TLR9激活后影響人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽化療敏感性的體外實(shí)驗(yàn)*

袁素娟， 喬田奎， 高彩霞， 莊喜兵， 陳 偉

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院腫瘤科，上海 201508)

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TLR9激活后影響人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽化療敏感性的體外實(shí)驗(yàn)*

袁素娟， 喬田奎△， 高彩霞， 莊喜兵， 陳 偉

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院腫瘤科，上海 201508)

目的： 探討含非甲基化CpG基序的寡脫氧核苷酸(CpG oligodeoxyribonucleotides 7909，CpG ODN7909)與Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)9結(jié)合后是否影響人肺癌A549和H520細(xì)胞對(duì)多西他賽(doctaxel，DOC)的化療敏感性及相關(guān)機(jī)制。方法: 設(shè)計(jì)并合成特異性干擾siRNA序列，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)TLR9 siRNA的沉默效果，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和TLR9 siRNA干擾組，分別接受CpG ODN7909和多西他賽單獨(dú)或聯(lián)合治療，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡,Western blot法檢測(cè)P38及Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果: 在2種細(xì)胞中，CpG ODN7909單獨(dú)處理后，細(xì)胞活力和凋亡率都無(wú)明顯變化，G2/M期細(xì)胞比例P38和Bax蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909處理TLR9 siRNA干擾細(xì)胞各指標(biāo)均無(wú)明顯變化。多西他賽單獨(dú)處理后3組細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯下降，G2/M期細(xì)胞比例、凋亡率和Bax蛋白表達(dá)都明顯升高(P<0.01)，P38表達(dá)無(wú)明顯變化。與多西他賽單獨(dú)處理比較，多西他賽與CpG ODN7909聯(lián)合治療后細(xì)胞活力明顯下降，G2/M期細(xì)胞比例、凋亡率和Bax蛋白表達(dá)都明顯升高(P<0.01)，P38表達(dá)無(wú)明顯變化；聯(lián)合處理TLR9 siRNA干擾細(xì)胞各指標(biāo)均無(wú)明顯變化。結(jié)論: CpG ODN7909與TLR9結(jié)合后可增強(qiáng)多西他賽抑制人肺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力, 誘導(dǎo)G2/M期阻滯，增強(qiáng)多西他賽對(duì)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用進(jìn)而提高其對(duì)多西他賽的化療敏感性。

CpG ODN7909; Toll樣受體9; 化療敏感性; 細(xì)胞活力； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞凋亡

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是存在于哺乳動(dòng)物且與Toll蛋白同源的分子，是表達(dá)于多種免疫細(xì)胞的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)[1]。目前，在哺乳動(dòng)物的身上共發(fā)現(xiàn)13種，其中人類有TLR1～TLR11共11種[2]。各個(gè)TLR受體與其特異性的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)相互作用，介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)通路，引發(fā)天然與適應(yīng)性免疫應(yīng)答[3]。其中，TLR9受體特異性識(shí)別細(xì)菌、病毒、質(zhì)粒或含非甲基化CpG基序的寡脫氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN)[4]。很多人癌細(xì)胞如肺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌等[5-8]也高表達(dá)TLR9。Xu等[9]報(bào)道CpG ODN通過(guò)結(jié)合TLR9，可刺激人肺癌95D細(xì)胞株增殖，誘導(dǎo)G2/M期細(xì)胞阻滯，但對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯作用。Wang等[10]報(bào)道CpG ODN靶向刺激TLR9，能有效抑制體外人肺癌A549細(xì)胞增殖，并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。且有研究發(fā)現(xiàn)，CpG ODN單獨(dú)作用于表達(dá)TLR9的腫瘤細(xì)胞，可直接或間接地影響細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡等，從而提高癌細(xì)胞的放化療敏感性[11-13]?？梢?jiàn)，目前國(guó)內(nèi)外專家對(duì)TLR9與腫瘤發(fā)生發(fā)展以及放化療敏感性之間的關(guān)系意見(jiàn)不一。本課題初步研究TLR9對(duì)多西他賽(doctaxel,DOC)治療非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)化療敏感性的影響及其相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

