miR-496過(guò)表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

周靜怡， 鐘 冰， 劉 麗， 王 娟

(濟(jì)南市第五人民醫(yī)院消化科，山東 濟(jì)南 250022)

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miR-496過(guò)表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

周靜怡△， 鐘 冰， 劉 麗， 王 娟

(濟(jì)南市第五人民醫(yī)院消化科，山東 濟(jì)南 250022)

目的： 研究miR-496過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制。方法: 運(yùn)用生物信息學(xué)軟件篩選miR-496靶向相互作用蛋白；real-time PCR和Western blot法測(cè)定結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、HCT116、SW480以及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中miR-496、CTNNB1 mRNA和β-catenin蛋白的表達(dá)；運(yùn)用Lipofectamine 2000將miR-496 mimics轉(zhuǎn)染HT29、HCT116和SW480細(xì)胞，分別命名為HT29-miR-496 mimics、HCT116-miR-496 mimics和SW480-miR-496 mimics細(xì)胞，轉(zhuǎn)染scramble為陰性對(duì)照；運(yùn)用MTT法、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒法、克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell分別測(cè)定細(xì)胞活力、LDH漏出率、克隆形成能力和轉(zhuǎn)移能力；螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)測(cè)定miR-496啟動(dòng)子活性；Western blot法測(cè)定β-catenin、真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)、p-4E-BP1、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(LRP6)、p-LRP6、MMP-7、MMP-9、MMP-13以及TIMP-2的蛋白水平。結(jié)果: miR-496與β-catenin內(nèi)源性相互作用；miR-496在HT29、HCT116和SW480細(xì)胞中低表達(dá)，而在NCM460高表達(dá)；β-catenin在HT29、HCT116和SW480細(xì)胞中高表達(dá)，而在NCM460低表達(dá)；培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h的HT29-miR-496 mimics、HCT116-miR-496 mimics和SW480-miR-496 mimics細(xì)胞活力、LDH漏出率、克隆形成率和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-496 mimics細(xì)胞中的miR-496啟動(dòng)子活性明顯增加(P<0.05)，分別是對(duì)照組的1.75倍、2.04倍和1.61倍。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-496過(guò)表達(dá)抑制β-catenin蛋白表達(dá)，p-4E-BP1和p-LRP6的蛋白水平降低；siRNA或miR-496過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的β-catenin表達(dá)下調(diào)能顯著抑制MMP-7和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)TIMP-2的表達(dá)。結(jié)論: miR-496在結(jié)腸癌細(xì)胞中低表達(dá)，在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中高表達(dá)；miR-496過(guò)表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路進(jìn)一步抑制MMP-7和MMP-9表達(dá)，促進(jìn)TIMP-2表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性表型。

結(jié)腸癌； miR-496； Wnt/β-catenin； 細(xì)胞活力

結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位居所有惡性腫瘤第3位和第5位[1]。資料顯示結(jié)腸癌發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，好發(fā)于40～60歲年齡階段人群[2]。早期結(jié)腸癌缺乏特異性表征，多數(shù)患者診斷時(shí)已達(dá)疾病晚期，且治療效果差，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前尚無(wú)特異的結(jié)腸癌分子靶向藥物，因此尋找和研發(fā)特異性治療結(jié)腸癌的靶向藥物已成為亟需解決的醫(yī)研問(wèn)題。

