CIP2A過表達(dá)對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張海云， 常香榮

(陜西省康復(fù)醫(yī)院消化內(nèi)科， 陜西 西安 710065)

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CIP2A過表達(dá)對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張海云， 常香榮△

(陜西省康復(fù)醫(yī)院消化內(nèi)科， 陜西 西安 710065)

目的： 探究蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)過表達(dá)對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1增殖和凋亡的影響。方法: RT-qPCR檢測(cè)正常胃黏膜組織和胃息肉組織中CIP2A和cyclin D1的表達(dá)。將胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞分為空白對(duì)照組、空載體對(duì)照組和CIP2A過表達(dá)組，分組感染GES-1細(xì)胞后，分別用MTT法和BrdU試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，Western blot法和RT-qPCR檢測(cè)凋亡蛋白的表達(dá)，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清炎性因子的濃度。用E2F1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)各組細(xì)胞中p-Rb、E2F1和cyclin D1的蛋白水平。結(jié)果: 與正常胃黏膜組織相比，腺瘤性胃息肉組織中CIP2A和cyclin D1的mRNA表達(dá)水平均明顯升高，而增生性胃息肉中CIP2A和cyclin D1的水平并無明顯變化。GES-1細(xì)胞感染CIP2A過表達(dá)重組腺病毒之后，細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞活力提高，細(xì)胞凋亡率降低，炎性因子IL-1β和IL-10分泌增加，p-Rb、E2F1和cyclin D1蛋白水平升高，而E2F1沉默降低p-Rb、E2F1和cyclin D1的蛋白水平。結(jié)論: CIP2A通過激活Rb/E2F1促進(jìn)GES-1細(xì)胞的增殖并抑制凋亡。

蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子; 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞凋亡

胃息肉起源于胃黏膜或黏膜下層，是突出于胃腔的良性隆起性病變，可分為增生性息肉和腺瘤性息肉，其中腺瘤性息肉具有潛在的惡變傾向[1]。胃息肉的發(fā)生與幽門螺桿菌的感染以及胃黏膜損傷密切相關(guān)[2]。蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A)是新發(fā)現(xiàn)的一種致癌因子，可通過抑制c-Myc蛋白水解，穩(wěn)定c-Myc蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖[3]。近年來，許多研究表明，胃息肉是胃癌發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)，然而胃息肉惡變的發(fā)生機(jī)制還尚未有明確的報(bào)道。因此，本文通過檢測(cè)CIP2A在腺瘤性胃息肉中的異常表達(dá)，進(jìn)一步探究其過表達(dá)對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、炎性因子、p-Rb/E2F1表達(dá)等的影響，旨在研究CIP2A過表達(dá)對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。重組腺病毒(Ad-emp和Ad-CIP2A)由本實(shí)驗(yàn)室參考文獻(xiàn)構(gòu)建并擴(kuò)增[4]。E2F1 siRNA(上海生工生物工程公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Gemini)；MTT、二甲基亞砜(DMSO)、BrdU細(xì)胞增殖試劑盒、抗CIP2A、p-Rb、E2F1和cyclin D1多克隆抗體(Sigma)；BCA試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(碧云天)。流式細(xì)胞儀(BD)；Tanon EPS-300電泳儀(上海天能科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 正常胃黏膜以及胃息肉組織的選取 標(biāo)本取自2012年9月至2014年3月陜西省康復(fù)醫(yī)院消化內(nèi)科60例，分為腺瘤性息肉組20例，其中男性4例，女性16例，年齡43～51歲；增生性息肉組20例，其中男性12例，女性8例，年齡31～45歲；正常胃黏膜組20例，其中男性7例，女性13例，年齡32～48歲(均以腹脹、中上腹不適為主要癥狀就診，就診4周內(nèi)均未服用質(zhì)子泵抑制劑、非甾體類抗炎藥，無飲酒史)；組織均置于-80 ℃冰箱保存，用于提取RNA。