RPMI-1640和胎牛血清均購(gòu)于Gibco；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen；兔抗人TLR9、P38、Bax和β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗均購(gòu)自CST；0.25 % EDTA-胰蛋白酶消化液、CCK-8試劑盒及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞周期試劑盒Annexin V-FITC/碘化丙啶 (propidium iodide，PI)及凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD；多西他賽注射液由齊魯制藥有限公司提供。CpG ODN7909由上海生物工程有限公司合成，全鏈硫代修飾，并溶于無(wú)菌蒸餾水中，存于4 ℃?zhèn)溆?，其核苷酸序列?5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’。

2 細(xì)胞株

人肺癌A549和H520細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，培養(yǎng)于含10%小牛血清、1×105U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，0.25%的胰酶消化液傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 siRNA的設(shè)計(jì)與制備 根據(jù)GenBank中TLR9人全長(zhǎng)cDNA序列(Gene ID：54106)設(shè)計(jì)出siRNA序列。TLR9 siRNA的正義鏈為5’-CUAGACCUGUCCCACAAUATT-3’，反義鏈為5’-UAUUGUGGGACAGGUCUAGTT-3’；并設(shè)計(jì)合成陰性對(duì)照(control)siRNA序列：正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’,反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。上述序列均由上海吉瑪制藥公司合成并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，所有的siRNA均有熒光標(biāo)記。

3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)按每孔5×105個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)60%融合時(shí)，更換1.5 mL無(wú)雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基及5 μL LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染100 nmol/L的siRNA，6 h后更換為含有雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)放入37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為TLR9 siRNA干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組以等量培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染體系。

3.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，接種在96孔板中(每孔4×103個(gè)細(xì)胞)，4～6 h細(xì)胞貼壁后，加入CpG ODN7909使終濃度為10 mg/L，設(shè)置3個(gè)平行樣本。培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液中加入多西他賽,使終濃度分別為0、5、10、25、50、100 nmol/L。分別繼續(xù)培養(yǎng),48 h后向培養(yǎng)板每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃繼續(xù)溫育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞懸液在450 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值×100%。

3.4 Western blot法檢測(cè)TLR9、Bax和P38蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后，裂解各組細(xì)胞，抽提蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量；每孔上樣蛋白50 μg，經(jīng)6% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(200 V恒壓電泳90 min)分離后，以200 mA恒流濕法轉(zhuǎn)膜120 min。然后將膜用10%脫脂奶粉室溫封閉 2 h。TBST溶液清洗3次，每次10 min; 之后加入TLR9、Bax或P38的I抗，置于搖床上 4 ℃孵育過(guò)夜。第2天棄去 I 抗，TBST清洗 10 min 3次；洗膜后加入 II 抗(1∶5 000)，室溫作用120 min，再用TBST洗膜10 min 3次。用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白條帶，暗室曝光獲得影像膠片。

3.5 PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期 25 nmol/L多西他賽給藥后的各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用胰酶消化和收集各組貼壁細(xì)胞，1 000×g離心3～5 min沉淀細(xì)胞，用冷PBS洗2次，預(yù)冷的70%乙醇固定于-20 ℃過(guò)夜，檢測(cè)時(shí)離心(4 ℃，1 000×g，5 min)除去乙醇，冷PBS洗2次，棄上清。加入PI 0.5 mL，4℃避光孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，Wincycle32軟件分析不同細(xì)胞群體DNA含量。