微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)的發(fā)現(xiàn)給結(jié)腸癌患者帶來(lái)了希望，miRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼微小RNA。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs的異常表達(dá)與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]，在癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲，細(xì)胞凋亡，周期調(diào)控和癌細(xì)胞耐藥性方面發(fā)揮重要作用[5-6]。miR-496位于人類(lèi)14號(hào)染色體，其生物學(xué)功能尚不清楚，研究表明miR-496低表達(dá)與機(jī)體老化相關(guān)[7]，在骨細(xì)胞的形成和分化中具有重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)miR-496過(guò)表達(dá)能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，并具有MBD2依賴(lài)性[9]。最新研究發(fā)現(xiàn)miR-496在骨肉瘤細(xì)胞中低表達(dá)，而miR-496過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)控β-catenin通路活性抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[10]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)miR-496的報(bào)道較少，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能尚不清楚，至今尚無(wú)miR-496在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的報(bào)道。本研究通過(guò)生物信息學(xué)和細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)探討miR-496在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制，為以miR-496為靶點(diǎn)研發(fā)治療結(jié)腸癌的分子靶向藥物提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株與試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、HCT116、SW480及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素、鏈霉素和胰酶購(gòu)自Gibco；MTT和二甲基亞砜購(gòu)自Sigma；Transwell 板購(gòu)自Corning；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen；抗4E-BP1、p-4E-BP1、LRP6、p-LRP6和β-catenin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；抗MMP-7、MMP-9、MMP-13和TIMP-2抗體購(gòu)自Abcam；過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗IgG和抗β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz；mirVana miRNA分離試劑盒和Taqman miRNA試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript?RT reagent kit with gDNA Eraser)和real-time PCR 試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ)購(gòu)于TaKaRa；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo。β-catenin的siRNA序列和陰性對(duì)照siRNA序列由上海生工合成；miR-496 mimics和scramble序列均由廣州博銳生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。

2 方法

2.1 生物信息學(xué)分析 通過(guò)miRWalk在線(xiàn)軟件(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析miR-496潛在的相互作用因子。將miR-496基因序列輸入miRanda軟件(http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do)進(jìn)行熱力學(xué)穩(wěn)定性評(píng)分和序列保守性評(píng)分檢測(cè)，以預(yù)測(cè)與miR-496最可能結(jié)合的靶蛋白。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[11]：mirSVR≤-0.1，分值越低說(shuō)明結(jié)合越穩(wěn)定；PhastCons≥0，分值越高越好，以熱力學(xué)穩(wěn)定性分值為主要參數(shù)，PhastCons分值一般為 0.5～0.8較好。分析篩選獲得miR-496潛在的靶蛋白即β-catenin。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HT29、HCT116、SW480和NCM460細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10% FBS、1%青霉素、1%鏈霉素)中，置于37 ℃、5% CO2及95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

2.3 Real-time PCR 將生長(zhǎng)良好的NCM460、HT29、HCT116和SW480細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，以細(xì)胞密度為每孔1.5×106個(gè)接種到90 mm皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)收集細(xì)胞，按照mirVana miRNA分離試劑盒的步驟提取miRNA；按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度(A)值。按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，反應(yīng)條件為：42 ℃ 1 h；70 ℃ 10 min；4 ℃10 min。最后cDNA于-80 ℃保存。取2 ng cDNA進(jìn)行real-time PCR，用于擴(kuò)增的sense引物為5’-GCAATCCTGAGGAAGAGGATGTGGA-3’，anti-sense引物為5’-TCTGAGCTGCGAGTCATT-3’。反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。運(yùn)用Taqman miRNA檢測(cè)試劑盒測(cè)定miRNA-496的表達(dá)，采用SYBR GreenⅡ熒光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad)進(jìn)行real-time PCR數(shù)據(jù)分析，結(jié)果經(jīng)內(nèi)參照U6校正，miR-496的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將生長(zhǎng)良好的HT29、HCT116和SW480細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，以細(xì)胞密度為每孔2.5×105個(gè)接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到85%左右時(shí)按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行miR-496 mimics細(xì)胞轉(zhuǎn)染，以轉(zhuǎn)染scramble為對(duì)照，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞命名為HT29-miR-496 mimics、HCT116-miR-496 mimics、SW480-miR-496 mimics、HT29-scramble、HCT116-scramble和SW480-scramble細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4 h后換成完全培養(yǎng)基，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對(duì)照，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)消化計(jì)數(shù)后，以細(xì)胞密度為2×107/L接種于96孔板中，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，搖床上室溫振蕩5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的A值，按下式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：

