血漿同型半胱氨酸及5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與老年原發(fā)性高血壓合并冠心病的關(guān)系

趙艷梅，王東旭，許為炎，藺晶晶，黃翠娟，王正東，梁萍

血漿同型半胱氨酸及5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與老年原發(fā)性高血壓合并冠心病的關(guān)系

趙艷梅1，王東旭1，許為炎1，藺晶晶2，黃翠娟1，王正東1，梁萍3

目的 探討血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平及其代謝酶5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因多態(tài)性與老年原發(fā)性高血壓合并冠心病的關(guān)系。方法 選擇2014年2月～2015年2月于玉林市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科住院的老年原發(fā)性高血壓患者共200例，其中男性115例，女性85例，平均年齡（67.52±3.53）歲。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果分為高血壓組（100例）及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┙M（100例）。選取同時(shí)期的健康體檢者100例為對(duì)照組。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）的方法檢測(cè)3組MTHFR C677T 基因型，同時(shí)檢測(cè)Hcy水平。結(jié)果 與對(duì)照組比較，高血壓組和冠心病組血壓、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、Hcy均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。高血壓組MTHFR C677位點(diǎn)CC、CT和TT基因型頻率分別為27.0%、50.0%和23.0%，C和T等位基因頻率分別為52.0%和48.0%。冠心病組CC、CT和TT基因型頻率分別為12.0%、55.0%和33.0%，C和T等位基因頻率分別為39.5%和60.5%。對(duì)照組CC、CT和TT基因型頻率分別為40.0%、45.0%和15.0%，C和T等位基因頻率分別為62.5%和37.5%。冠心病組TT型基因頻率及T等位基因頻率均高于高血壓組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。冠心病組患者TT型Hcy水平高于CC型和CT型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論 MTHFR C677T基因多態(tài)性中TT基因型可能是老年原發(fā)性高血壓合并冠心病的一個(gè)重要遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子，T等位基因可能為該病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因。

同型半胱氨酸；5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態(tài)性；老年原發(fā)性高血壓；冠心病

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟?，CHD）是中國(guó)人群常見(jiàn)心血管疾病，其重要的危險(xiǎn)因素有高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙等，發(fā)病率逐年上升。有研究表明[1]，同型半胱氨酸（Hcy）水平升高可引起動(dòng)脈粥樣硬化，可能參與高血壓及冠心病的發(fā)病。也有研究表明[2]，高Hcy血癥是心腦血管疾病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是Hcy代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶，受種族、地域等因素影響，該基因677堿基C/T突變影響其活性，進(jìn)而影響Hcy代謝，而其多態(tài)性與高血壓、冠心病的關(guān)系在國(guó)內(nèi)外研究中亦不一致。本研究主要討論了Hcy水平、MTHFR基因 C677T多態(tài)性與廣西玉林地區(qū)漢族老年原發(fā)性高血壓合并冠心病的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象和分組 選擇2014年2月～2015年2月

于玉林市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科住院的老年原發(fā)性高血壓患者共200例，其中男性115例，女性85例，平均年齡（67.52±3.53）歲。高血壓診斷參照中國(guó)高血壓防治指南（2005年修訂）制定的標(biāo)準(zhǔn)[3]，收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和/或舒張壓≥90 mmHg。冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)在左主干、左前降支、回旋支或右冠狀動(dòng)脈中至少有1支血管狹窄程度＞50%。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性高血壓、糖尿病、心力衰竭、自身免疫性疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、非漢族及其他惡性疾病患者。所有研究對(duì)象均來(lái)自廣西玉林地區(qū)無(wú)血緣關(guān)系的漢族老年人群。所有入選者自愿參加，并簽訂知情同意書。本研究經(jīng)玉林市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果分為高血壓組（100例）及冠心病組（100例）。高血壓組中男性63例，女性37例，年齡范圍60～75歲，平均年齡（67.49±3.54）歲；冠心病組中男性52例，女性48例，年齡范圍60～75歲，平均年齡（67.56±3.25）歲。選取同時(shí)期的健康體檢者100例為對(duì)照組，男性45例，女性55例，年齡范圍60～75歲，平均年齡（67.52 ±3.62）歲。