3.6 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 25 nmol/L多西他賽給藥后的各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用胰酶消化和收集各組細(xì)胞(包括上清液中的細(xì)胞)，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，取5×105細(xì)胞懸液，加入100 μL結(jié)合緩沖液重懸，再加入5 μL Annexin V和5 μL PI溶液，輕輕混勻，室溫避光染色處理30 min，上流式細(xì)胞儀(BD)檢測(cè)，CELL Quest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取，分析得出細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=各組凋亡細(xì)胞數(shù)/各組總細(xì)胞數(shù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，若方差齊時(shí)，采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)則采用Dunnett’s T3法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TLR9 siRNA對(duì)TLR9蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞和H520細(xì)胞中，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞都有TLR9表達(dá)，且2組表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；TLR9 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞TLR9表達(dá)都明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01)，2種細(xì)胞的抑制率分別為(84.63±0.58)%和(85.79±0.76)%。此結(jié)果證明了TLR9 siRNA具有特異性抑制TLR9表達(dá)的功能，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The expression of TLR9 in A549 (A) and H520 (B) cells was successfully silenced by TLR9 siRNA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group.

圖1 TLR9 siRNA可抑制A549細(xì)胞中TLR9蛋白的表達(dá)

2 TLR9與CpG ODN7909結(jié)合對(duì)細(xì)胞活力及對(duì)多西他賽化療敏感性的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，A549和H520細(xì)胞經(jīng)多西他賽處理48 h后，隨著藥物濃度的增高,兩種細(xì)胞中3組細(xì)胞存活率均呈下降趨勢(shì), 呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。A549和H520細(xì)胞空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組IC50值分別為(58.38±1.33)nmol/L、(62.77±1.20)nmol/L和(57.76±1.32)nmol/L、(63.94±0.93)nmol/L，接受CpG ODN7909治療后分別下降為(25.80±0.16)nmol/L、(30.96±1.25)nmol/L和(25.74±0.36)nmol/L、(30.51±2.43)nmol/L，差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)；A549和H520細(xì)胞TLR9 siRNA組IC50值分別為(58.13±1.35)nmol/L、(64.22±1.03)nmol/L，接受CpG ODN7909治療后分別為(57.34±1.30)nmol/L、(63.32±0.91)nmol/L，差異都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。以上說(shuō)明CpG ODN7909與TLR9結(jié)合可增強(qiáng)人肺癌A549和H520細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性。CpG ODN7909單獨(dú)作用后細(xì)胞的活力與空白對(duì)照組細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effects of CpG ODN7909 combined with TLR9 on the cell activity and chemotherapeutic sensitivity of A549 (A) and H520 (B) cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group;##P<0.01vscontrol siRNA group.

圖2 CpG ODN7909與TLR9結(jié)合對(duì)人肺癌A549和H520細(xì)胞活力及對(duì)多西他賽化療敏感性的影響

3 TLR9與CpG ODN7909結(jié)合對(duì)多西他賽誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞周期阻滯的影響

由表1可見(jiàn)，空白對(duì)照和陰性對(duì)照細(xì)胞經(jīng)CpG ODN7909或多西他賽單獨(dú)處理后較未處理時(shí)的G2/M期細(xì)胞比例都明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合治療時(shí)較多西他賽單獨(dú)治療時(shí)的G2/M期細(xì)胞比例明顯升高(P<0.01)。TLR9 siRNA組經(jīng)CpG ODN7909單獨(dú)處理后和未經(jīng)處理時(shí)的G2/M期細(xì)胞比例之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而經(jīng)多西他賽單獨(dú)處理后的G2/M期細(xì)胞比例明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合治療時(shí)的G2/M期細(xì)胞比例與多西他賽單獨(dú)治療時(shí)的G2/M期細(xì)胞比例相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

4 TLR9與CpG ODN7909結(jié)合對(duì)多西他賽誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

空白對(duì)照和陰性對(duì)照細(xì)胞經(jīng)CpG ODN7909單獨(dú)處理后的細(xì)胞凋亡率與未經(jīng)處理時(shí)的凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；經(jīng)多西他賽單獨(dú)處理后的細(xì)胞凋亡率都明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合作用后的細(xì)胞凋亡率明顯高于多西他賽單獨(dú)處理組(P<0.01)。TLR9 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)CpG ODN7909單獨(dú)處理后的細(xì)胞凋亡率與未經(jīng)處理時(shí)的細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；經(jīng)多西他賽單獨(dú)處理后細(xì)胞凋亡率都明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合治療時(shí)的細(xì)胞凋亡率與接受多西他賽單獨(dú)治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3。