細(xì)胞增殖抑制率(%)=

2.6 檢測(cè)細(xì)胞中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L接種于96孔板中， 同時(shí)設(shè)細(xì)胞自然釋放對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基)，最大釋放對(duì)照組(0.8% Triton X-100)，每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2溫箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，最大釋放孔在結(jié)束培養(yǎng)前加入終濃度為0.8% 的Triton X-100，作用45 min。分別從對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)板中取100 μL上清加入ELISA板中，37 ℃孵育10 min后，加入新鮮配制的100 μL LDH底物溶液，室溫避光反應(yīng)15 min，每孔加入1 mol/L檸檬酸終止液30 μL，用酶標(biāo)儀在490 nm 處讀取各孔A值, 并計(jì)算LDH漏出率:

2.7 克隆形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化計(jì)數(shù)后，以每皿500個(gè)接種于90 mm皿中，設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)直到通過(guò)肉眼能清晰觀察到可見(jiàn)的細(xì)胞克隆(約15 d)；棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌，甲醇室溫固定10 min，PBS洗滌，吉姆薩室溫染色10 min，自來(lái)水清洗，晾干后計(jì)數(shù)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞克隆形成率：

2.8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，在Transwell每個(gè)培養(yǎng)孔上室中加入1.5×104個(gè)細(xì)胞，下室為無(wú)血清培養(yǎng)基，設(shè)置空白對(duì)照組；37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h后經(jīng)4%多聚甲醛固定，乙醇脫水，結(jié)晶紫染色，洗滌。用棉簽輕輕擦去上室的貼壁細(xì)胞，在顯微鏡下觀察5個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)從Transwell上室遷移至微孔膜下層的細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取平均值。通過(guò)每組Transwell的遷移細(xì)胞數(shù)比較細(xì)胞的遷移能力。

2.9 螢光素酶-報(bào)告基因檢測(cè) 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，計(jì)數(shù)后以細(xì)胞密度為每孔1.5×105個(gè)接種于24孔板中，待細(xì)胞融合度為80%左右時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)將200 ng TOPflash報(bào)告質(zhì)粒和10 ng FOPFlash海腎螢光素酶對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞。加入1×被動(dòng)裂解緩沖液重懸細(xì)胞，置于4 ℃裂解24 h，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集上清并測(cè)定細(xì)胞上清中螢光素酶的活性。以海腎螢光素酶活性為內(nèi)參照計(jì)算樣品中螢火蟲(chóng)螢光素酶的活性。

2.10 Western blot實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)用細(xì)胞刮將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中刮下，離心收集細(xì)胞，用RIPA(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS)重懸，超聲破碎，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，按照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定總蛋白濃度。每個(gè)樣本取30 μg進(jìn)行SDS-PAGE，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育 I 抗(抗β-catenin、4E-BP1、p-4E-BP1、LRP6、p-LRP6、MMP-7、MMP-9、MMP-13和TIMP-2抗體)，以β-actin為內(nèi)參照，4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜、孵育 II 抗，室溫孵育1 h。ECL顯影后掃描，蛋白相對(duì)表達(dá)量經(jīng)內(nèi)參照校正后經(jīng)Quantity-One軟件分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-496和β-catenin在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，miR-496在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中高表達(dá)，而在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、HCT116和SW480細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，與NCM460細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)；相反，β-catenin的編碼基因CTNNB1的mRNA在NCM460細(xì)胞中低表達(dá)，在HT29、HCT116和SW480高表達(dá)，其表達(dá)量顯著高于NCM460細(xì)胞(P<0.01)；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)β-catenin蛋白在NCM460表達(dá)量明顯低于3種結(jié)腸癌細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

2 上調(diào)miR-496表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，通過(guò)脂質(zhì)體將miR-496 mimics轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞48 h后，real-time PCR檢測(cè)miR-496的表達(dá)，結(jié)果表明miR-496在結(jié)腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，顯著高于陰性對(duì)照(scramble)組(P<0.05)；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miR-496過(guò)表達(dá)顯著抑制HT29、HCT116和SW480細(xì)胞活力(P<0.05)。隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，細(xì)胞活力逐漸下降，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，見(jiàn)圖2。

