人參皂甙Rb1通過Rho/Rho激酶通路影響低氧誘導(dǎo)大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖及SERT和5-HT1BR表達*

林 碧， 張 瓊， 戴一洳， 葉玉柱， 林琪琪， 陳順利， 林麗娜

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

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人參皂甙Rb1通過Rho/Rho激酶通路影響低氧誘導(dǎo)大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖及SERT和5-HT1BR表達*

林 碧， 張 瓊， 戴一洳， 葉玉柱， 林琪琪， 陳順利， 林麗娜△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

目的： 觀察人參皂甙Rb1對低氧性大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)5-羥色胺轉(zhuǎn)運體(SERT)和5-羥色胺1B受體(5-HT1BR)表達及細胞增殖的影響，并探討Rho/Rho激酶通路在其中的作用。方法: 分離并培養(yǎng)健康雄性SD大鼠PASMCs，隨機分為常氧組(normal組)、低氧組(hypoxia組)以及低氧加50、100和200 mg/L人參皂甙Rb1組(HR50、HR100和HR200組)，采用CCK-8、BrdU結(jié)合流式細胞術(shù)、Western blot及RT-PCR等方法，觀察大鼠PASMCs的增殖程度以及SERT和5-HT1BR的mRNA和蛋白表達變化；另取PASMCs分為normal組、hypoxia組、HR200組和低氧加Y-27632組(HY組)，檢測Rho激酶(ROCK1)mRNA表達和肌球蛋白磷酸酶目標亞單位1(MYPT1)磷酸化水平。 結(jié)果: 與normal組比較，hypoxia組PASMCs增殖明顯(P<0.01)；與hypoxia組比較，人參皂甙Rb1可明顯抑制 PASMCs的增殖(P<0.01)，并濃度依賴性抑制SERT和5-HT1BR的mRNA與蛋白表達(P<0.05);HR200組可明顯抑制ROCK1的mRNA表達和MYPT1磷酸化水平(P<0.01)，與HY組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。結(jié)論: 低氧能誘導(dǎo)大鼠PASMCs增殖，上調(diào)SERT和5-HT1BR表達；人參皂甙Rb1能濃度依賴性抑制這種作用，其機制可能與抑制Rho/Rho激酶通路表達有關(guān)。

人參皂甙Rb1； 低氧； 肺動脈高壓； 5-羥色胺轉(zhuǎn)運體； 5-羥色胺1B受體； Rho激酶

肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)病理性增殖導(dǎo)致的肺血管重建是低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)的重要發(fā)展環(huán)節(jié)[1]。PASMCs表面的5-羥色胺轉(zhuǎn)運體(serotonin transporter，SERT)和5-羥色胺1B受體(5-hydroxytryptamine 1B receptor，5-HT1BR)可通過直接轉(zhuǎn)運或受體結(jié)合的方式，與促有絲分裂因子5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)相結(jié)合，從而激活不同的信號通路促進細胞增殖，而Rho/Rho激酶信號通路在近年來引起了人們的廣泛關(guān)注[2-3]。人參皂甙Rb1(ginsenoside Rb1)能顯著抑制大鼠頸動脈和胸主動脈平滑肌的增生及炎癥反應(yīng)[4-5]。并通過抑制ERK1/2通路緩解肺動脈高壓的進展[6]。但是它對低氧性肺動脈平滑肌細胞表面的SERT、5-HT1BR以及Rho激酶的表達是否有影響尚無研究。本實驗通過人參皂甙Rb1對低氧環(huán)境下PASMCs的干預(yù)，探索SERT、5-HT1BR以及Rho/Rho激酶信號通路對低氧肺動脈高壓中肺血管重建的作用及機制，為人參皂甙Rb1在肺動脈高壓的預(yù)防和治療方面提供新理論。

材 料 和 方 法

1 動物和主要試劑

SPF級健康雄性SD大鼠15 只，體重180～220 g，購于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

