在或集合成束，有時亦與方晶結(jié)合成晶鞘纖維，晶纖維常成束；⑦木纖維較細(xì)長，壁較薄，紋孔稀疏點(diǎn)狀；韌皮纖維紡錘或梭形，壁厚；⑧木栓細(xì)胞呈淡黃色或棕黃色，細(xì)胞壁略微增厚，形狀不規(guī)則；⑨石細(xì)胞偶見。血人參粉末顯微特征見圖2。

表1　血人參來源Tab 1　Origin of I.stachyoides

圖1　血人參藥材Fig 1　I.stachyoides

圖2　血人參粉末顯微特征1.棕色塊；2.草酸鈣方晶；3.樹脂道；4.導(dǎo)管；5.淀粉粒；6.纖維；7.晶纖維束；8.晶鞘纖維；9.木纖維；10.韌皮纖維；11.木栓細(xì)胞；12.石細(xì)胞Fig 2　Microscopic characteristics of I.stachyoides powder 1.brown block；2.calcium oxalate crystal；3.resin canal；4.catheter；5. starch grain；6.fiber；7.crystal fiber bundle；8.crystal sheath fiber；9.wood fiber；10.bast fiber；11.cork cell；12.stone cell

2.3TLC鑒別[9-10]

取樣品粉末5.0 g（過40目篩），精密稱定，加30倍量80%甲醇于圓底燒瓶中回流提取1 h，靜置放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加80%甲醇10 ml使溶解，作為供試品溶液。另分別精密稱定表兒茶素和成分A對照品適量，加80%甲醇制成表兒茶素、成分A質(zhì)量濃度均為1 mg/ml的單一對照品溶液和混合對照品溶液。按TLC法［2015年版《中國藥典》（四部）］［11］試驗，吸取上述供試品溶液2 μl、單一對照品溶液和混合對照品溶液各4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿-甲醇-甲酸（30∶10∶1，V/V/V）為展開劑，置于氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以5%硫酸乙醇，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見圖3。

圖3　薄層色譜圖1.六枝產(chǎn)血人參；2.普安產(chǎn)血人參；3.成分A對照品；4.混合對照品；5.表兒茶素對照品；6.花溪產(chǎn)血人參Fig 3　TLC chromatograms1.I.stachyoides in Liuzhi；2.I.stachyoides in Puan；3.reference substance of reference A；4.mixed references；5.reference substance of epicatechin；6.I.stachyoides in Huaxi

2.4含量測定[12-13]

2.4.1色譜條件色譜柱：ComatexTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μl。色譜見圖4。

表2　梯度脫程序Tab 2　Gradient elution program

圖4　樣品和對照品高效液相色譜比較圖1.表兒茶素；2.對照品AFig 4　Comparison of chromatograms of sample and reference substance1.epicatechin；2.referenceA

2.4.2混合對照品溶液的制備分別取表兒茶素對照品、成分A對照品適量，精密稱定，置于同一10 ml量瓶中，用5%乙腈溶液溶解并定容，搖勻，即得表兒茶素、成分A質(zhì)量濃度分別為0.171 7、0.457 5 mg/ml的混合對照品溶液。

2.4.3供試品溶液的制備稱取樣品5 g，粉碎成粗粉，過40目篩，用80%甲醇125 ml回流提取2 h，冷卻，以80%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，濾過，濃縮得濃稠浸膏。上述濃稠浸膏用適量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得的乙酸乙酯部分用5%乙腈溶液稀釋至25 ml，用0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.4.4線性關(guān)系考察分別精密量取“2.4.2”項下混合對照品溶液0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 μl，按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以表兒茶素、成分A進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得表兒茶素、成分A回歸方程分別為y=7 753.1x+547.65（r=0.999 6）、y=11 552x+ 403.02（r=0.999 4）。結(jié)果表明，表兒茶素、成分A檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.274 5～4.392 0、0.103 0～1.648 3 μg。

2.4.5精密度試驗取“2.4.2”項下對照品溶液適量，按“2.4.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，表兒茶素、成分A峰面積的RSD分別為2.57%、1.77%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.6穩(wěn)定性試驗取“2.4.3”項下供試品溶液（批號：HIS20101023）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h時按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，表兒茶素、成分A峰面積的RSD分別為2.78%、2.25%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.7重復(fù)性試驗精密稱取同一批樣品（批號：HIS20101023）適量，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，表兒茶素、成分A峰面積的RSD分別為1.63%、2.70%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.8加樣回收率試驗取已知含量樣品適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的表兒茶素、成分A，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3　加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Tab 3　Results of recovery tests（n=6）