3 上調(diào)miR-496表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LDH漏出率的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，miR-496過(guò)表達(dá)顯著抑制HT29、HCT116和SW480細(xì)胞的LDH漏出率(P<0.05)，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，細(xì)胞LDH漏出率逐漸下降，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。

4 上調(diào)miR-496表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

如圖4所示，轉(zhuǎn)染miR-496 mimics的結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成能力顯著降低，HT29、HCT116和SW480細(xì)胞的克隆形成率分別降低至64.4%、56.8%和23.5%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。結(jié)果表明，上調(diào)miR-496表達(dá)能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的克隆形成。

5 上調(diào)miR-496表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞遷移的數(shù)量明顯增多，而miR-496 mimics轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至下室的細(xì)胞顯著降低，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，提示miR-496 mimics過(guò)表達(dá)能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，見(jiàn)圖5。

Figure 1.The expression of miR-496 and β-catenin detected by TaqMan real-time PCR (A) and Western blot (B) in NCM460 cells and colon cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNCM460 cells.

圖1 miR-496和β-catenin在NCM460細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 2.The effect of miR-496 over-expression on the cell activity of colon cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscramble.

圖2 上調(diào)miR-496表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活力的影響

Figure 3.The effect of miR-496 over-expression on the LDH leakage rate of colon cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscramble.

圖3 上調(diào)miR-496表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LDH漏出率的影響

Figure 4.The effect of miR-496 over-expression on the colony formation abilities of the colon cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsscramble.

圖4 上調(diào)miR-496表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

Figure 5.The effect of miR-496 over-expression on the metastatic ability of the colon cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsscramble.

圖5 上調(diào)miR-496表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的影響

6 上調(diào)miR-496表達(dá)對(duì)β-catenin信號(hào)通路的影響

運(yùn)用TOPflash螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)上調(diào)miR-496表達(dá)對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響，結(jié)果表明miR-496 mimics轉(zhuǎn)染的HT29、HCT116和SW480細(xì)胞的TCF啟動(dòng)子活性顯著增加(P<0.05)，分別增高1.75倍、2.04倍和1.61倍。Western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，miR-496過(guò)表達(dá)抑制β-catenin蛋白水平，p-LPR6和p-4E-BP1蛋白水平明顯降低，提示上調(diào)miR-496表達(dá)能抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路及影響其下游分子事件,見(jiàn)圖6。

7 miR-496調(diào)控β-catenin信號(hào)通路對(duì)MMP家族關(guān)鍵靶基因的影響

Figure 6.The effect of miR-496 over-expression on the protein levels of β-catenin pathway-related molecules in the colon cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsscramble.

圖6 上調(diào)miR-496表達(dá)對(duì)β-catenin信號(hào)通路的影響

我們進(jìn)一步研究miR-496通過(guò)調(diào)控β-catenin信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響。Western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SW480細(xì)胞中干擾β-catenin表達(dá)后，與轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-7和MMP-9的表達(dá)被抑制，而MMP-13蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，TIMP-2表達(dá)增高；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在3種結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-496過(guò)表達(dá)顯著抑制β-catenin的表達(dá)，同時(shí)MMP-7和MMP-9的表達(dá)顯著降低，TIMP-2表達(dá)升高，而MMP-13蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化，結(jié)果提示上調(diào)miR-496表達(dá)通過(guò)抑制β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移基因最終抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，見(jiàn)圖7。

討 論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命，其發(fā)病率在歐美國(guó)家僅次于肺癌和胃癌。資料統(tǒng)計(jì)，我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，好發(fā)于40～50歲的年齡組人群[12]。目前結(jié)腸癌治療手段包括手術(shù)切除、放療/化療、免疫治療，但總體療效及預(yù)后不佳。結(jié)腸癌的發(fā)病原因復(fù)雜，涉及細(xì)胞増殖與周期異常、凋亡通路被抑制及Wnt/β-catenin等多條信號(hào)通路失調(diào)等[13]。因此，探索新型的高效低毒的靶向抗癌藥物對(duì)結(jié)腸癌的治療顯得非常重要。