高糖 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和青-鏈霉素(Gibco)；臺盼藍和膠原酶I(Sigma)；人參皂甙Rb1(上海同田生物)；FastQuant RT Kit(北京天根生化)；Cell Counting Kit-8試劑盒(Dojindo)；APC-BrdU細胞增殖試劑盒(南京凱基生物)；BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo)；TRIzol試劑盒(Invitrogen)；α-平滑肌肌動蛋白 (α-smooth muscle actin, α-SMA)小鼠單克隆抗體、FITC標記的羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊II抗IgG和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠 II 抗IgG(Abcam)；SERT小鼠抗大鼠單克隆抗體IgG和5-HT1BR 山羊抗大鼠多克隆抗體IgG(Santa Cruz);肌球蛋白磷酸酶目標亞單位1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1)和磷酸化MYPT1(p-MYPT1)兔抗大鼠多克隆抗體IgG(Cell Signaling Technology)。引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成。

2 主要方法

2.1 細胞分離、培養(yǎng) 大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死，解剖顯微鏡直視下取2～4 級肺動脈，去內(nèi)外膜剪成5 mm×5 mm大小的組織塊，用0.2%膠原酶Ⅰ消化30 min，離心并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。當(dāng)PASMCs生長至培養(yǎng)瓶80%～90%時，用胰蛋白酶消化細胞進行傳代培養(yǎng)，取第4～6代的細胞用于實驗。

2.2 細胞鑒定 倒置相差顯微鏡觀察PASMCs形態(tài)并攝片，激光共聚焦免疫熒光染色法鑒定細胞，采用α-SMA單克隆抗體(稀釋度1∶100)，4 ℃過夜后滴加FITC標記羊抗小鼠(稀釋度1∶200)孵育。滴加DAPI核染液(1 mg/L)，室溫避光3～5 min，在激光共聚焦顯微鏡下以同一視野不同激發(fā)波長觀察攝片，其中FITC的激發(fā)波長488 nm，發(fā)射光峰值630 nm；DAPI的激發(fā)波長488 nm，發(fā)射光峰值358 nm。

2.3 分組與處理 取第4～6代生長良好的對數(shù)生長期 PASMCs，胰酶消化至細胞懸液，按5×108/L 的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，加入含 10%胎牛血清的 DMEM高糖培養(yǎng)基，置于 37 ℃、5% CO2普通培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待融合成單層細胞時(約80%鋪滿)換成無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，使細胞同步化。進行隨機分組。第1部分實驗分為 常氧組(normal組: 37 ℃、21% O2、5% CO2)、低氧組(hypoxia組：37 ℃、3% O2、5% CO2)和低氧加人參皂甙Rb1(50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L)組(HR50、HR100和HR200組)，孵育24 h；第2部分實驗分為常氧組(normal組： 37 ℃、21% O2、5%CO2)、低氧組(hypoxia組：37 ℃、3% O2、5% CO2)、低氧加人參皂甙Rb1 200 mg/L組(HR組)和低氧加Y-27632 10 μmol/L組(HY組)。

2.4 CCK-8法檢測細胞活力 PASMCs 以5×107/L接種于96孔板，培養(yǎng)至鋪滿孔底面積80%～90%，PBS清洗后加DMEM同步化24 h；根據(jù)實驗設(shè)計進行分組干預(yù)，每組設(shè)置6孔，并設(shè)空白組，培養(yǎng)24 h。取出96孔板，PBS清洗各組細胞，分別按每孔培養(yǎng)基總體積的10% 加入CCK-8試劑，在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm波長下檢測各孔的吸光度(A)值。

2.5 BrdU-APC法檢測細胞增殖程度 各組細胞中加入BrdU至終濃度為30 μmol/L，孵育30 min，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗，胰酶消化10 min，按照APC-BrdU細胞增殖檢測試劑盒說明書步驟，進行細胞收集、固定、通透、DNA變性及BrdU標記，上流式細胞儀檢測(488 nm激發(fā)波長，520 nm發(fā)射波長)。

