質(zhì)子泵抑制劑泮托拉唑鈉抑制肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和順鉑耐藥的機(jī)制研究*

宋 嘉， 王 劍， 李 玉， 胡慧珍， 嚴(yán) 杰， 吳麗君， 徐 煒， 陳清勇

(中國人民解放軍第一一七醫(yī)院，浙江 杭州 310013)

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質(zhì)子泵抑制劑泮托拉唑鈉抑制肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和順鉑耐藥的機(jī)制研究*

宋 嘉▲， 王 劍▲， 李 玉， 胡慧珍， 嚴(yán) 杰， 吳麗君， 徐 煒， 陳清勇△

(中國人民解放軍第一一七醫(yī)院，浙江 杭州 310013)

目的： 探索泮托拉唑鈉(pantoprazole sodium，PPZ)抑制肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和順鉑耐藥的分子機(jī)制。方法: 通過MTT法、劃痕修復(fù)實驗、Transwell實驗和Western blot 法比較A549細(xì)胞與A549/DDP細(xì)胞之間的形態(tài)、侵襲能力、遷移能力、藥物敏感性和蛋白表達(dá)差異, 觀察泮托拉唑鈉對A549/DDP細(xì)胞的形態(tài)、侵襲能力、遷移能力、藥物敏感性和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果: 與A549細(xì)胞比較，A549/DDP細(xì)胞存在高侵襲能力、高遷移能力、對順鉑耐藥、具有間質(zhì)表型和c-Met/AKT/mTOR通路活化等特點，泮托拉唑鈉可抑制A549/DDP細(xì)胞的侵襲和遷移能力，逆轉(zhuǎn)其耐藥及間質(zhì)表型，抑制c-Met/AKT/mTOR通路的活化。應(yīng)用c-Met抑制劑SU11274、PI3K抑制劑LY294002和mTOR抑制劑rapamycin處理A549/DDP細(xì)胞后的作用與泮托拉唑鈉相似。結(jié)論: 泮托拉唑鈉抑制c-Met/AKT/mTOR信號通路抑制肺癌細(xì)胞侵襲、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和順鉑耐藥。

泮托拉唑鈉； 肺癌； 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化； 耐藥

肺癌已成為發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，而轉(zhuǎn)移和耐藥是晚期肺癌患者死亡的主要原因[1]。如何抑制肺癌轉(zhuǎn)移及耐藥是當(dāng)前肺癌治療的核心問題之一。順鉑是臨床一線化療的常用藥物，而隨著疾病進(jìn)展，臨床上肺癌患者最終不可避免地出現(xiàn)對順鉑耐藥，致使化療失敗，最終導(dǎo)致患者死亡。因此，發(fā)現(xiàn)新的藥物、提高肺癌對順鉑化療敏感性有望延長肺癌患者生存期，從而使肺癌患者獲益，具有十分重要的臨床意義。

以往的研究顯示，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥密切相關(guān)[2-3]，而近期發(fā)表在《Nature》的2個研究顯示[4-5]，較腫瘤轉(zhuǎn)移而言，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能與腫瘤耐藥的關(guān)系更加密切，進(jìn)一步凸顯了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤耐藥中的地位。由此可見，抑制腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能是逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的重中之重。