MicroRNA廣泛存在于真核生物中，參與細(xì)胞的分化、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡、周期調(diào)控等過(guò)程[14]，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。早期研究發(fā)現(xiàn)miR-496與人類(lèi)老年化相關(guān)[7]，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)骨細(xì)胞形成[8]。Alvarado等[9]發(fā)現(xiàn)miR-496與乳腺癌的發(fā)病有關(guān)，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)miR-496在骨肉瘤細(xì)胞中低表達(dá)，其過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)控β-catenin通路活性抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-496在結(jié)腸癌細(xì)胞中低表達(dá)，而在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中高表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道[10]miR-496在轉(zhuǎn)移性高的骨肉瘤細(xì)胞和組織中低表達(dá)，而在瘤旁骨纖維化組織和惡性程度較低的骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)相類(lèi)似，提示miR-496是一種腫瘤抑制因子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-496過(guò)表達(dá)顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、HCT116和SW480細(xì)胞的活力、克隆形成能力、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，提示miR-496在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展具有重要作用。

腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制涉及到許多信號(hào)通路的改變，本研究對(duì)miR-496過(guò)表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移可能的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-496與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相互作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在進(jìn)化中極為保守，在腫瘤轉(zhuǎn)移信號(hào)通路中占有重要地位，Wnt配體能激活Wnt/β-catenin通路，Wnt與FZD受體結(jié)合誘導(dǎo)LRP6受體磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腫瘤如鼻咽癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌等中發(fā)生Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常[15]。越來(lái)越多的證據(jù)表明Wnt信號(hào)通路與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架形成、遷移、黏附及腫瘤的血管生成等，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-496過(guò)表達(dá)能抑制β-catenin表達(dá)，其受體家族成員LRP6磷酸化水平顯著降低，提示miR-496過(guò)表達(dá)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性，這可能是miR-496過(guò)表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制之一。

Figure 7.The effect of miR-496-regulated β-catenin pathway on the protein expression of the MMP family in the colon cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscramble.

圖7 miR-496調(diào)控β-catenin信號(hào)通路對(duì)MMP家族關(guān)鍵靶基因的影響

我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-7、MMP-9以及它們的抑制因子TIMP-2受到miR-496的調(diào)控，miR-496過(guò)表達(dá)抑制MMP-7和MMP-9的表達(dá)，相反則促進(jìn)TIMP-2的表達(dá)；相同情況下miR-496對(duì)MMP-13的表達(dá)無(wú)影響，提示miR-496對(duì)MMP家族成員的表達(dá)調(diào)控具有特異性。我們的研究也發(fā)現(xiàn)單獨(dú)下調(diào)β-catenin表達(dá)能抑制MMP-7和MMP-9的表達(dá)和促進(jìn)TIMP-2表達(dá)，提示miR-496通過(guò)調(diào)控β-catenin信號(hào)通路活性對(duì)MMP家族關(guān)鍵靶基因的調(diào)控影響結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性表型，存在miR-496→Wnt/β-catenin→MMP-7/MMP-9/TIMP-2信號(hào)通路。然而，miR-496的生物學(xué)功能仍不完全清楚，本研究為以miR-496為靶點(diǎn)研發(fā)治療結(jié)腸癌的分子靶向藥物提供了科學(xué)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

