TLR9激活后影響人非小細胞肺癌細胞對多西他賽化療敏感性的體外實驗*

袁素娟， 喬田奎， 高彩霞， 莊喜兵， 陳 偉

(復旦大學附屬金山醫(yī)院腫瘤科，上海 201508)

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TLR9激活后影響人非小細胞肺癌細胞對多西他賽化療敏感性的體外實驗*

袁素娟， 喬田奎△， 高彩霞， 莊喜兵， 陳 偉

(復旦大學附屬金山醫(yī)院腫瘤科，上海 201508)

目的： 探討含非甲基化CpG基序的寡脫氧核苷酸(CpG oligodeoxyribonucleotides 7909，CpG ODN7909)與Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)9結(jié)合后是否影響人肺癌A549和H520細胞對多西他賽(doctaxel，DOC)的化療敏感性及相關(guān)機制。方法: 設計并合成特異性干擾siRNA序列，轉(zhuǎn)染細胞，Western blot法檢測TLR9 siRNA的沉默效果，CCK-8法檢測細胞活力。設空白對照組、陰性對照組和TLR9 siRNA干擾組，分別接受CpG ODN7909和多西他賽單獨或聯(lián)合治療，流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡,Western blot法檢測P38及Bax蛋白表達。結(jié)果: 在2種細胞中，CpG ODN7909單獨處理后，細胞活力和凋亡率都無明顯變化，G2/M期細胞比例P38和Bax蛋白的表達明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909處理TLR9 siRNA干擾細胞各指標均無明顯變化。多西他賽單獨處理后3組細胞的細胞活力明顯下降，G2/M期細胞比例、凋亡率和Bax蛋白表達都明顯升高(P<0.01)，P38表達無明顯變化。與多西他賽單獨處理比較，多西他賽與CpG ODN7909聯(lián)合治療后細胞活力明顯下降，G2/M期細胞比例、凋亡率和Bax蛋白表達都明顯升高(P<0.01)，P38表達無明顯變化；聯(lián)合處理TLR9 siRNA干擾細胞各指標均無明顯變化。結(jié)論: CpG ODN7909與TLR9結(jié)合后可增強多西他賽抑制人肺癌細胞的細胞活力, 誘導G2/M期阻滯，增強多西他賽對細胞的凋亡誘導作用進而提高其對多西他賽的化療敏感性。

CpG ODN7909; Toll樣受體9; 化療敏感性; 細胞活力； 細胞周期； 細胞凋亡

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是存在于哺乳動物且與Toll蛋白同源的分子，是表達于多種免疫細胞的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)[1]。目前，在哺乳動物的身上共發(fā)現(xiàn)13種，其中人類有TLR1～TLR11共11種[2]。各個TLR受體與其特異性的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)相互作用，介導胞內(nèi)信號通路，引發(fā)天然與適應性免疫應答[3]。其中，TLR9受體特異性識別細菌、病毒、質(zhì)?；蚝羌谆疌pG基序的寡脫氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN)[4]。很多人癌細胞如肺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌等[5-8]也高表達TLR9。Xu等[9]報道CpG ODN通過結(jié)合TLR9，可刺激人肺癌95D細胞株增殖，誘導G2/M期細胞阻滯，但對細胞凋亡無明顯作用。Wang等[10]報道CpG ODN靶向刺激TLR9，能有效抑制體外人肺癌A549細胞增殖，并且促進細胞凋亡。且有研究發(fā)現(xiàn)，CpG ODN單獨作用于表達TLR9的腫瘤細胞，可直接或間接地影響細胞生長、細胞周期分布、細胞凋亡等，從而提高癌細胞的放化療敏感性[11-13]?？梢?，目前國內(nèi)外專家對TLR9與腫瘤發(fā)生發(fā)展以及放化療敏感性之間的關(guān)系意見不一。本課題初步研究TLR9對多西他賽(doctaxel,DOC)治療非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)化療敏感性的影響及其相關(guān)機制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