2.2 胃黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及感染 胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。將GES-1細(xì)胞以1×104/cm2接種于24孔培養(yǎng)板中(內(nèi)含有玻片)培養(yǎng)。將細(xì)胞分為3組，空白對(duì)照組(control組)、陰性對(duì)照組(Ad-emp組)和CIP2A過表達(dá)組(Ad-CIP2A組)。次日，按分組感染細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)MOI=100，病毒滴度均約為2×1010PFU/L)，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為不含雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液。完成操作后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞感染情況。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) TRIzol法分別提取正常胃黏膜和胃息肉組織的總RNA，并檢測(cè)其純度以及完整性。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書生成cDNA，擴(kuò)增cDNA，CIP2A和cyclin D1擴(kuò)增成功后，CIP2A和cyclin D1的mRNA水平采用比較Ct值法(2-ΔΔCt)進(jìn)行定量分析。引物由上海生工生物工程公司合成。

取對(duì)數(shù)生長期的GES-1細(xì)胞，分為control組、Ad-emp組、Ad-CIP2A組和Ad-CIP2A+E2F1 siRNA 組，按分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按照上述方法分析p-Rb、E2F1和cyclin D1的mRNA表達(dá)水平。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 按實(shí)驗(yàn)分組感染細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種至96孔板內(nèi)，24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，孵育4 h，棄上清液，加入100 μL DMSO，振蕩后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值(A490)。

2.5 BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 按實(shí)驗(yàn)分組感染細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種至96孔板內(nèi)，24 h后進(jìn)行BrdU檢測(cè)。按照BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的步驟進(jìn)行操作。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按實(shí)驗(yàn)分組感染細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒參照說明書操作，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.7 ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液細(xì)胞炎性因子的含量 按實(shí)驗(yàn)分組感染細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，吸取培養(yǎng)上清液用于細(xì)胞因子的測(cè)定，按照ELISA試劑盒操作步驟，測(cè)定培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-10的水平。

2.8 免疫蛋白印跡法檢測(cè)cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2和Bax的蛋白水平 按實(shí)驗(yàn)分組感染細(xì)胞，48 h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃下用抗cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2、Bax、p-Rb、E2F1和cyclinD1的 I 抗(均為1∶300)孵育過夜，PBST洗膜3次，II 抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，最后用ECL發(fā)光液在暗室曝光并壓片。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腺瘤性胃息肉組織中CIP2A與cyclin D1的mRNA表達(dá)上調(diào)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常胃黏膜相比，增生性胃息肉組織中的CIP2A與細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的mRNA水平差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而腺瘤性息肉組織中CIP2A與cyclin D1的水平均顯著上升(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of CIP2A (A) and cyclin D1 (B) in the tissues of normal gastric mucosa, hyperplastic gastric polyps (HGPs) and adenomatous gastric polyps (AGPs). Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol.

圖1 正常胃黏膜、增生性胃息肉和腺瘤性胃息肉組織中CIP2A與cyclin D1的mRNA水平

2 CIP2A過表達(dá)促進(jìn)GES-1細(xì)胞增殖

經(jīng)腺病毒感染細(xì)胞后，與空白對(duì)照組比較，過表達(dá)組細(xì)胞CIP2A的mRNA表達(dá)量增加(6.51±0.17)倍，而陰性對(duì)照組細(xì)胞CIP2A的mRNA表達(dá)量無明顯改變。RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CIP2A過表達(dá)顯著提高了細(xì)胞中周期蛋白cyclin D1的mRNA表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CIP2A過表達(dá)組的細(xì)胞活力明顯上升。BrdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)果表明CIP2A過表達(dá)促進(jìn)GES-1細(xì)胞的增殖(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The viability of the GES-1 cells after transfected with CIP2A. A, B: the relative mRNA expression levels; C: the results of MTT assay; D: the results of BrdU assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2 CIP2A過表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞增殖的影響

3 CIP2A過表達(dá)抑制GES-1細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CIP2A過表達(dá)使GES-1細(xì)胞的凋亡率明顯降低，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CIP2A過表達(dá)顯著降低了細(xì)胞中凋亡蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白水平，并且升高了Bcl-2/Bax的比值(P<0.05)。結(jié)果表明，CIP2A過表達(dá)抑制GES-1細(xì)胞凋亡,見圖3。