質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors，PPIs)是臨床上用于治療泌酸相關(guān)疾病的藥物，常用于治療胃炎、胃潰瘍、食管炎等疾病，而近年來有越來越多的文獻(xiàn)報道將其用于治療腫瘤的研究。目前已有報道，PPIs可通過多種途徑抑制胃癌[6]、乳腺癌[7]、黑色素瘤[8]、肝癌[9]、胰腺癌[10]等多種腫瘤的增殖，誘導(dǎo)凋亡，逆轉(zhuǎn)其耐藥。而關(guān)于其在肺癌中的作用及其相關(guān)機(jī)制尚無文獻(xiàn)報道。本研究將探索泮托拉唑鈉(pantoprazole sodium，PPZ)能否逆轉(zhuǎn)肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和對順鉑耐藥及其可能存在的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞系 A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 主要試劑 泮托拉唑鈉購自杭州中美華東制藥有限公司；用生理鹽水配制成20 g/L濃度母液備用，-20 ℃保存；MTT、順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，DDP)購自Sigma；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自杭州化學(xué)試劑有限公司；Transwell小室購自Pierce；c-Met抑制劑SU11274、PI3K抑制劑LY294002和mTOR抑制劑rapamycin購自Selleck Chemicals；抗p-c-Met(Y1234/35)、c-Met、p-Akt(S473)、p-mTOR(S2448)、Akt、mTOR、GAPDH等抗體購自Cell Signaling Technology；羊抗兔IgG II 抗購自Jackson。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素(終濃度為1×105U/L)的RPMI-1640(Gibco)培養(yǎng)液，常規(guī)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期細(xì)胞實驗。

2.2 MTT實驗 實驗分組分為DDP、DDP+低劑量(20 mg/L)PPZ組、DDP+中劑量(40 mg/L)PPZ組、DDP+高劑量(80 mg/L)PPZ組或DDP、DDP+SU11274(0.5 μmol/L)組、DDP+LY294002(0.5 μmol/L)組和DDP+rapamycin(10 nmol/L)組。胰酶消化細(xì)胞后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5 000個。孵育12 h后細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)基，加入含順鉑濃度分別為0、2.5、5、10、20、30、40 μmol/L的順鉑和上述濃度的泮托拉唑鈉、SU11274、LY294002、rapamycin的全血清培養(yǎng)基200 μL，24 h換液1次，處理48 h后，各孔加20 μL MTT 溶液(5 g/L，無菌PBS配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基，各孔加入150 μL DMSO，搖床避光輕搖10 min，每孔吸100 μL置于另一96孔板內(nèi)，酶標(biāo)儀在490 nm處檢測吸光度(A)值，繪制細(xì)胞抑制率曲線。每組設(shè)5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.3 劃痕修復(fù)實驗 接種3×105個A549或A549/DDP細(xì)胞于6孔板，待細(xì)胞融合度為80%時，在板內(nèi)進(jìn)行劃痕、拍照。吸去培養(yǎng)基，加入2.5%血清培養(yǎng)基，或含有上述濃度的泮托拉唑鈉及SU11274、LY294002、rapamycin的培養(yǎng)基，處理24 h后在原先拍照的位置進(jìn)行拍照。劃痕修復(fù)率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.4 Transwell實驗 75%乙醇浸泡小室，晾干后于超凈臺內(nèi)紫外照射30 min備用，常規(guī)消化細(xì)胞后離心，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約為15×104個；上室接種200 μL細(xì)胞懸液，下室加600 μL含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基；用上述濃度的泮托拉唑鈉、SU11274、LY294002或rapamycin處理細(xì)胞，不作任何處理設(shè)為對照組；12 h后取出上室，棉簽擦去上室的細(xì)胞，甲醇固定20 min，晾干后0.1‰的結(jié)晶紫染色45 min，PBS清洗2次；在顯微鏡下隨機(jī)取4個視野，拍照并計算穿膜細(xì)胞數(shù)。

2.5 Western blot 實驗 用RAPI 裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行蛋白定量，每個泳道上蛋白樣品10 μg，8% SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)印(300 mA、120 min)到PVDF上。5%脫脂牛奶或牛血清白蛋白室溫封閉1 h。分別加入對應(yīng) I 抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入 II 抗孵育2 h后洗膜，加入ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析條帶灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

以上實驗均至少重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺癌耐順鉑細(xì)胞株存在間充質(zhì)表型及c-Met/AKT/mTOR通路活化

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞呈聚集生長，細(xì)胞形態(tài)呈卵圓形；A549/DDP細(xì)胞生長相對較為分散，細(xì)胞體型較大，形態(tài)呈長梭形、多角形，見圖1。通過劃痕及Transwell實驗發(fā)現(xiàn)， 與A549細(xì)胞比較，A549/DDP細(xì)胞存在更高的遷移能力(P<0.05)和侵襲能力(P<0.01)，見圖2、3。MTT結(jié)果顯示，與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性更低(P<0.05)，見圖4。Western blot 實驗結(jié)果顯示，與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞中E-cadherin相對低表達(dá)，vimentin、c-Met、AKT、mTOR相對高表達(dá)以及AKT、mTOR磷酸化水平升高(P<0.05)，見圖5。