RPMI-1640和胎牛血清均購于Gibco；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen；兔抗人TLR9、P38、Bax和β-actin單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔 II 抗均購自CST；0.25 % EDTA-胰蛋白酶消化液、CCK-8試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；細胞周期試劑盒Annexin V-FITC/碘化丙啶 (propidium iodide，PI)及凋亡檢測試劑盒購自BD；多西他賽注射液由齊魯制藥有限公司提供。CpG ODN7909由上海生物工程有限公司合成，全鏈硫代修飾，并溶于無菌蒸餾水中，存于4 ℃?zhèn)溆?，其核苷酸序列?5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’。

2 細胞株

人肺癌A549和H520細胞株均購自中國科學院上海細胞研究所，培養(yǎng)于含10%小牛血清、1×105U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，0.25%的胰酶消化液傳代培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)生長期時用于進一步實驗。

3 實驗方法

3.1 siRNA的設計與制備 根據(jù)GenBank中TLR9人全長cDNA序列(Gene ID：54106)設計出siRNA序列。TLR9 siRNA的正義鏈為5’-CUAGACCUGUCCCACAAUATT-3’，反義鏈為5’-UAUUGUGGGACAGGUCUAGTT-3’；并設計合成陰性對照(control)siRNA序列：正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’,反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。上述序列均由上海吉瑪制藥公司合成并通過測序驗證，所有的siRNA均有熒光標記。

3.2 細胞轉(zhuǎn)染 待細胞生長至對數(shù)生長期時按每孔5×105個接種于6孔培養(yǎng)板，當細胞貼壁生長達60%融合時，更換1.5 mL無雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基及5 μL LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染100 nmol/L的siRNA，6 h后更換為含有雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)放入37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h用于后續(xù)實驗。實驗分為TLR9 siRNA干擾組、陰性對照組和空白對照組?？瞻讓φ战M以等量培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染體系。

3.3 CCK-8法測定細胞活力 取對數(shù)生長期的各組細胞，接種在96孔板中(每孔4×103個細胞)，4～6 h細胞貼壁后，加入CpG ODN7909使終濃度為10 mg/L，設置3個平行樣本。培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液中加入多西他賽,使終濃度分別為0、5、10、25、50、100 nmol/L。分別繼續(xù)培養(yǎng),48 h后向培養(yǎng)板每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃繼續(xù)溫育2 h。用酶標儀測定細胞懸液在450 nm處的吸光度(A)值。細胞存活率(%)=實驗組平均A值/對照組平均A值×100%。

3.4 Western blot法檢測TLR9、Bax和P38蛋白的表達 轉(zhuǎn)染24 h后，裂解各組細胞，抽提蛋白，BCA法測定蛋白含量；每孔上樣蛋白50 μg，經(jīng)6% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(200 V恒壓電泳90 min)分離后，以200 mA恒流濕法轉(zhuǎn)膜120 min。然后將膜用10%脫脂奶粉室溫封閉 2 h。TBST溶液清洗3次，每次10 min; 之后加入TLR9、Bax或P38的I抗，置于搖床上 4 ℃孵育過夜。第2天棄去 I 抗，TBST清洗 10 min 3次；洗膜后加入 II 抗(1∶5 000)，室溫作用120 min，再用TBST洗膜10 min 3次。用超敏ECL化學發(fā)光試劑檢測蛋白條帶，暗室曝光獲得影像膠片。

3.5 PI單染法檢測細胞周期 25 nmol/L多西他賽給藥后的各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用胰酶消化和收集各組貼壁細胞，1 000×g離心3～5 min沉淀細胞，用冷PBS洗2次，預冷的70%乙醇固定于-20 ℃過夜，檢測時離心(4 ℃，1 000×g，5 min)除去乙醇，冷PBS洗2次，棄上清。加入PI 0.5 mL，4℃避光孵育30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期，Wincycle32軟件分析不同細胞群體DNA含量。

