高原紅細胞增多癥模型大鼠骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2表達的相關(guān)性*

劉 芳， 魏 巍， 冀林華， 馮婷婷， 王樹林， 施繼禹

(青海大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室， 2附屬醫(yī)院血液科，青海 西寧 810001)

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高原紅細胞增多癥模型大鼠骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2表達的相關(guān)性*

劉 芳1△， 魏 巍2， 冀林華2， 馮婷婷2， 王樹林1， 施繼禹1

(青海大學(xué)1醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，2附屬醫(yī)院血液科，青海 西寧 810001)

目的： 探討高原紅細胞增多癥(HAPC)模型大鼠骨髓CD71+細胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和GATA-2表達的相關(guān)性。方法: 雄性SD大鼠48只，隨機分為對照組和HAPC模型組。在海拔4 300 m自然環(huán)境下復(fù)制HAPC模型并采用骨髓涂片、骨髓細胞分類計數(shù)和血液學(xué)參數(shù)檢測進行驗證。流式細胞術(shù)檢測骨髓CD71+細胞數(shù)量相對變化趨勢；RT-qPCR和Western blot法檢測GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達變化，低氧培養(yǎng)CD71+細胞，篩選最佳干擾序列GATA-1 shRNA1后，轉(zhuǎn)染96 h，RT-qPCR和Western blot法檢測GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果: 骨髓細胞分類計數(shù)、涂片及血液學(xué)參數(shù)檢測結(jié)果顯示，HAPC大鼠模型復(fù)制成功。與對照組比較，HAPC模型組骨髓CD71+細胞明顯增多，骨髓CD71+細胞GATA-1 的mRNA和蛋白表達增高，GATA-2的mRNA和蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。對照組GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達呈負相關(guān)，HAPC模型組GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達無顯著相關(guān)性。GATA-1 shRNA1干擾96 h后，GATA-1的mRNA和蛋白表達低于對照組，但是GATA-2的mRNA和蛋白表達變化差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。結(jié)論: HAPC大鼠骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2表達異常，兩者的負相關(guān)關(guān)系改變可能是導(dǎo)致HAPC發(fā)生的機制之一。

高原紅細胞增多癥； 轉(zhuǎn)錄因子； GATA-1； GATA-2

成熟紅細胞執(zhí)行生物體內(nèi)氧氣運輸功能。其產(chǎn)生經(jīng)歷造血干細胞至紅系祖細胞的早期分化階段和紅系祖細胞至成熟紅細胞的終末分化階段，是眾多轉(zhuǎn)錄因子參與的多步驟有序調(diào)控過程。這些轉(zhuǎn)錄因子為階段性表達，它們既相互作用又呈現(xiàn)其特異性。GATA家族是具有保守鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，能夠特異地結(jié)合基因啟動子區(qū)的(A/T)GATA(A/G)序列[1-2]，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與造血、神經(jīng)等不同系統(tǒng)的發(fā)育。GATA-2和GATA-1同屬于GATA家族，是紅細胞生成不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子。GATA-2表達于造血干/祖細胞，調(diào)控紅系祖細胞增殖；GATA-1在紅系細胞中高表達，調(diào)控紅系終末分化[3-4]。當(dāng)GATA-2和GATA-1自身表達異常時，會嚴(yán)重干擾乃至完全破壞紅系的正常發(fā)育和分化，導(dǎo)致一系列血液疾病的發(fā)生。

高原紅細胞增多癥(high-altitude polycythemia，HAPC)是慢性高原病最常見的一種臨床類型，該疾病以紅細胞過度積累、嚴(yán)重低氧血癥為特征，常并發(fā)心腦血管意外，肺栓塞，缺血、缺氧性腎病及胃腸病等多種致死率較高的嚴(yán)重疾病，對高原地區(qū)人群的身心健康構(gòu)成嚴(yán)重危害[5]，但迄今仍未能闡明該疾病的治病機理。因為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體CD71是紅系細胞表面的特異性標(biāo)志物之一，它表達于紅系祖細胞至網(wǎng)織紅細胞的各分化階段[6]，故本研究以HAPC模型大鼠骨髓CD71+細胞為材料，分析GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達水平變化及其相關(guān)性，為闡釋HAPC的發(fā)病機制提供新的科學(xué)實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物和試劑

健康SPF級雄性SD大鼠48只，體重(200±20)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK(陜) 2012-003，合格證號為61001700000509。