2 泮托拉唑鈉抑制A549/DDP侵襲、遷移

泮托拉唑鈉可呈濃度依賴性抑制A549/DDP細(xì)胞的侵襲和遷移能力，見圖6、7。

Figure 1. The cellular morphology of A549 cells and A549/DDP cells (×200).

圖1 A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞的形態(tài)觀察

Figure 2. Different invasion abilities of A549/DDP cells and A549 cells (×100). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsA549 group.

圖2 A549/DDP細(xì)胞和A549細(xì)胞不同侵襲能力的比較

Figure 3.Different migration abilities between A549/DDP cells and A549 cells (×40). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsA549 group.

圖3 A549/DDP細(xì)胞和A549細(xì)胞不同的遷移能力

Figure 4. Different cisplatin sensitivity between A549/DDP cells and A549 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsA549 group.

圖4 A549/DDP細(xì)胞和A549細(xì)胞對順鉑不同的敏感性

Figure 5. The different protein expression levels between A549/DDP cells and A549 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsA549 group.

圖5 不同信號通路相關(guān)蛋白水平在A549/DDP細(xì)胞和A549細(xì)胞中的差異比較

Figure 6.Pantoprazole sodium (PPZ) inhibitied the invasion ability of A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsDDP group.

圖6 泮托拉唑鈉抑制A549/DDP細(xì)胞的侵襲能力

3 泮托拉唑鈉逆轉(zhuǎn)A549/DDP間質(zhì)表型及順鉑耐藥

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，加入泮托拉唑鈉后，A549/DDP細(xì)胞的數(shù)量減少，形態(tài)變得細(xì)小，絲狀偽足增加，折光性增強(qiáng)，見圖8。MTT結(jié)果顯示，泮托拉唑鈉可顯著增加耐藥細(xì)胞株對順鉑的敏感性，并且呈濃度依賴性，見圖9。Western blot 實驗結(jié)果顯示，不同濃度泮托拉唑鈉處理細(xì)胞48 h后，E-cadherin的表達(dá)較無藥物處理組增加，vimentin表達(dá)較無藥物處理組減少，見圖10。

4 泮托拉唑鈉抑制c-Met/AKT/mTOR通路活化

Western blot 實驗的結(jié)果顯示，泮托拉唑鈉可呈濃度依賴性地下調(diào)c-Met、AKT和mTOR的表達(dá)，同時抑制AKT和mTOR的磷酸化(磷酸化c-Met沒有檢測出可能與細(xì)胞株本身低表達(dá)該蛋白有關(guān))，見圖11。

Figure 7. Pantoprazole sodium (PPZ) inhibitied A549/DDP cell migration (×100). Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDDP group.

圖7 泮托拉唑鈉抑制A549/DDP細(xì)胞遷移

Figure 8.The effect of pantoprazole sodium (PPZ) on the morphological changes of A549/DDP cells (×200).

圖8 泮托拉唑鈉對A549/DDP細(xì)胞形態(tài)的影響

5 SU11274、LY294002和rapamycin抑制A549/DDP的侵襲和遷移能力

與對照組相比，加入SU11274、LY294002和rapamycin處理后，A549/DDP細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯被抑制 見圖12、13。

6 SU11274、LY294002和rapamycin逆轉(zhuǎn)A549/DDP間質(zhì)表型及順鉑耐藥

SU11274、LY294002和rapamycin處理細(xì)胞后，A549/DDP細(xì)胞的形態(tài)由長梭形變?yōu)槁褕A形，見圖14。MTT結(jié)果表明，SU11274、LY294002和rapamycin可顯著增加耐藥細(xì)胞株對順鉑的敏感性，見圖15。SU11274、LY294002和rapamycin分別是c-Met、AKT和mTOR抑制劑，可抑制其磷酸化，Western blot 實驗結(jié)果顯示，SU11274、LY294002和rapamycin均可上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)vimentin的表達(dá)，見圖16。

Figure 9.Pantoprazole sodium (PPZ) increased the sensitivity of A549/DDP cells to cisplatin. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDDP group.