2.6 半定量RT-PCR法檢測PASMCs SERT、5-HT1BR和ROCK1的mRNA表達 各組細胞用TRIzol一步法抽提總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟，合成cDNA，測A260值。用PCR擴增目的片段。SERT的上游引物序列為5’-CCA CCT TCC CAT ACA TTG TCC TC -3’，下游引物序列為5’-TCT ACC CAC ACC CCT GTC TCC A-3’，PCR產(chǎn)物為130 bp；擴增條件為： 95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min, 64.7 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 72 ℃ 10 min，共35個循環(huán)。5-HT1BR的上游引物序列為5’-GCC CAG TTG ATA ACA GAC TCT CCA G -3’，下游引物序列為5’-GAG ACT CGC ACT TTG ACT TGG TTC-3’， PCR產(chǎn)物為125 bp； ROCK1的上游引物序列為5’-TTA TGA AGT AGT AAA GGT AAT CGG C-3’,下游引物序列為5’-AGG TAT TCC AAC TGC TGT ATC-3’， PCR產(chǎn)物為 490 bp；擴增條件為: 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s, 54.7 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)；β-actin的上游引物序列為5’-CGT TGA CAT CCG TAA AGA C-3’，下游引物序列為5’-TGG AAG GTG GAC AGT GAG-3’， PCR產(chǎn)物為201 bp；擴增條件為： 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s, 63.0 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 72 ℃ 5 min，共30個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙錠 0.5 g/L)，在UV-800凝膠成像分析系統(tǒng)紫外燈下觀察結(jié)果并拍攝，以目的條帶平均灰度值與β-actin的平均灰度值比值來表示目的mRNA表達的相對強度。

2.7 Western blot法檢測PASMCs SERT、5-HT1BR和ROCK1的蛋白含量 加入細胞裂解液100 μL，冰上裂解30～50 min，12 000 r/min，4 ℃ 離心20 min，取上清液以BCA法測定蛋白濃度。用10% SDS-PAGE分離蛋白，再經(jīng)濕轉(zhuǎn)(300 mA，70 min)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入小鼠抗大鼠SERT(1∶500)、山羊抗大鼠5-HT1BR(1∶500)、兔抗大鼠p-MYPT1(1∶500)、兔抗大鼠MYPT1(1∶500)和兔抗大鼠GAPDH(1∶1 000)，4℃孵育過夜。兔抗山羊 II 抗(1∶10 000)、山羊抗小鼠 II 抗(1∶15 000)和山羊抗兔II抗(1∶10 000)孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光法覆蓋條帶，全自動曝光機曝光。Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)測定各目的條帶的平均灰度值，以SERT和5-HT1BR與GAPDH的灰度值比值表示相對含量。p-MYPT1/MYPT1表示MYPT1的活性。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料進行正態(tài)性檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊則采用Bonferroni校正的t檢驗進行兩兩比較，方差不齊者采用Dunnett’s檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 激光共聚焦免疫熒光法鑒定PASMCs

原代PASMCs培養(yǎng)48～72 h后，可在Olympus倒置相差顯微鏡下觀察到細胞呈長梭形或三角形生長，大小不一，重疊交織排鋪。培養(yǎng)至5～7 d，培養(yǎng)皿內(nèi)細胞密度低處呈網(wǎng)格狀，密度高處呈柵欄狀，呈現(xiàn)出平滑肌細胞特有的“峰 -谷”狀生長，見圖1。培養(yǎng)至第4～6代的PASMCs經(jīng)α-SMA單克隆抗體孵育、FITC標記的 II抗染色、DAPI細胞核復(fù)染后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，98%的PASMCs表達陽性。FITC標記的α-SMA呈現(xiàn)綠色熒光，以纖維細絲狀排列；DAPI染色的細胞核呈卵圓形，發(fā)藍色熒光，見圖2。

Figure 1.Primary culture of rat PASMCs (×100).