Figure 3.The apoptosis of the GES-1 cells after transfected with CIP2A. A： apoptosis detected by flow cytometry; B: apoptosis-rela-ted protein expression detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖3 CIP2A過表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞凋亡的影響

4 CIP2A過表達(dá)促進(jìn)GES-1細(xì)胞中炎性因子的分泌

ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CIP2A過表達(dá)使GES-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-1β和IL-10含量顯著上升(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.The levels of inflammatory cytokines in the culture supernatants of the GES-1 cells transfected with CIP2A. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖4 CIP2A過表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞中炎性因子的影響

5 CIP2A過表達(dá)促進(jìn)Rb/E2F1通路相關(guān)分子的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CIP2A過表達(dá)使GES-1細(xì)胞內(nèi)p-Rb、E2F1和cyclin D1的蛋白水平都顯著上升。而用E2F1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞之后，p-Rb、E2F1和cyclin D1的蛋白水平又顯著降低(P<0.01)。RT-qPCR結(jié)果與Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,表明CIP2A可能通過激活Rb/E2F1通路調(diào)節(jié)GES-1細(xì)胞的增殖和凋亡，見圖5。

討 論

胃息肉是胃癌的癌前疾病之一，其中腺瘤性息肉較增生性息肉有較高的癌變率[5]。目前的研究認(rèn)為，胃黏膜長期慢性炎癥是腺瘤性胃息肉常發(fā)生的基礎(chǔ)，炎癥引起的細(xì)胞增殖與凋亡平衡的失調(diào)是腺瘤性胃息肉發(fā)展、惡變的重要原因。CIP2A是一種新近發(fā)現(xiàn)的蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的內(nèi)源性抑制劑[6]。CIP2A通過增強(qiáng)c-Myc的穩(wěn)定性，抑制體內(nèi)PP2A的抑癌作用，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤生長[3]。有研究表明CIP2A蛋白在慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的陽性表達(dá)率均高于正常胃黏膜[7]，但其是否在胃息肉惡變中發(fā)揮作用尚未有明確報(bào)道。本研究結(jié)果證明，與正常胃黏膜組織相比，增生性胃息肉組織中CIP2A表達(dá)并無顯著差異，而腺瘤性胃息肉組織中的CIP2A mRNA水平顯著上升，表明CIP2A可能在胃息肉癌變過程中起了重要的作用。

Figure 5.The effect of CIP2A on the protein levels of p-Rb, E2F1 and cyclin D1 in the GES-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-CIP2A group.

圖5 CIP2A過表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞p-Rb、E2F1和cyclinD1蛋白水平的影響

在多種人類惡性腫瘤中CIP2A均呈現(xiàn)高表達(dá)[8-9]，與腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡密切相關(guān)[10]。有研究證明，CIP2A基因的沉默使喉癌Hep-2細(xì)胞生長曲線平坦，增殖指數(shù)降低，并且將細(xì)胞周期阻滯在G1期。另外，CIP2A被發(fā)現(xiàn)在白血病中過表達(dá)，并促進(jìn)人原髓白血病細(xì)胞HL60的增殖和分化[11]。本研究結(jié)果證明，CIP2A過表達(dá)的GES-1細(xì)胞增殖活性明顯上升，細(xì)胞早期凋亡率與晚期凋亡率均顯著降低。Cyclin D1作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，可控制細(xì)胞周期素依賴激酶對(duì)蛋白磷酸化作用的能力，從而加速細(xì)胞G1-S期進(jìn)程。研究證明，隨著胃黏膜病理變化的加重，cyclin D1的表達(dá)逐漸上調(diào)[12-13]。正是cyclin D1的過度表達(dá)促使細(xì)胞過度增殖，進(jìn)而使細(xì)胞增殖失控從而發(fā)生惡變。本研究結(jié)果證明，與正常胃黏膜組織相比，腺瘤性胃息肉組織中cyclin D1表達(dá)顯著上升。