3　討論

筆者分別考察了80%甲醇回流提取不同時間（設(shè)為2、4、6、8 h）和超聲提取不同時間（設(shè)為15、30、45、60 min）的方法，通過外標(biāo)法分別計算并比較表兒茶素和成分A的含量，結(jié)果表明，以80%甲醇回流2 h時提取效率較高。

本研究表明，血人參藥材的性狀、粉末顯微鑒別、TLC鑒別可作為苗藥血人參的專屬性定性鑒別依據(jù)，可較好地排除混淆品種；同時，本研究建立的血人參中表兒茶素和成分A含量測定方法簡單可行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。綜上，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于苗藥血人參的質(zhì)量控制。

表4　樣品含量測定結(jié)果（n=3，mg/g）Tab 4　Results of contents determination of samples（n=3，mg/g）

［1］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草：第四卷［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：3 233-3 234.

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：下［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2001：2 085-2 089.

［3］貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［M］.貴陽：貴州科技出版社，2003：176.

［4］裘璐，梁妍，唐貴華，等.茸毛木藍(lán)根的化學(xué)成分研究［J］.中成藥，2013，35（2）：320.

［5］Qiu L，Liang Y，Tang GH，et al.Two new flavonols including one flavan dimer from the roots of Indigofera stachyodes［J］.Phytochemistry Letters，2013，6（3）：368.

［6］Li YY，Li CQ，Xu QT，et al.Antioxidant，α-glucosidase inhibitory activities in vitro and alloxan-induced diabetic rats'protective effect of Indigofera stachyodes Lindl.root［J］.J Med Plants Res，2011，5（14）：3 321.

［7］裘璐.苗藥血人參化學(xué)成分及其質(zhì)量控制研究［D］.貴陽：貴陽醫(yī)學(xué)院，2013.

［8］羅曉霞.草果與擬草果的性狀與顯微鑒別［J］.中草藥，2014，37（2）：227.

［9］胡曙晨，馬雪紅，李新霞，等.肉桂子藥材的薄層鑒別方法研究［J］.中藥及天然藥物，2014，29（2）：111.

［10］張學(xué)蘭，徐蘋，李慧芬.焦梔子的薄層鑒別與有效成分含量控制方法研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011，38（2）：335.

［11］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：57.

［12］赫軍，馬秉智，梁瑩瑩，等.HPLC法測定藤梨根中表兒茶素的含量［J］.中國藥房，2016，27（3）：378.

［13］李如標(biāo)，王梅娟.高效液相色譜法測定復(fù)方醋酸地塞米松搽劑中2組分的含量［J］.中國新藥與臨床雜志，2011，30（8）：623.

（編輯：張靜）

Study on the Quality Standard of Miao Medicine Indigofera stachyoides

ZHU Xinyu，LUO Hanchao，HE Maoqiu，HU Zhaoyang，LIANG Yan，HAO Xiaoyan（School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard for Mian medicine Indigofera stachyoides.METHODS：Medicinal properties and microscopic characteristics were identified；TLC was used for the qualitative identification；HPLC was conducted for content determination of epicatechin and 2α，3α-epoxy-5，7，3′，4′-tetra-hydroxy-flavan-（4β→8）-epicatechin（reference A）：the column was Comatex TM C18with mobile phase of acetonitrile-water at a flow rate of 1.0 ml/min，and detection wavelength was 210 nm，column temperature was 30℃，injection volume was 5 μl.RESULTS：It showed clear microscopic identification map.I. stachyoides TLC had clear spots and well separated.The linear range was 0.274 5-4.392 0 μg（r=0.999 6）for epicatechin，and 0.103 0-1.648 3 μg for reference A（r=0.999 4），RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%，recoveries were 99.76%-104.82%（RSD=2.42%，n=6）and 97.98%-104.99%（RSD=2.75%，n=6）respectively.CONCLUSIONS：The established standard can be used for the quality control of I.stachyoides.

Indigofera stachyoides；Pharmacognostic identification；TLC；HPLC；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）27-3829-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.28

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81460640）；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項項目（No.黔科合ZY字〔2013〕3006號）

＊碩士研究生。研究方向：天然藥物化學(xué)。E-mail：zxycs2009@ 126.com

教授。研究方向：天然產(chǎn)物成分分析、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：haoxiaoyan@vip.163.com

（2016-04-06

2016-05-15）