圖1 大鼠原代培養(yǎng)肺動脈平滑肌細胞

Figure 2.Immunofluorescence identification of rat PASMCs [α-smooth muscle actin (α-SMA) immunofluorescence staining, ×400)].

圖2 大鼠肺動脈平滑肌細胞α-平滑肌肌動蛋白免疫熒光染色

2 不同濃度人參皂甙Rb1對低氧PASMCs活力的影響

CCK-8法結(jié)果顯示，與normal組比較，hypoxia組細胞活力明顯增加(P<0.01)。HR50組、HR100組和HR200組呈濃度依賴性抑制PASMCs的細胞活力，其對低氧PASMCs的抑制率分別為13.2%、19.0%和24.2%，且HR200組與HR50組比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。Y-27632組對低氧PASMCs的抑制率為27.0%，見圖3。

3 各組PAMSCs BrdU陽性細胞數(shù)的變化

通過流式細胞術(shù)檢測，各組細胞均可檢測到BrdU陽性細胞。相比normal組，hypoxia組BrdU陽性細胞比例明顯增高(P<0.01)。HR50組、HR100組、HR200組和HY組的BrdU陽性細胞比例依次降低，且HR200組與HR50組比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖4。

4 各組PASMCs SERT、5-HT1BR和ROCK1 mRNA的表達變化

與normal組比較，hypoxia組的SERT、5-HT1BR和ROCK1 mRNA表達均升高(P<0.01)；與hypoxia組比較，HR組的SERT和5-HT1BR mRNA表達均明顯下調(diào) (P<0.01)；且與HR50組比較，HR100和HR200組的SERT 和5-HT1BR mRNA表達均顯著降低(P<0.01)。HR200組的ROCK1 mRNA表達比hypoxia組明顯下降，但與HY組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖5。

Figure 3.The changes of cell viability in all groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vshypoxia group;△P<0.05vsHR50 group.

圖3 各組細胞活力的比較

Figure 4.The changes of BrdU positive cells in all groups. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vshypoxia group;△P<0.05vsHR50 group.

圖4 各組BrdU陽性細胞比例的比較

5 各組PASMCs SERT和5-HT1BR蛋白表達及MYPT1磷酸化水平的變化

與normal組比較，hypoxia組的SERT和5-HT1BR 蛋白表達量明顯升高(P<0.05)。與hypoxia組比較，HR組的SERT和5-HT1BR 蛋白表達均明顯下調(diào) (P<0.01)；與HR50組比較，HR100組和HR200組的SERT和5-HT1BR蛋白表達均顯著降低(P<0.01)。HR200組的MYPT1磷酸化水平比hypoxia組明顯下降，但與HY組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖6。

討 論

缺氧性血管收縮和肺血管結(jié)構(gòu)重建是肺動脈高壓形成的重要因素，而由肺動脈平滑肌細胞增殖、遷移以及細胞外基質(zhì)異常沉積是肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)的基礎(chǔ)，也是肺動脈高壓形成的中心環(huán)節(jié)。在低氧環(huán)境，血小板對具有血管活性和促有絲分裂作用的5-HT釋放增加，并且5-HT的再攝取和被單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)降解的過程受到抑制。PASMCs表面的SERT和5-HT1BR與5-HT相結(jié)合，誘發(fā)細胞內(nèi)一系列相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，調(diào)節(jié)PASMCs的增殖和收縮，參與肺動脈高壓的形成。缺氧可使低氧誘導(dǎo)因子-1、c-Jun和c-Fos表達大量增加，并與SERT基因啟動序列的2個激活蛋白-1位點相結(jié)合而介導(dǎo)SERT的表達[7]，繼而活化蛋白酪氨酸激酶使核苷酸交換因子轉(zhuǎn)移到細胞膜，Ras蛋白轉(zhuǎn)化為活性形式Ras-GTP后激活下游信號促進細胞增殖[8]。低氧刺激下PASMCs的5-HT1BR表達增加且受體密度也明顯增高[9]，可能通過G蛋白偶聯(lián)抑制腺苷酸環(huán)化酶活性使cAMP生成減少，誘發(fā)DNA合成和細胞增殖[10]。