3.6 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡 25 nmol/L多西他賽給藥后的各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用胰酶消化和收集各組細胞(包括上清液中的細胞)，用預冷的PBS洗滌3次，取5×105細胞懸液，加入100 μL結(jié)合緩沖液重懸，再加入5 μL Annexin V和5 μL PI溶液，輕輕混勻，室溫避光染色處理30 min，上流式細胞儀(BD)檢測，CELL Quest軟件進行數(shù)據(jù)獲取，分析得出細胞凋亡率。細胞凋亡率=各組凋亡細胞數(shù)/各組總細胞數(shù)。

4 統(tǒng)計學處理

所有實驗均重復3次。使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本資料的t檢驗；多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，若方差齊時，采用Bonferroni校正的t檢驗，方差不齊時則采用Dunnett’s T3法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 TLR9 siRNA對TLR9蛋白表達的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，在A549細胞和H520細胞中，空白對照組和陰性對照組的細胞都有TLR9表達，且2組表達水平的差異無統(tǒng)計學顯著性；TLR9 siRNA轉(zhuǎn)染細胞TLR9表達都明顯低于空白對照組(P<0.01)，2種細胞的抑制率分別為(84.63±0.58)%和(85.79±0.76)%。此結(jié)果證明了TLR9 siRNA具有特異性抑制TLR9表達的功能，見圖1。

Figure 1.The expression of TLR9 in A549 (A) and H520 (B) cells was successfully silenced by TLR9 siRNA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group.

圖1 TLR9 siRNA可抑制A549細胞中TLR9蛋白的表達

2 TLR9與CpG ODN7909結(jié)合對細胞活力及對多西他賽化療敏感性的影響

CCK-8實驗檢測結(jié)果顯示，A549和H520細胞經(jīng)多西他賽處理48 h后，隨著藥物濃度的增高,兩種細胞中3組細胞存活率均呈下降趨勢, 呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。A549和H520細胞空白對照組、陰性對照組IC50值分別為(58.38±1.33)nmol/L、(62.77±1.20)nmol/L和(57.76±1.32)nmol/L、(63.94±0.93)nmol/L，接受CpG ODN7909治療后分別下降為(25.80±0.16)nmol/L、(30.96±1.25)nmol/L和(25.74±0.36)nmol/L、(30.51±2.43)nmol/L，差異都有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)；A549和H520細胞TLR9 siRNA組IC50值分別為(58.13±1.35)nmol/L、(64.22±1.03)nmol/L，接受CpG ODN7909治療后分別為(57.34±1.30)nmol/L、(63.32±0.91)nmol/L，差異都無統(tǒng)計學顯著性。以上說明CpG ODN7909與TLR9結(jié)合可增強人肺癌A549和H520細胞對多西他賽的敏感性。CpG ODN7909單獨作用后細胞的活力與空白對照組細胞差異無統(tǒng)計學意義，見圖2。

Figure 2.The effects of CpG ODN7909 combined with TLR9 on the cell activity and chemotherapeutic sensitivity of A549 (A) and H520 (B) cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group;##P<0.01vscontrol siRNA group.

圖2 CpG ODN7909與TLR9結(jié)合對人肺癌A549和H520細胞活力及對多西他賽化療敏感性的影響

3 TLR9與CpG ODN7909結(jié)合對多西他賽誘導人肺癌A549細胞周期阻滯的影響

由表1可見，空白對照和陰性對照細胞經(jīng)CpG ODN7909或多西他賽單獨處理后較未處理時的G2/M期細胞比例都明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合治療時較多西他賽單獨治療時的G2/M期細胞比例明顯升高(P<0.01)。TLR9 siRNA組經(jīng)CpG ODN7909單獨處理后和未經(jīng)處理時的G2/M期細胞比例之間的差異無統(tǒng)計學顯著性；而經(jīng)多西他賽單獨處理后的G2/M期細胞比例明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合治療時的G2/M期細胞比例與多西他賽單獨治療時的G2/M期細胞比例相比差異無統(tǒng)計學顯著性。