圖9 泮托拉唑鈉增加A549/DDP細(xì)胞對順鉑敏感性

Figure 10. The effect of pantoprazole sodium (PPZ) on the protein expression of E-cadherin and vimentin in A549/DDP cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDDP group.

圖10 泮托拉唑鈉對A549/DDP細(xì)胞E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)的影響

Figure 11. Pantoprazole sodium (PPZ) inhibited the c-Met/AKT/mTOR signaling pathway activation in A549/DDP cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDDP group．

圖11 泮托拉唑鈉抑制c-Met/AKT/mTOR通路活化

討 論

質(zhì)子泵抑制劑是空泡型質(zhì)子泵(vacuolar H+-ATPases，V-H+-ATPases)的抑制劑，可抑制該泵的活動，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)外pH梯度，是經(jīng)典的抑酸藥物。缺氧和酸化是腫瘤微環(huán)境的重要特征之一，腫瘤細(xì)胞通過無氧糖酵解產(chǎn)生大量H+，通過V-H+-ATPases維持胞外環(huán)境酸化及胞內(nèi)中性環(huán)境，從而維持腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及耐藥[11]。近年來許多對該藥物在抗腫瘤方面的研究正是基于對V-H+-ATPases的調(diào)控。Lee等[12]發(fā)現(xiàn)，V-H+-ATPases在卵巢上皮細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，在癌旁組織中不表達(dá)，并且高表達(dá)的患者生存期顯著低于低表達(dá)患者。通過對多個細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn)，V-H+-ATPases在耐藥株中普遍高表達(dá)，而質(zhì)子泵抑制劑可逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對化療藥物耐藥，同時可協(xié)同化療藥物抑制動物耐藥模型中瘤體的生長和瘤內(nèi)V-H+-ATPases表達(dá)。同樣，學(xué)者也發(fā)現(xiàn)PPIs可通過抑制V-H+-ATPases表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[13-14]。

除了對V-H+-ATPases作用以外，PPIs還可通過其它途徑克服腫瘤耐藥，如抑制自噬、調(diào)控特異信號通路、逆轉(zhuǎn)EMT等。王軍等[15]發(fā)現(xiàn)泮托拉唑鈉可激活mTOR抑制自噬從而提高胃癌SGC7901細(xì)胞株對順鉑的敏感性。Tan等[7]發(fā)現(xiàn)泮托拉唑鈉可抑制自噬，增加乳腺癌MCF-7細(xì)胞對多西他賽的敏感性。李建琦等[6]發(fā)現(xiàn)PPIs可通過抑制PI3K/AKT/mTOR途徑下調(diào)細(xì)胞內(nèi)P-gp、MRP1表達(dá)，提高耐藥株胞內(nèi)藥物濃度，逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)泮托拉唑鈉可通過抑制AKT/GSK-β/β-catenin途徑抑制胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，逆轉(zhuǎn)胃癌對阿霉素的耐藥。而Huang等[17]研究證實PPIs可能是通過抑制STAT磷酸化途徑來逆轉(zhuǎn)胃癌對順鉑耐藥。此外，Lindner等[18]報道埃索美拉唑抑制食道癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、增加其對藥物敏感性，可能是通過調(diào)控耐藥相關(guān)miRNAs來實現(xiàn)的。