5 TLR9與CpG ODN7909結(jié)合對(duì)P38、Bax表達(dá)的影響

如圖4所示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞經(jīng)CpG ODN7909單獨(dú)處理后，P38蛋白和Bax蛋白表達(dá)都明顯升高(P<0.01)；多西他賽單獨(dú)處理對(duì)P38蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響，Bax蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合較多西他賽單獨(dú)處理使P38蛋白和Bax蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.01)。TLR9 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)CpG ODN7909單獨(dú)處理后，P38蛋白和Bax蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯變化；經(jīng)多西他賽單獨(dú)處理后P38蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，Bax蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合治療時(shí)P38蛋白和Bax蛋白的表達(dá)水平與接受多西他賽單獨(dú)治療組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

討 論

化學(xué)藥物治療在非小細(xì)胞肺癌治療中發(fā)揮重要作用。多西他賽是一種紫杉醇類抗腫瘤藥物，廣泛應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌治療，但因?yàn)槟[瘤細(xì)胞往往對(duì)化療藥物不敏感，或具有先天性或獲得性耐藥，并非所有患者都獲得令人滿意的效果，因此，臨床醫(yī)生亟需可提高其化療敏感性的方法。TLR9與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，CpG ODN是其配體，兩者結(jié)合后相互作用，介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)通路[14-15]。有研究顯示，在NSCLC組織和肺癌細(xì)胞株中，TLR9表達(dá)異常增高，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，其可能通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)[16]；但目前已有多個(gè)研究顯示TLR9與CpG ODN相互作用可影響到腫瘤細(xì)胞的放化療敏感性[11-13]，因此我們推斷TLR9與CpG ODN相互作用可能也影響人肺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的化療敏感性。

表1 CpG ODN7909與TLR9結(jié)合增強(qiáng)多西他賽誘導(dǎo)人肺癌A549和H520細(xì)胞周期阻滯的作用

Table 1.CpG ODN7909 combined with TLR9 enhanced induction of cell cycle arrest by doctaxel in A549 and H520 cells (Mean±SD.n=3)

Cells Group TreatmentCellcycle(%) G2/M G1 SA549BlankcontrolUntreated6．05±0．0754．09±0．1539．87±0．12CpGODN790911．40±0．36??62．02±0．1226．53±0．49DOC16．17±0．25??59．85±0．0923．91±0．37CpGODN7909+DOC30．57±0．35??##▼▼53．78±0．6015．30±0．28ControlsiRNAUntreated6．00±0．1153．27±0．1940．74±0．30CpGODN790911．60±0．40??61．43±0．6226．62±0．42DOC16．90±0．40??59．82±0．5523．22±0．91CpGODN7909+DOC31．07±0．25??##▼▼53．68±0．6015．20±0．36TLR9siRNAUntreated6．17±0．1953．36±0．2940．48±0．47CpGODN79096．10±0．2154．37±0．3339．54±0．53DOC17．20±0．30??59．22±0．1623．54±0．44CpGODN7909+DOC16．50±0．40??##59．90±0．0223．54±0．43H520BlankcontrolUntreated6．72±0．2754．09±0．4238．76±0．65CpGODN790911．97±0．23??60．76±0．2527．26±0．20DOC15．78±0．54??59．98±0．4824．24±0．36CpGODN7909+DOC29．32±0．56??##▼▼55．12±0．2315．56±0．47ControlsiRNAUntreated6．76±0．2753．64±0．3639．60±0．37CpGODN790912．21±0．41??60．51±0．6927．29±0．28DOC15．88±0．16??60．01±0．3724．11±0．34CpGODN7909+DOC30．24±0．11??##▼▼54．36±0．3715．40±0．38TLR9siRNAUntreated6．84±0．0853．98±0．3039．64±0．33CpGODN79096．43±0．3754．14±0．4439．44±0．60DOC16．17±0．32??59．82±0．6024．01±0．46CpGODN7909+DOC16．08±0．07??##59．91±0．1724．01±0．16