緊密連接蛋白1通過(guò)EGFR/JAK1/STAT3信號(hào)調(diào)節(jié)多發(fā)性

骨髓瘤中蛋白酶體容量和蛋白酶體抑制劑敏感性

蛋白酶體抑制劑的應(yīng)用已經(jīng)徹底改變了多發(fā)性骨髓瘤的預(yù)后，但它們的臨床應(yīng)用都是經(jīng)驗(yàn)性用藥，而原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥是目前所面臨的新問(wèn)題。Zhang等曾報(bào)道緊密連接蛋白1(tight junction protein 1, TJP1)是作為漿細(xì)胞蛋白酶體抑制劑的易感性的一個(gè)決定因素。他們進(jìn)一步研究表明，TJP1抑制具有催化活性免疫蛋白酶體亞基LMP(low molecular mass protein)7和LMP2的表達(dá)，降低蛋白酶的活性，以及在體外和體內(nèi)增強(qiáng)蛋白酶抑制劑敏感性的作用。這一機(jī)制的發(fā)生過(guò)程，是由于TPJ1介導(dǎo)了表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)/Janus 激酶1(Janus kinase 1, JAK1)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)通路的信號(hào)抑制，從而調(diào)節(jié)LMP7和LMP2的表達(dá)水平。在臨床上，多發(fā)性骨髓瘤患者瘤細(xì)胞中高表達(dá)的TJP1可能與患者對(duì)硼替佐米的反應(yīng)性以及更長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間有很大關(guān)系，聯(lián)合使用TJP1作為生物標(biāo)志物，采取個(gè)性化的治療方案，可以確保病人從蛋白酶抑制劑治療中獲得最大受益。

Cancer Cell, 2016, 29(5):639-652(范沖竹)

miR-496 over-expression inhibits growth and metastasis in colon cancer cells

ZHOU Jing-yi, ZHONG Bing, LIU Li, WANG Juan

(DepartmentofGastroenterology,TheFifthPeople’sHospitalofJinan,Jinan250022,China.E-mail:zhoujingyi@163.com)

AIM: To investigate the effect of miR-496 over-expression on the growth and metastasis of colon cancer cells and its molecular mechanism. METHODS: The proteins interacting with miR-496 were screened by bioinformatic method. The levels of miR-496, CTNNB1 mRNA and β-catenin protein in colon cancer cell lines, HT29, HCT116 and SW480, and normal colonic epithelial cell line NCM460 were detected by real-time PCR and Western blot. HT29, HCT116 and SW480 cells were transfected with miR-496 mimics using Lipofectamine 2000 and named as HT29-miR-496 mimics, HCT116-miR-496 mimics and SW480-miR-496 mimics cells, respectively, and the cells transfected with the scramble served as negative control. The cell viability, lactate dehydrogenase (LDH) leakage, and colony formation and metastatic abilities were determined by MTT assay, LDH assay, colony formation assay and Transwell method, respectively. The promoter activity of miR-496 was measured using luciferase reporter gene assay. The protein levels of β-catenin, eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1 (4E-BP1), p-4E-BP1, low-density lipoprotein receptor-related protein 6(LRP6), p-LRP6, MMP-7, MMP-9, MMP-13 and TIMP-2 were monitored by Western blot. RESULTS: Endogenous miR-406 interacted with β-catenin was found in the colon cancer cells. Low miR-496 expression in the HT29, HCT116 and SW480 cells and high miR-496 expression in NCM460 cells were detected. In contrast, high β-catenin expression was found in the HT29, HCT116 and SW480 cells and low β-catenin expression was observed in the NCM460 cells. Compared with control group, the cell viability, colony formation rate and the number of metastatic cells remarkably decreased in the HT29-miR-496 mimics, HCT116-miR-496 mimics and SW480-miR-496 mimic cells (P<0.05). The promoter activity of miR-496 was significantly increased in colon cancer cells transfected with miR-496 mimics, and was 1.75, 2.04 and 1.61 times as high as control group. miR-496 over-expression inhibited β-catenin levels, and p-4E-BP1 and p-LRP6 protein levels were also reduced. siRNA- or over-expressed miR-496-mediated β-catenin down-regulation inhibited MMP-7 and MMP-9 expression, but promoted TIMP-2 expression. CONCLUSION: The expression level of miR-496 in the colon cancer cells is low, but in the normal colonic epithelial cells is high. miR-496 over-expression inhibits the protein levels of MMP-7 and MMP-9, and promotes the protein expression of TIMP-2 via inhibiting Wnt/β-catenin pathway, thus suppressing malignant phenotype in the colon cancer cells.

Colon cancer; miR-496; Wnt/β-catenin; Cell viability

1000- 4718(2016)10- 1815- 09

2016- 06- 27

2016- 08- 03

△通訊作者 Tel: 0531-87197176； E-mail: zhoujingyi@163.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.013

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