上述研究表明，PPIs可通過多種途徑對多種腫瘤細(xì)胞發(fā)揮強(qiáng)大的藥理作用，但能否對肺癌細(xì)胞發(fā)揮作用、分子機(jī)制如何尚無研究報道。我們的實驗研究發(fā)現(xiàn)，肺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP與敏感株A549相比，存在高侵襲、遷移能力、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型和c-Met/AKT/mTOR通路活化的差異。而研究證實上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤耐藥的關(guān)鍵因素之一，c-Met及其下游PI3K/AKT/mTOR信號既是調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要途徑，也是導(dǎo)致耐藥的分子機(jī)制。Chen等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-206可通過抑制和c-Met/PI3K/AKT/mTOR途徑逆轉(zhuǎn)肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及順鉑耐藥。Caadas等[20]研究證實，c-Met抑制劑可抑制小細(xì)胞肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而克服對化療藥物耐藥。La Monica等[21]發(fā)現(xiàn)c-Met擴(kuò)增可導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和化療藥物耐藥，吉非替尼可抑制c-Met擴(kuò)增從而克服上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及耐藥。因此我們假設(shè)泮托拉唑鈉可以經(jīng)過c-Met及其下游途徑來逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和順鉑耐藥。

Figure 12. SU11274， LY294002 and rapamycin inhibited the invasion ability of A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsDDP group.

圖12 SU11274、LY294002和rapamycin抑制A549/DDP細(xì)胞的侵襲能力

Figure 13. SU11274, LY294002 and rapamycin inhibited A549/DDP cell migration (×40). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsDDP group.

圖13 SU11274、LY294002和rapamycin抑制A549/DDP細(xì)胞遷移

Figure 14. The effects of SU11274, LY294002 and rapamycin on the morphological changes of A549/DDP cells (×200).

圖14 SU11274、LY294002和rapamycin對A549/DDP細(xì)胞形態(tài)的影響

Figure 15. SU11274, LY294002 and rapamycin increased the sensitivity of A549/DDP cells to cisplatin. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDDP group.

圖15 SU11274、LY294002和rapamycin增加A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性

Figure 16.The effects of SU11274, LY294002 and rapamycin on the protein expression of E-cadherin and vimentin in A549/DDP cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDDP group.

圖16 SU11274、LY294002和rapamycin對A549/DDP細(xì)胞E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)的影響

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過不同劑量泮托拉唑鈉處理后，A549/DDP細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯減弱，同時其對順鉑的敏感性明顯增加，進(jìn)一步用Western blot 實驗檢測發(fā)現(xiàn)，泮托拉唑鈉可顯著增加E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)vimentin的表達(dá)，c-Met和AKT和mTOR表達(dá)也有下調(diào)，AKT和mTOR磷酸化水平被顯著抑制。我們的實驗結(jié)果與李建琦等[6]的研究結(jié)果相類似，即質(zhì)子泵抑制劑可抑制AKT、mTOR表達(dá)及其磷酸化，但與王軍等[15]的研究結(jié)果存在部分出入，其研究結(jié)果認(rèn)為是泮托拉唑鈉是通過激活mTOR抑制自噬水平來逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥。分析原因可能是王軍等使用的是順鉑敏感的胃癌細(xì)胞株，而李建琦等采用的是順鉑耐藥的胃癌細(xì)胞株，2種細(xì)胞株的耐順鉑機(jī)制可能是不同的。而本研究采用的是耐順鉑肺癌細(xì)胞株，泮托拉唑鈉逆轉(zhuǎn)其耐藥機(jī)制可能是通過抑制mTOR途徑發(fā)揮作用。此外mTOR可分為mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合體，兩者對腫瘤細(xì)胞的生長、分化、轉(zhuǎn)移及自噬有不同的作用機(jī)理，在耐藥方面，費世江等[22]通過對比不同肺癌細(xì)胞株后發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)狀態(tài)下EGFR TKI敏感和耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有不同的mTOR相關(guān)信號通路、Erk及Jak-STAT3信號通路活化狀態(tài)。耐藥細(xì)胞mTORC2相關(guān)信號通路活化明顯高于敏感細(xì)胞，且基礎(chǔ)狀態(tài)下mTORC2激酶活性在耐藥細(xì)胞中也明顯高于敏感細(xì)胞。而mTORC1激酶活性在敏感細(xì)胞中則較耐藥細(xì)胞高，顯示不管是敏感細(xì)胞還是耐藥細(xì)胞，其mTOR相關(guān)信號通路均處于高活化狀態(tài)，敏感細(xì)胞偏向于mTORC1相關(guān)信號通路活化，而耐藥細(xì)胞則偏重于mTORC2相關(guān)通路異常活化，顯示mTORC2和mTORC1之間存在動態(tài)平衡。這一研究或許能解釋本研究、李建琦研究與王軍研究結(jié)果不一致的部分，但泮托拉唑鈉對mTOR具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。為進(jìn)一步證實泮托拉唑鈉的分子機(jī)制，我們分別使用c-met、PI3K和mTOR特異性抑制劑(可特異性抑制蛋白磷酸化)處理肺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SU11274、LY294002和rapamycin可以抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移，增加其對順鉑敏感性，同時可上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)vimentin表達(dá)，這與泮托拉唑鈉的作用是類似的，從而證實泮托拉唑鈉可通過c-Met/AKT/mTOR途徑抑制肺癌細(xì)胞侵襲、遷移，逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及耐藥。我們也注意到，隨著泮托拉唑鈉劑量增加，耐藥株的細(xì)胞形態(tài)并沒有由長梭形變?yōu)槁褕A形，而是變得更長、體型變細(xì)，絲狀偽足增多，反而趨于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)，這與絕大多數(shù)文獻(xiàn)報道不一致。這可能是泮托拉唑鈉調(diào)控了某些信號通路使細(xì)胞骨架發(fā)生特異性排布導(dǎo)致的，這種現(xiàn)象及生物學(xué)意義有待將來進(jìn)一步深入研究。綜上所述，泮托拉唑鈉抑制肺癌細(xì)胞侵襲、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥可能是通過c-Met/AKT/mTOR途徑實現(xiàn)的，這將為臨床治療肺癌、克服耐藥提供新的思路。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Pantoprazole sodium inhibits epithelial-mesenchymal transition and cisplatin resistance in lung cancer cells and underlying mechanism