大鼠骨髓單個核細胞分離試劑盒購自TBD；Anti-PE MicroBeads購自Miltenyi；單克隆抗體PE-CD71和PE-IgG2a購自BD；GATA-1 shRNA靶點設(shè)計，慢病毒載體構(gòu)建及包裝由上海吉凱基因技術(shù)公司完成；StemSpanTMSFEMⅡ購自STEMCELL；小鼠抗大鼠GATA-1、β-actin單克隆抗體和兔抗大鼠GATA-2多克隆抗體購自Santa Cruz；HRP標(biāo)記的 II 抗IgG購自北京中杉金橋生物有限公司；Trizol總RNA提取試劑購自Invitrogen；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 購自Fermentas；SYBR Green PCR Master Mix購自Bio-Rad；所用引物(表1)均由上海生工生物工程股份有限公司合成。其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

表1 引物序列

2 方法

2.1 動物分組及HAPC模型的建立 實驗動物隨機分為對照組(海拔2 250 m)和HAPC模型組(海拔4 300 m)，每組24只。依據(jù)文獻報道[7]，HAPC組模型大鼠自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部運至海拔4 300 m的青海省玉樹州珍琴鄉(xiāng)飼養(yǎng)40 d。同期對照組在海拔2 250 m的西寧市飼養(yǎng)。經(jīng)尾靜脈采血，測定紅細胞數(shù)(erythrocyte count，RBC)、血紅蛋白量(hemoglobin，Hb)、紅細胞壓積(haematocrit，HCT)；經(jīng)頸動脈插管取血行動脈血氣分析，檢測動脈血氧飽和度(arterial oxygen saturation，SaO2)；骨髓涂片后進行病理檢測和細胞計數(shù)。根據(jù)2004年第六屆國際高原醫(yī)學(xué)和低氧生理學(xué)術(shù)大會制訂的慢性高原病青海診斷標(biāo)準(zhǔn)(Hb>210 g/L，HCT>65%)判斷動物是否患有HAPC[8]。

2.2 CD71+細胞的流式細胞術(shù)檢測和分選 分離大鼠骨髓單個核細胞，分為4組。其中2組分別加入PE-CD71抗體和同型對照抗體4 ℃孵育30 min，檢測細胞CD71抗體的平均熒光強度值(mean fluorescence intensity，MFI)；另外2組分別與PE-CD71抗體和同型對照抗體4 ℃避光反應(yīng)10 min后，加入Anti-PE MicroBeads 4 ℃避光孵育15 min，上樣分選柱分選CD71+細胞，檢測細胞CD71抗體的MFI。細胞計數(shù)10 000個以上。

2.3 RT-qPCR和Western blot實驗檢測GATA-1和GATA-2的mRNA及蛋白表達 提取CD71+細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以β-actin為內(nèi)參照，采用 2-ΔΔCt方法檢測GATA-1和GATA-2的mRNA表達。設(shè)置擴增參數(shù)為95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 32 s，40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次。RIPA裂解液提取CD71+細胞總蛋白，BCA法定量后進行12%的SDS-PAGE電泳，蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h， I 抗GATA-1(1∶600)和GATA-2(1∶800)4 ℃過夜， II 抗(1∶80 000)室溫下孵育1 h，ECL發(fā)光壓片顯色。以β-actin 為內(nèi)參照。

2.4 CD71+細胞的低氧培養(yǎng) HAPC模型組CD71+細胞重懸于StemSpanTMSFEMⅡ中，調(diào)整6孔板細胞接種量為每孔1.5×106，置37 ℃、3% O2、92% N2、5% CO2的飽和濕度低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，進行后續(xù)RNA干擾實驗。

2.5 細胞轉(zhuǎn)染 低氧培養(yǎng)的CD71+細胞分為5組：空白對照組、陰性對照組及GATA-1 shRNA(1、2、3)組， 每組5個復(fù)孔。干擾序列GATA-1 shRNA1為5’-GGTGCTGAACCTTCTGCATCA-3’；GATA-1 shRNA2為5’- GGGAAGAACAACAATACATTC-3’；GATA-1 shRNA3為5’-GGCCCAAGAAGCGAATGATTG-3’；陰性對照序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。按復(fù)感染指數(shù)MOI=2加入GATA-1 shRNA慢病毒液，96 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光情況，RT-qPCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后GATA-1的mRNA及蛋白表達，篩選出最佳干擾序列。轉(zhuǎn)染最佳干擾序列96 h后，觀察綠色熒光情況，RT-qPCR和Western blot檢測GATA-1和GATA-2的mRNA及蛋白表達。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)進行Shapiro-Wilk檢驗，符合正態(tài)分布的實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較，采用Bonferroni檢驗。不符合正態(tài)分布的實驗數(shù)據(jù)以中位數(shù)(下四分位數(shù)，上四分位數(shù))[median (Q1,Q3)]表示，差異顯著性采用秩和檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 骨髓細胞形態(tài)特征、分類計數(shù)和血液學(xué)參數(shù)的比較