**P<0．01vsuntreated group;##P<0．01vsCpG ODN group;▼▼P<0.01vsDOC group.

在本研究中，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多西他賽可以明顯降低A549和H520細(xì)胞的活力，且呈劑量依賴性。CpG ODN7909單獨(dú)作用并不能明顯抑制A549和H520細(xì)胞的活力，但可以明顯增強(qiáng)多西他賽對(duì)細(xì)胞的抑制能力，A549和H520細(xì)胞的IC50值經(jīng)CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合治療后都明顯下降,但這種作用在TLR9蛋白表達(dá)受到抑制后不復(fù)存在，說(shuō)明CpG ODN是通過(guò)激活TLR9受體而起作用的。

為初步了解TLR9與CpG ODN結(jié)合影響多西他賽敏感性的機(jī)制，本研究觀察了人肺癌A549和H520細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯和凋亡情況。 Zeng等[17]研究表明，多西他賽不僅可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，并且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡發(fā)生于G2/M期阻滯之后，因此多西他賽對(duì)G2/M期細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用較明顯，G2/M期細(xì)胞對(duì)多西他賽的化療敏感性較好。我們的研究發(fā)現(xiàn)，多西他賽或CpG ODN7909單獨(dú)作用都可以顯著地把細(xì)胞阻滯在G2/M期，且兩者聯(lián)合阻滯作用更明顯。當(dāng)TLR9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)后，CpG ODN7909誘導(dǎo)周期阻滯的作用及增強(qiáng)多西他賽誘導(dǎo)阻滯的作用都消失了。多西他賽可以顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；CpG ODN7909單獨(dú)作用并不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但可以明顯增強(qiáng)多西他賽對(duì)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用；同樣，TLR9基因沉默后，CpG ODN7909的這種作用也不再明顯。

Figure 3.CpG ODN7909 combined with TLR9 enhanced the apoptosis induction effect of doctaxel on A549 and H520 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsuntreated group;##P<0.01vsCpG ODN7909 group;▼▼P<0.01vsDOC group.

圖3 TLR9與CPG ODN7909結(jié)合對(duì)人肺癌A549和H520細(xì)胞凋亡的影響

TLR9受體與配體結(jié)合后可激活ERK、JNK和P38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)3個(gè)MAPK家族的信號(hào)通路，其中P38 MAPK參與了細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)、增殖、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程[18]。許多促凋亡基因都是通過(guò)P38 MAPK通路發(fā)揮其治療作用的[19]，如誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位等[20-21]。為了初步探討TLR9與CpG ODN7909結(jié)合后影響多西他賽誘導(dǎo)人肺癌A549和H520細(xì)胞凋亡時(shí)可能涉及的相關(guān)通路，我們檢測(cè)了P38蛋白和促凋亡蛋白Bax表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)多西他賽不能顯著誘導(dǎo)P38蛋白表達(dá)，但可以顯著地誘導(dǎo)Bax蛋白表達(dá)；CpG ODN7909可以顯著誘導(dǎo)P38蛋白和Bax蛋白表達(dá)，且和多西他賽聯(lián)合后顯著地促進(jìn)Bax的表達(dá)。但TLR9基因沉默后，CpG ODN7909的這種作用也不再明顯。