Figure 5.The changes of SERT, 5-HT1BR and ROCK1 mRNA expression in the PASMCs with different treatments. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vshypoxia group;△P<0.05,△△P<0.01vsHR50 group.

圖5 各組PASMCs SERT、5-HT1BR和ROCK1 mRNA的表達

Figure 6.The changes of SERT, 5-HT1BR and p-MYPT1 protein levels in the PASMCs with different treatments. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal group;##P<0.01vshypoxia group;△△P<0.01vsHR50 group.

圖6 各組PASMCs SERT、5-HT1BR和p-MYPT1蛋白水平的比較

本實驗顯示，PASMCs在低氧培養(yǎng)24 h后迅速增殖，SERT和5-HT1BR的mRNA及蛋白表達也均較常氧組明顯增加，經(jīng)不同濃度人參皂甙Rb1處理后，無論是細胞增殖情況還是SERT和5-HT1BR的mRNA及蛋白表達水平均呈濃度依賴性下調(diào)，其中以200 mg/L濃度抑制效果最佳。這說明人參皂甙Rb1可能通過抑制SERT和5-HT1BR的表達，緩解PASMCs的增殖。人參皂甙Rb1是人參、三七等傳統(tǒng)中藥的主要藥理活性成分，對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等方面有良好的保護作用，同時也是一類重要的植物雌激素，它可通過特異性與雌激素受體-β結(jié)合發(fā)揮抗血管平滑肌細胞增殖和抗炎的作用[5]。研究表明，卵巢切除的恒河猴經(jīng)雌激素干預(yù)后，SERT mRNA在中縫核的表達水平明顯下降[11]，雌二醇處理后的大鼠海馬區(qū)SERT的結(jié)合位點顯著降低[12]。Hiroi等[13]也發(fā)現(xiàn)，雌激素可選擇性降低大鼠中縫背核區(qū)域5-HT1BR的mRNA表達。

人參皂甙Rb1抑制SERT和5-HT1BR表達及PASMCs增殖，從而改善HPH的機制尚不清楚。近年來研究表明，Rho/Rho激酶信號通路在HPV發(fā)展中起到重要作用。RhoA是Ras單體GTP酶超家族的一員，在外界信號刺激下，RhoA由失活的GDP 結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)化為活化的GTP 結(jié)合狀態(tài), 并將信號傳遞給下游效應(yīng)分子Rho激酶(ROCK)?；罨腞OCK通過磷酸化肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)的亞單位MYPT1，抑制MLCP活性從而增強肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化。胞漿磷酸化MLC水平上升，引起細胞肌動蛋白微絲骨架聚合狀態(tài)改變，影響細胞的移動、黏附、增殖、基因表達等。因此MYPT1磷酸化水平代表了ROCK的活化程度。而ROCK特異性抑制劑Y-27632可增加停留在G0/G1期的血管平滑肌細胞的相對百分數(shù)[14]，降低低氧誘導(dǎo)的右室肥厚，逆轉(zhuǎn)血管重建[15]。本實驗結(jié)果顯示低氧明顯誘導(dǎo)了ROCK1的mRNA表達，MYPT1磷酸化水平相應(yīng)上升，同時PASMCs增殖明顯。應(yīng)用200mg/L的人參皂甙Rb1干預(yù)后，無論是ROCK1 mRNA還是p-MYPT1水平均顯著下降，并有效抑制了大鼠PASMCs的增殖，且抑制程度與Y-27632比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性。說明Rho/Rho激酶信號通路在低氧誘導(dǎo)的大鼠PASMCs增殖中發(fā)揮重要作用，而人參皂甙Rb1減輕大鼠PASMCs增殖，很有可能與抑制Rho/Rho激酶信號通路有關(guān)。Oka等[16]發(fā)現(xiàn)無論處于短時還是長期缺氧狀態(tài)，大鼠肺組織p-MYPT1水平均上升。缺氧環(huán)境中大鼠PASMCs的MLC磷酸化水平持續(xù)升高，且與Rho激酶活化有關(guān)[17]。PAH患者的肺組織、血小板、PASMCs的RhoA/ROCK活性亦明顯上升，ROCK能通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白的表達或活性，調(diào)節(jié)細胞周期，促進細胞增殖[18]。