SONG Jia, WANG Jian, LI Yu, HU Hui-zhen, YAN Jie, WU Li-jun, XU Wei, CHEN Qing-yong

(The117thHospitalofPLA,Hangzhou310013,China.E-mail:CQYong117@163.com)

AIM: To explore the inhibitory effects of pantoprazole sodium on epithelial-mesenchymal transition and cisplatin resistance in lung cancer cells and the underlying mechanism. METHODS: Using MTT method, wound healing assay, Transwell experiment, Western blot, the differences of morphology, invasion ability, migration ability, drug sensitivity and protein expression between A549/DDP cells and A549 cells were determined. The effect of pantoprazole sodium on morphology, invasion ability, migration ability, drug sensitivity and protein expression in A549/DDP cells were also observed. RESULTS: Compared with A549 cells, A549/DDP cells had higher invasion and migration abilities, and lower drug sensitivity, exhibited mesenchymal phenotype and activated c-Met/AKT/mTOR pathway. Pantoprazole sodium inhibited the abilities of invasion and migration, and reversed the mesenchymal phenotype, drug resistance and the c-Met/AKT/mTOR pathway activation in A549/DDP cells. Treatment with c-Met inhibitor SU11274, PI3K inhibitor LY294002 and mTOR inhibitor rapamycin had the same effects on A549/DDP cells as that of pantoprazole sodium. CONCLUSION: Pantoprazole sodium inhibits invasion, migration, epithelial-mesenchymal transition and cisplatin resistance in lung cancer cells by down-regulating c-Met/AKT/mTOR pathways.

Pantoprazole sodium; Lung cancer; Epithelial-mesenchymal transition; Drug resistance

2016- 04- 25

2016- 05- 24

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新項目(No.14ZD44； No.15MS158)；浙江省科技廳公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃(No.2013C33209； No.2014C33277)；杭州市科技發(fā)展計劃項目(No.20130633B29； No.20140633B40)

△通訊作者 Tel： 0571-28084876； E-mail： CQYong117@163.com

▲并列第1作者

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.010