骨髓涂片結(jié)果顯示HAPC模型組變形紅細胞較對照組增多，可見棘球狀、小球形、大球形等異常紅細胞(圖1)。與對照組的骨髓粒、紅細胞系分類計數(shù)結(jié)果比較，HAPC模型組的中、晚幼紅細胞明顯增加(P<0.05)；粒細胞系統(tǒng)與有核紅細胞的比值減低(P<0.05)，粒細胞系統(tǒng)兩組差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表2、3；血液學(xué)參數(shù)檢測結(jié)果提示RBC、Hb和HCT升高，SaO2降低(P<0.05)，見表4。

Figure 1.The morphology of bone marrow cells in 2 groups (×400). A: control group, the red arrows point to the normal RBCs; B: HAPC group, the yellow arrows point to the abnormal RBCs.

圖1 兩組骨髓細胞形態(tài)學(xué)的比較

表2 兩組骨髓粒、紅細胞系分類計數(shù)比較

Table 2.The comparison of myeloid cells differential count in both groups (n=24)

GroupGranulocyticseriesErythrocyticseriesGranulocyte/erythrocyteControl0．50(0．00，8．38)3．25(1．00，10．25)2．88±0．40HAPC0．00(0．00，5．50)9．00(0．63，20．38)?1．27±0．67?

*P<0.05vscontrol group.

表3 兩組紅細胞系統(tǒng)分類計數(shù)比較

Table 3.The comparison of erythroid cells differential count in both groups (n=24)

GroupMacroblastBasophilicnormoblastIntermediateerythroblastAcidophilicnormoblastControl0．00(0．00，0．50)1．44±0．689．69±2．409．38±3．67HAPC0．25(0．00，1．00)3．25±2．6317．38±7．15?18．94±7．82?

*P<0.05vscontrol group.

表4 血液學(xué)參數(shù)檢測結(jié)果

Table 4.The test results of hematologic parameters (Mean±SD.n=24)

GroupRBC(×1012/L)Hb(g/L)HCT(%)SaO2(%)Control8．25±0．19187．54±7．1654．62±2．4396．23±1．15HAPC11．12±0．26?253．26±13．52?76．40±2．78?74．88±2．86?

*P<0.05vscontrol group.

2 骨髓細胞CD71的MFI

分選后兩組CD71+細胞的純度均達到90%以上；HAPC模型組MNC中CD71抗體的MFI明顯高于對照組(P<0.05)，見表5、圖2。

3 骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2 mRNA及蛋白的表達變化

與對照組比較，HAPC模型組CD71+細胞GATA-1的mRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.05)，GATA-2的mRNA及蛋白的表達量在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3、4。

表5 CD71+細胞的分選結(jié)果

Table 5.The separation results of CD71+cells (Mean±SD.n=24)

GroupPercentageinmononuclearcells(%)Puritycoefficient Control25．05±3．3292．90±1．81 HAPC53．48±3．81?92．10±2．13

*P<0.05vscontrol group.

Figure 2.CD71 MFI in HAPC group and the corresponding FCM hisgrams. A: MFI of CD71 in HAPC group; B: the images of CD71 detected by flow cytometry. Mean±SD.n=24.*P<0.05vscontrol group.

圖2 HAPC模型組CD71的MFI及流式細胞術(shù)直方圖

Figure 3.The mRNA expression of GATA-1 and GATA-2 in the CD71+cells. Mean±SD.n=24.*P<0.05vscontrol group.

圖3 HAPC模型組骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2的mRNA表達

Figure 4.The protein expression of GATA-1 and GATA-2 in the CD71+cells. Mean±SD.n=24.*P<0.05vscontrol group.