通過本實驗，發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rb1可降低低氧性大鼠PASMCs SERT和5-HT1BR的mRNA和蛋白表達，進而降低Rho/Rho激酶關(guān)鍵蛋白MYPT1的磷酸化水平，從而抑制肺動脈平滑肌細胞的增殖。但從Rho激酶活化到抑制細胞增殖過程中是否還存在其它重要信號蛋白，仍需深入研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of ginsenoside Rb1 on proliferation and serotonin transporter and 5-HT1BR expression in hypoxia-induced rat pulmonary artery smooth muscle cells via Rho/Rho-kinase pathway

LIN Bi, ZHANG Qiong, DAI Yi-ru, YE Yu-zhu, LIN Qi-qi, CHEN Shun-li, LIN Li-na

(TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:wzlinlina@163.com)

AIM: To observe the effect of ginsenoside Rb1 on the proliferation and the expression of serotonin transporter (SERT), 5-hydroxytryptamine 1B receptor (5-HT1BR) in rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) under hypoxia condition and the relationship with Rho/Rho-kinase signal pathway. METHODS: PASMCs were isolated from the adult male SD rats and primarily cultured. The subcultured cells from the 4th generation to the 6th generation were harvested and divided into normal group, and hypoxia group, different concentrations of Rb1 incubation groups treated with 50, 100 and 200 mg/L ginsenoside Rb1 under hypoxia (HR50, HR100 and HR200 groups, respectively). The viability of the PASMCs was measured by CCK-8 assay. BrdU positive cells were determined using flow cytometry. The expression of serotonin transporter and 5-HT1BR at mRNA and protein levels was detected by RT-PCR and Western blot, respectively. The PASMCs were randomly divided into normal group, hypoxia group, HR200 group and hypoxia+Y-27632 incubation group (HY group). The mRNA expression of Rho-kinase and phosphorylated myosin phosphatase target subunit 1 (p-MYPT1) protein level were investigated by RT-PCR and Western blot, respectively. RESULTS: Compared with normal group, the proliferation of PASMCs in hypoxia group was significantly increased (P<0.01). The cell viability and the expression of SERT and 5-HT1BR at mRNA and protein levels in all different concentrations of Rb1 groups were obviously decreased compared with hypoxia group (P<0.05). The mRNA expression of Rho-kinase and protein level of p-MYPT1 were markedly decreased in HR200 group, and no significant difference compared with HY group was observed (P<0.01). CONCLUSION: Treatment with ginsenoside Rb1 might prevent hypoxia-induced proliferation of PASMCs and over-expression of SERT and 5-HT1BR through inhibiting the Rho/Rho-kinase pathway.

Ginsenoside Rb1; Hypoxia; Pulmonary hypertension; Serotonin transporter; 5-hydroxytryptamine 1B receptor; Rho-kinase

1000- 4718(2016)10- 1848- 06

2016- 05- 30

2016- 08- 18

浙江省中醫(yī)藥科技計劃重點項目(No. 2008ZA017)

△通訊作者 Tel: 0577-55579097; E-mail: wzlinlina@163.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.018

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