4 TLR9與CpG ODN7909結(jié)合對多西他賽誘導人肺癌A549細胞凋亡的影響

空白對照和陰性對照細胞經(jīng)CpG ODN7909單獨處理后的細胞凋亡率與未經(jīng)處理時的凋亡率比較差異無統(tǒng)計學顯著性；經(jīng)多西他賽單獨處理后的細胞凋亡率都明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合作用后的細胞凋亡率明顯高于多西他賽單獨處理組(P<0.01)。TLR9 siRNA轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)CpG ODN7909單獨處理后的細胞凋亡率與未經(jīng)處理時的細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學顯著性；經(jīng)多西他賽單獨處理后細胞凋亡率都明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合治療時的細胞凋亡率與接受多西他賽單獨治療組比較差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

5 TLR9與CpG ODN7909結(jié)合對P38、Bax表達的影響

如圖4所示，空白對照組和陰性對照組的細胞經(jīng)CpG ODN7909單獨處理后，P38蛋白和Bax蛋白表達都明顯升高(P<0.01)；多西他賽單獨處理對P38蛋白的表達無明顯影響，Bax蛋白表達明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合較多西他賽單獨處理使P38蛋白和Bax蛋白表達進一步升高(P<0.01)。TLR9 siRNA轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)CpG ODN7909單獨處理后，P38蛋白和Bax蛋白表達未見明顯變化；經(jīng)多西他賽單獨處理后P38蛋白表達無明顯變化，Bax蛋白表達明顯升高(P<0.01)；CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合治療時P38蛋白和Bax蛋白的表達水平與接受多西他賽單獨治療組相比差異無統(tǒng)計學顯著性。

討 論

化學藥物治療在非小細胞肺癌治療中發(fā)揮重要作用。多西他賽是一種紫杉醇類抗腫瘤藥物，廣泛應用于非小細胞肺癌治療，但因為腫瘤細胞往往對化療藥物不敏感，或具有先天性或獲得性耐藥，并非所有患者都獲得令人滿意的效果，因此，臨床醫(yī)生亟需可提高其化療敏感性的方法。TLR9與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，CpG ODN是其配體，兩者結(jié)合后相互作用，介導胞內(nèi)信號通路[14-15]。有研究顯示，在NSCLC組織和肺癌細胞株中，TLR9表達異常增高，與預后呈負相關(guān)，其可能通過信號轉(zhuǎn)導通路促進腫瘤細胞增殖生長[16]；但目前已有多個研究顯示TLR9與CpG ODN相互作用可影響到腫瘤細胞的放化療敏感性[11-13]，因此我們推斷TLR9與CpG ODN相互作用可能也影響人肺癌細胞對多西他賽的化療敏感性。

表1 CpG ODN7909與TLR9結(jié)合增強多西他賽誘導人肺癌A549和H520細胞周期阻滯的作用

Table 1.CpG ODN7909 combined with TLR9 enhanced induction of cell cycle arrest by doctaxel in A549 and H520 cells (Mean±SD.n=3)

Cells Group TreatmentCellcycle(%) G2/M G1 SA549BlankcontrolUntreated6．05±0．0754．09±0．1539．87±0．12CpGODN790911．40±0．36??62．02±0．1226．53±0．49DOC16．17±0．25??59．85±0．0923．91±0．37CpGODN7909+DOC30．57±0．35??##▼▼53．78±0．6015．30±0．28ControlsiRNAUntreated6．00±0．1153．27±0．1940．74±0．30CpGODN790911．60±0．40??61．43±0．6226．62±0．42DOC16．90±0．40??59．82±0．5523．22±0．91CpGODN7909+DOC31．07±0．25??##▼▼53．68±0．6015．20±0．36TLR9siRNAUntreated6．17±0．1953．36±0．2940．48±0．47CpGODN79096．10±0．2154．37±0．3339．54±0．53DOC17．20±0．30??59．22±0．1623．54±0．44CpGODN7909+DOC16．50±0．40??##59．90±0．0223．54±0．43H520BlankcontrolUntreated6．72±0．2754．09±0．4238．76±0．65CpGODN790911．97±0．23??60．76±0．2527．26±0．20DOC15．78±0．54??59．98±0．4824．24±0．36CpGODN7909+DOC29．32±0．56??##▼▼55．12±0．2315．56±0．47ControlsiRNAUntreated6．76±0．2753．64±0．3639．60±0．37CpGODN790912．21±0．41??60．51±0．6927．29±0．28DOC15．88±0．16??60．01±0．3724．11±0．34CpGODN7909+DOC30．24±0．11??##▼▼54．36±0．3715．40±0．38TLR9siRNAUntreated6．84±0．0853．98±0．3039．64±0．33CpGODN79096．43±0．3754．14±0．4439．44±0．60DOC16．17±0．32??59．82±0．6024．01±0．46CpGODN7909+DOC16．08±0．07??##59．91±0．1724．01±0．16