圖4 HAPC模型組骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2 蛋白的表達

4 骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示HAPC模型組CD71+細胞GATA-1和GATA-2的mRNA及蛋白表達無顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為-0.143和0.357；對照組骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2的mRNA及蛋白表達呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.828和-0.931(P<0.01)。

5 GATA-1 shRNA干擾效率的驗證

與陰性對照組相比，各GATA-1 shRNA組GATA-1的mRNA和蛋白表達量差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。其中，GATA-1 shRNA1的干擾效果最好，后續(xù)實驗選擇GATA-1 shRNA1序列進行轉(zhuǎn)染，見圖5。

6 GATA-1 shRNA1對GATA-2表達的影響

熒光倒置顯微鏡下，GATA-1shRNA1組綠色熒光分布于細胞內(nèi)，與光學(xué)顯微鏡下同一視野對比，70%以上細胞顯示綠色熒光(圖6)； 在GATA-1 shRNA1干擾作用下，GATA-1的mRNA和蛋白表達量低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)，但是GATA-2的mRNA和蛋白表達量并無減低，見圖7。

Figure 5.The screening results ofGATA-1 shRNA interference sequences in CD71+cells of HAPC group. Mean±SD.n=24.*P<0.05vsnegative control group.

圖5 GATA-1 shRNA干擾序列篩選結(jié)果

Figure 6.The fluorescence observation of the CD71+cells tranfected withGATA-1 shRNA1 for 96 h (×200). A: fluorescence microscopy; B: bright field microscopy.

圖6 GATA-1 shRNA1轉(zhuǎn)染96 h后的熒光顯微鏡觀察

Figure 7.The expression of GATA-1 and GATA-2 at mRNA and protein levels after GATA-1 RNAi transfection in the CD71+cells of HAPC group. Mean±SD.n=24.*P<0.05vsnegative control group.

圖7 HAPC模型組骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2 mRNA和蛋白的表達

討 論

GATA-2和GATA-1參與紅系造血調(diào)控。GATA-2維持著造血干/祖細胞增殖和自我更新，其表達下調(diào)影響造血干/祖細胞的分化[9-10]。在紅系分化的不同時期，GATA-1的表達量和生物學(xué)功能是動態(tài)變化的[11]。它在紅系和巨核系祖細胞時期的表達量處于較低水平，分化到紅系集落形成單位(colony-forming unit-erythroid, CFU-E)和原紅細胞時其表達量幾乎達到頂峰，此后表達量緩慢下降。GATA-1發(fā)揮著下調(diào)GATA-2等細胞增殖分裂基因[12-13]、上調(diào)眾多紅系特異性基因[14-15]等作用。隨著正常紅系分化的推進，GATA-1表達增加且抑制GATA-2基因的表達，兩者共同作用，協(xié)同其它因子調(diào)控造血干/祖細胞向紅系終末分化轉(zhuǎn)折[12]。那么，GATA-1和GATA-2表達及作用關(guān)系異常勢必會影響紅系細胞的正常發(fā)育，終將導(dǎo)致紅細胞系統(tǒng)疾病的發(fā)生。依據(jù)文獻報道復(fù)制HAPC大鼠動物模型，應(yīng)用骨髓涂片、骨髓細胞分類計數(shù)和血液學(xué)參數(shù)檢測進行驗證。骨髓細胞形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，HAPC模型的骨髓未成熟紅細胞明顯增多，尤以變形紅細胞最為突顯；細胞分類計數(shù)后，發(fā)現(xiàn)中、晚幼紅細胞明顯增加，粒細胞系統(tǒng)與有核紅細胞的比值明顯降低；血液學(xué)參數(shù)指標(biāo)Hb和HCT明顯高于慢性高原病青海診斷標(biāo)準(zhǔn)，但是SaO2降低顯著，說明紅細胞數(shù)量明顯增多，但是其攜氧能力下降顯著，提示HAPC動物模型復(fù)制成功。

采用流式細胞術(shù)對CD71+細胞的純度和占MNC的比例進行檢測可見HAPC模型組的CD71抗體MFI明顯高于對照組，同時兩組CD71+細胞的純度均可達到90%以上，提示HAPC模型組骨髓髓系造血干/祖細胞向紅系細胞分化明顯增加，而且細胞免疫磁珠分選法可以獲得高純度的CD71+細胞，這為下一步的RT-qPCR和Western blot實驗檢測工作奠定了基礎(chǔ)。