胃黏膜炎癥反應(yīng)與胃息肉的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，胃息肉患者中幽門螺桿菌感染率為58%[14]。IL-1β通過上調(diào)COX-2的表達(dá)水平促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞增殖，并抑制幽門螺桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，CIP2A過表達(dá)的GES-1細(xì)胞中IL-1β與IL-10的水平明顯升高，由此，炎癥反應(yīng)也與CIP2A對(duì)GES-1細(xì)胞的促增殖作用相關(guān)。

Rb基因家族處于細(xì)胞周期調(diào)控的中心環(huán)節(jié)，在細(xì)胞生長和分化的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[16]。E2F1作為重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，與Rb一起參與調(diào)控細(xì)胞由G0/G1期向S期的過渡[17]。Rb/E2F1途徑通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期在食管癌的發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[18]。研究表明，E2F1與CIP2A之間的反饋調(diào)節(jié)回路為p53和Rb缺失的癌細(xì)胞提供了治療方法[19]。沉默CIP2A可抑制人乳頭瘤病毒E7蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，而過表達(dá)E2F1處理使細(xì)胞增殖活性顯著升高[20]。因此，E2F1是CIP2A發(fā)揮促進(jìn)增殖作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究表明，CIP2A過表達(dá)促進(jìn)Rb磷酸化和E2F1、cyclin D1的表達(dá)，而沉默E2F1則抑制了CIP2A的作用，由此推斷，Rb/E2F1通路可能參與CIP2A調(diào)節(jié)GES-1細(xì)胞增殖和凋亡的過程。

綜上所述，本研究通過將CIP2A過表達(dá)重組腺病毒轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CIP2A可通過激活Rb/E2F1通路、促進(jìn)IL-1β和IL-10的分泌，上調(diào)周期蛋白cyclin D1水平，促進(jìn)GES-1細(xì)胞增殖并抑制凋亡。文章通過研究CIP2A過表達(dá)對(duì)GES-1細(xì)胞的影響，闡明了CIP2A誘導(dǎo)腺瘤性胃息肉發(fā)生的相關(guān)機(jī)制，有利于進(jìn)一步研究揭示胃息肉惡變過程中的分子生物學(xué)機(jī)制。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of CIP2A over-expression on proliferation and apoptosis of gastric epithelial cells

ZHANG Hai-yun, CHANG Xiang-rong

(DepartmentofGastroenterology,ShaanxiKangfuHospital,Xi’an710065,China.E-mail:fangjiezhengzhou@163.com)

AIM: To investigate the effects of cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A (CIP2A) over-expression on the proliferation and apoptosis of gastric epithelial cells. METHODS: The mRNA expression of CIP2A and cyclin D1 in the tissues of normal gastric mucosa and gastric polyps was detected by RT-qPCR. The GES-1 cells were divided into control group, Ad-emp group and Ad-CIP2A group. The cell proliferation ability was detected by MTT assay and BrdU assay, and the cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The expression of apoptosis-related molecules was determined by Western blot and RT-qPCR. The levels of inflammatory cytokines were measured by ELISA after GES-1 cells were infected with Ad-emp and Ad-CIP2A. Furthermore, the protein levels of p-Rb, E2F1 and cyclin D1 in the GES-1 cells was determined by Western blot after transfected withE2F1 siRNA. RESULTS: The expression of CIP2A and cyclin D1 in adenomatous gastric polyps tissues was significantly higher than that in normal gastric mucosa tissues, and no significant change of that between hyperplastic gastric polyps tissues and normal gastric mucosa was observed. After transfected with CIP2A, the proliferation ability of GES-1 cells was increased, the cell apoptosis was inhibited, the concentrations of IL-1β and IL-10 was up-regulated and the protein levels of p-Rb, E2F1 and cyclin D1 were increased, while the protein levels of p-Rb, E2F1 and cyclin D1 were significantly decreased after transfected withE2F1 siRNA. CONCLUSION: CIP2A promotes the proliferation and inhibits the apoptosis of GES-1 cells by activating Rb/E2F1.

Cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A; Cell proliferation; Apoptosis

1000- 4718(2016)10- 1881- 06

2016- 05- 13

2016- 07- 15

△通訊作者 Tel: 029-86673458; E-mail： fangjiezhengzhou@163.com

R573; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.023

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