**P<0．01vsuntreated group;##P<0．01vsCpG ODN group;▼▼P<0.01vsDOC group.

在本研究中，CCK-8實驗結(jié)果顯示，多西他賽可以明顯降低A549和H520細胞的活力，且呈劑量依賴性。CpG ODN7909單獨作用并不能明顯抑制A549和H520細胞的活力，但可以明顯增強多西他賽對細胞的抑制能力，A549和H520細胞的IC50值經(jīng)CpG ODN7909和多西他賽聯(lián)合治療后都明顯下降,但這種作用在TLR9蛋白表達受到抑制后不復存在，說明CpG ODN是通過激活TLR9受體而起作用的。

為初步了解TLR9與CpG ODN結(jié)合影響多西他賽敏感性的機制，本研究觀察了人肺癌A549和H520細胞細胞周期阻滯和凋亡情況。 Zeng等[17]研究表明，多西他賽不僅可誘導細胞發(fā)生G2/M期阻滯，并且可誘導細胞凋亡，凋亡發(fā)生于G2/M期阻滯之后，因此多西他賽對G2/M期細胞的凋亡誘導作用較明顯，G2/M期細胞對多西他賽的化療敏感性較好。我們的研究發(fā)現(xiàn)，多西他賽或CpG ODN7909單獨作用都可以顯著地把細胞阻滯在G2/M期，且兩者聯(lián)合阻滯作用更明顯。當TLR9蛋白表達顯著下調(diào)后，CpG ODN7909誘導周期阻滯的作用及增強多西他賽誘導阻滯的作用都消失了。多西他賽可以顯著地誘導細胞凋亡；CpG ODN7909單獨作用并不能誘導細胞凋亡，但可以明顯增強多西他賽對細胞的凋亡誘導作用；同樣，TLR9基因沉默后，CpG ODN7909的這種作用也不再明顯。

Figure 3.CpG ODN7909 combined with TLR9 enhanced the apoptosis induction effect of doctaxel on A549 and H520 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsuntreated group;##P<0.01vsCpG ODN7909 group;▼▼P<0.01vsDOC group.

圖3 TLR9與CPG ODN7909結(jié)合對人肺癌A549和H520細胞凋亡的影響

TLR9受體與配體結(jié)合后可激活ERK、JNK和P38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)3個MAPK家族的信號通路，其中P38 MAPK參與了細胞內(nèi)應激反應、增殖、凋亡等多種生物學過程[18]。許多促凋亡基因都是通過P38 MAPK通路發(fā)揮其治療作用的[19]，如誘導Bax轉(zhuǎn)位等[20-21]。為了初步探討TLR9與CpG ODN7909結(jié)合后影響多西他賽誘導人肺癌A549和H520細胞凋亡時可能涉及的相關(guān)通路，我們檢測了P38蛋白和促凋亡蛋白Bax表達情況，發(fā)現(xiàn)多西他賽不能顯著誘導P38蛋白表達，但可以顯著地誘導Bax蛋白表達；CpG ODN7909可以顯著誘導P38蛋白和Bax蛋白表達，且和多西他賽聯(lián)合后顯著地促進Bax的表達。但TLR9基因沉默后，CpG ODN7909的這種作用也不再明顯。