RT-qPCR和Western blot實驗檢測GATA-1和GATA-2表達的結(jié)果顯示，HAPC模型組CD71+細胞GATA-1的mRNA及蛋白表達明顯升高，GATA-2的mRNA及蛋白的表達量未降低，提示高原低氧刺激下，GATA-2表達量保持不變，可能有益于它發(fā)揮增殖造血干/祖細胞，擴充造血祖細胞池的作用；同時GATA-1表達增高，有利于加強它對眾多紅系特異性靶基因的調(diào)節(jié)，促進紅系細胞分化。GATA-1與GATA-2間的相關(guān)性分析表明，對照組GATA-1和GATA-2呈負相關(guān)關(guān)系，但是HAPC模型組中上述因子間無明顯相關(guān)性。進一步采用小RNA干擾技術(shù)抑制HAPC模型組CD71+細胞GATA-1表達后，發(fā)現(xiàn)GATA- 2的表達未被抑制。提示高原低氧條件下，GATA-1與GATA-2間的相關(guān)關(guān)系發(fā)生改變，這可能促使了骨髓紅系細胞的過度增殖和大量分化，最終導(dǎo)致成熟紅細胞的過度積聚。但是高原低氧時，GATA-2的表達未被GATA-1抑制，是因為抑制作用減弱，還是有它途徑加強GATA-2的表達而部分抵消GATA-1對它的抑制作用，原因尚未知曉。在后繼研究中，本課題組將繼續(xù)探尋其中的因果。

綜上所述，本研究復(fù)制HAPC大鼠模型后，分析比較兩組GATA-1和GATA-2的表達情況和相關(guān)關(guān)系，提示HAPC模型骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2表達異常，兩者的負相關(guān)關(guān)系削弱，這可能促進了HAPC的發(fā)生發(fā)展。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Expression relevance of GATA-1 and GATA-2 in bone marrow CD71+cells of high-altitude polycythemia rat model

LIU Fang1, WEI Wei2, JI Lin-hua2, FENG Ting-ting2, WANG Shu-lin1, SHI Ji-yu1

(1DepartmentofBiochemistry,MedicalCollege,2DepartmentofHematology,AffiliatedHospital，QinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail:qhxnlf2006@163.com)

AIM: To investigate the expression relevance of transcription factors GATA-1 and GATA-2 in the bone marrow CD71+cells of a high-altitude polycythemia (HAPC) rat model.METHODS: Male SD rats (n=48) were randomly divided into normal control group and HAPC model group. HAPC model was established at an altitude of 4 300 m in the natural environment and verified by the morphology and quantity of the bone marrow cells and hematologic parameters detection. A relative change in the trend of bone marrow CD71+cell numbers was detected by flow cytometry analysis. The expression of GATA-1 and GATA-2 at mRNA and protein levels in the CD71+cells was examined by RT-qPCR and Western blot. CD71+cells were cultured under hypoxic condition and transfected with the optimal interference sequence of GATA-1shRNA1 for 96 h. The expression of GATA-1 and GATA-2 at mRNA and protein levels was detected by RT-qPCR and Western blot.RESULTS: The establishment of the animal model with HAPC was successful as the bone marrow smears and the hematologic parameters showed compared with the control. The quantity of the bone marrow CD71+cells of HAPC rats were significantly increased and the expression of GATA-1 at mRNA and protein levels in the CD71+cells were higher than those of the control. The expression of GATA-2 at mRNA and protein levels was similar to that of the control. The correlation analysis showed that the expression of GATA-1 was negatively correlated with that of GATA-2 in the control, while no obvious correlation between them was observed in the HAPC rats. The expression of GATA-1 at mRNA and protein levels in HAPC group was lower than that in control group after interfered byGATA-1 shRNA1 for 96 h, but no obvious diversity of GATA-2 expression between the 2 groups was observed.CONCLUSION: GATA-1 and GATA-2 are abnormally expressed and their negative correlation is destroyed in HAPC, which may be one of the pathogenesis of HAPC.

High-altitude polycythemia; Transcription factors; GATA-1; GATA-2

1000- 4718(2016)10- 1863- 07

2016- 01- 21

2016- 08- 17

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81441116)；青海省科技廳(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究計劃項目(No. 2012-Z-729)；青海大學(xué)“123高層次人才培養(yǎng)工程”中青年學(xué)術(shù)帶頭人基金；青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中青年科研基金團隊項目(No. 2014-KT-1)

△通訊作者 Tel: 0971-6176859; E-mail: qhxnlf2006@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.020

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