根據(jù)以上結(jié)果我們推測(cè)，盡管CpG ODN7909與TLR9結(jié)合可以把細(xì)胞阻滯于G2/M期，也可以激活P38-Bax凋亡通路，但這種阻滯并沒(méi)有對(duì)細(xì)胞直接造成DNA損傷；但CpG ODN7909與TLR9結(jié)合后把A549和H520細(xì)胞阻滯于對(duì)多西他賽較敏感的G2/M期，激活的P38-Bax凋亡通路對(duì)多西他賽誘導(dǎo)的Bax凋亡也起到協(xié)同作用，可以使較多的細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而提高其對(duì)多西他賽的化療敏感性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CpG ODN7909與TLR9結(jié)合后能夠增強(qiáng)多西他賽抑制人肺癌A549和H520細(xì)胞的活力, 誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯，增強(qiáng)多西他賽對(duì)人肺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，進(jìn)而提高了這兩種這細(xì)胞對(duì)多西他賽的化療敏感性。但是，國(guó)外一個(gè)III期臨床試驗(yàn)已證明，吉西他濱和卡鉑聯(lián)合TLR9激動(dòng)劑并沒(méi)有改善NSCLC患者的總生存期或無(wú)進(jìn)展生存期，反而增加了化療的毒副反應(yīng)[22]。因此，GpG ODN7909是否適用于所有病理類型的NSCLC，是否適用于體內(nèi)研究及是否適用于臨床患者，仍需進(jìn)一步探索和深入研究，這將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

Figure 4.The protein expression of P38 and Bax in the A549 (A) and H520 (B) cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsuntreated group;##P<0.01vsCpG ODN7909 group;▼▼P<0.01vsDOC group.

圖4 A549和H520細(xì)胞中P38及Bax蛋白的表達(dá)

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

Activation of TLR9 affected chemotherapeutic sensitivity of doctaxel in human non-small cell lung cancer in vitro

YUAN Su-juan, QIAO Tian-kui, GAO Cai-xia, ZHUANG Xi-bing, CHEN Wei

(DepartmentofOncology,JinshanHospital，F(xiàn)udanUniversity,Shanghai201508,China.E-mail:qiaotk@163.com)

AIM: To probe whether CpG oligodeoxyribonucleotides 7909 (CpG ODN7909) combined with Toll like receptor (TLR)9 affected the chemotherapeutic sensitivity of doctaxel (DOC) in human lung cancer A549 and H520 cell lines. METHODS: Sequences of TLR9 siRNAs were designed. A549 and H520 cells were transfected with TLR9 siRNA by lipofectamine. The expression of TLR9 was detected by Western blot. The cell activity was measured by CCK-8 assay. The experiments were divided into blank control group, control siRNA group and TLR9 siRNA interference group. The cell cycle distribution and cell apoptosis were analyzed by flow cytometry. The expression of P38 and Bax was determined by Western blot. The cells in each group were exposed to CpG ODN7909 and/or DOC. RESULTS: In A549 cells and H520 cells, CpG ODN7909 alone had no obvious effect on the cell activity, G2/M phase arrest and apoptosis, but increased the protein expression of P38 and Bax (P<0.01). In addition， there was no significant changes of the above indexes in CpG ODN7909 treated-TLR9 siRNA group was observed. DOC alone significantly inhibited the cell activity, higher the G2/M phase fractions, apoptotic rates and Bax expression (P<0.01), but didn’t affect the expression of P38 in all 3 groups. Compared with the cells treated with DOC alone, the cells treated with CpG ODN7909 combined with DOC exhibited lower cell activity, higher G2/M phase fractions, apoptosis rates and more Bax expression (P<0.01), showed no significant change of P38 expression. In addition, there was no significant change of the above indexes in CpG ODN7909 combined with DOC treated-TLR9 siRNA group was observed. CONCLUSION: CpG ODN7909 may enhance the chemotherapeutic sensitivity of DOC in human lung cancer cells by combining with TLR9. The mechanism might be related to enhancing the inhibitory effect and apoptosis of DOC on the cell activityinvitro, arresting the cells at G2/M phase of the cells.

CpG ODN; Toll-like receptor 9; Chemotherapeutic sensitivity; Cell activity; Cell cycle; Apoptosis

1000- 4718(2016)10- 1799- 08

2016- 05- 26

2016- 08- 09

上海市衛(wèi)計(jì)委青年課題 (No. 2013-156)

△通訊作者 Tel: 021-34189990-5365; E-mail: qiaotk@163.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.011

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