根據(jù)以上結(jié)果我們推測，盡管CpG ODN7909與TLR9結(jié)合可以把細胞阻滯于G2/M期，也可以激活P38-Bax凋亡通路，但這種阻滯并沒有對細胞直接造成DNA損傷；但CpG ODN7909與TLR9結(jié)合后把A549和H520細胞阻滯于對多西他賽較敏感的G2/M期，激活的P38-Bax凋亡通路對多西他賽誘導的Bax凋亡也起到協(xié)同作用，可以使較多的細胞發(fā)生凋亡，從而提高其對多西他賽的化療敏感性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CpG ODN7909與TLR9結(jié)合后能夠增強多西他賽抑制人肺癌A549和H520細胞的活力, 誘導細胞G2/M期阻滯，增強多西他賽對人肺癌細胞的凋亡誘導作用，進而提高了這兩種這細胞對多西他賽的化療敏感性。但是，國外一個III期臨床試驗已證明，吉西他濱和卡鉑聯(lián)合TLR9激動劑并沒有改善NSCLC患者的總生存期或無進展生存期，反而增加了化療的毒副反應[22]。因此，GpG ODN7909是否適用于所有病理類型的NSCLC，是否適用于體內(nèi)研究及是否適用于臨床患者，仍需進一步探索和深入研究，這將是我們下一步研究的重點。

Figure 4.The protein expression of P38 and Bax in the A549 (A) and H520 (B) cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsuntreated group;##P<0.01vsCpG ODN7909 group;▼▼P<0.01vsDOC group.

圖4 A549和H520細胞中P38及Bax蛋白的表達

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Activation of TLR9 affected chemotherapeutic sensitivity of doctaxel in human non-small cell lung cancer in vitro

YUAN Su-juan, QIAO Tian-kui, GAO Cai-xia, ZHUANG Xi-bing, CHEN Wei

(DepartmentofOncology,JinshanHospital，F(xiàn)udanUniversity,Shanghai201508,China.E-mail:qiaotk@163.com)

AIM: To probe whether CpG oligodeoxyribonucleotides 7909 (CpG ODN7909) combined with Toll like receptor (TLR)9 affected the chemotherapeutic sensitivity of doctaxel (DOC) in human lung cancer A549 and H520 cell lines. METHODS: Sequences of TLR9 siRNAs were designed. A549 and H520 cells were transfected with TLR9 siRNA by lipofectamine. The expression of TLR9 was detected by Western blot. The cell activity was measured by CCK-8 assay. The experiments were divided into blank control group, control siRNA group and TLR9 siRNA interference group. The cell cycle distribution and cell apoptosis were analyzed by flow cytometry. The expression of P38 and Bax was determined by Western blot. The cells in each group were exposed to CpG ODN7909 and/or DOC. RESULTS: In A549 cells and H520 cells, CpG ODN7909 alone had no obvious effect on the cell activity, G2/M phase arrest and apoptosis, but increased the protein expression of P38 and Bax (P<0.01). In addition， there was no significant changes of the above indexes in CpG ODN7909 treated-TLR9 siRNA group was observed. DOC alone significantly inhibited the cell activity, higher the G2/M phase fractions, apoptotic rates and Bax expression (P<0.01), but didn’t affect the expression of P38 in all 3 groups. Compared with the cells treated with DOC alone, the cells treated with CpG ODN7909 combined with DOC exhibited lower cell activity, higher G2/M phase fractions, apoptosis rates and more Bax expression (P<0.01), showed no significant change of P38 expression. In addition, there was no significant change of the above indexes in CpG ODN7909 combined with DOC treated-TLR9 siRNA group was observed. CONCLUSION: CpG ODN7909 may enhance the chemotherapeutic sensitivity of DOC in human lung cancer cells by combining with TLR9. The mechanism might be related to enhancing the inhibitory effect and apoptosis of DOC on the cell activityinvitro, arresting the cells at G2/M phase of the cells.

CpG ODN; Toll-like receptor 9; Chemotherapeutic sensitivity; Cell activity; Cell cycle; Apoptosis

1000- 4718(2016)10- 1799- 08

2016- 05- 26

2016- 08- 09

上海市衛(wèi)計委青年課題 (No. 2013-156)

△通訊作者 Tel: 021-34189990-5365; E-mail: qiaotk@163.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.011

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