1.2標(biāo)本收集 患者抽取空腹9～12 h肘靜脈血10 ml。一管EDTA抗凝，混勻-80℃保存，用于提取基因組DNA，另一管肝素抗凝，用于生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.3Hcy水平及各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè) 采用羅氏

Cobas-8000生化分析儀通過(guò)循環(huán)酶法來(lái)測(cè)定Hcy含量，其他生化指標(biāo)三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。Hcy正常值設(shè)定為＜10μmol/L。

1.4MTHFR C677T 基因分型檢測(cè)

1.4.1DNA提取 使用亞甲基四氫葉酸還原酶基因677C/T檢測(cè)試劑盒（PCR-RFLP）提取 DNA，操作按說(shuō)明書進(jìn)行，提取后的DNA保存于-20℃冰箱。試劑盒購(gòu)自深圳奧薩制藥有限公司。

1.4.2PCR擴(kuò)增及檢測(cè) 引物設(shè)計(jì)使用 Primer 3 Input網(wǎng)絡(luò)軟件，由上海生工生物合成，上游引物：5′-ATGACCTGCTGCCGTCAGCG-3′，下游引物：5 ′-CCGCAACTATGGCATCGAGC-3′。反應(yīng)體系為25 μl，包括模板DNA 3 μl，PCR擴(kuò)增混合液21.8 μl和Taq DNA聚合酶0.2 μl。應(yīng)用PCR基因擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，65℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)。循環(huán)完畢，72℃再延伸7 min。酶切及電泳：對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物理想的樣品進(jìn)行酶切分析。反應(yīng)體系為15 μl，包括PCR產(chǎn)物10 μl，HinfⅠ內(nèi)切酶（深圳奧薩制藥有限公司提供）0.3 μl，酶切緩沖液4.7 μl。37℃溫育1 h，酶切反應(yīng)終止后其產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，室溫恒壓1～5 V/cm電泳10 min，最后在凝膠成像儀下觀察并照相，進(jìn)行基因分型。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間均數(shù)的比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三組一般臨床資料比較 與對(duì)照組比較，高血壓組和冠心病組血壓、TG、TC、LDL-C、Hcy均升高，同時(shí)，冠心病組較高血壓組上述指標(biāo)也明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表1）。

2.2MTHFR C677T 基因型鑒定 PCR擴(kuò)增后再經(jīng)Hinf Ⅰ內(nèi)切酶酶切，37℃溫育后再經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，成像儀下得到三種基因型：CC型為一個(gè)274 bp的片段，凝膠成像儀下見(jiàn)一個(gè)274 bp條帶；CT型，成像儀下可見(jiàn)274 bp和228 bp兩個(gè)條帶；TT型，成像儀下可見(jiàn)228 bp條帶（圖1）。

2.3三組MTHFR基因型和等位基因頻率比較 三組MTHFR C677T均表達(dá)CC、CT和TT基因型，且其頻率的分布均符合Hardy-Weinberg平衡，說(shuō)明樣本具有群體代表性。高血壓組CC、CT和TT基因型頻率分別為27.0%、50.0%和23.0%，C和T等位基因頻率分別為52.0%和48.0%。冠心病組CC、CT和TT基因型頻率分別為12.0%、55.0%和33.0%，C和T等位基因頻率分別為39.5%和60.5%。對(duì)照組CC、CT和TT基因型頻率分別為40.0%、45.0%和15.0%，C和T等位基因頻率分別為62.5%和37.5%。冠心病組TT型基因頻率及T等位基因頻率均高于高血壓組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表2）。

2.4冠心病組各基因型Hcy水平的比較 不同MTHFR基因型血漿Hcy 水平：TT型（23.29± 5.46） μmol/L、CT型（22.67±6.17） μmol/L、CC型（20.17±5.6）μmol/L。

TT型Hcy水平高于CC型和CT型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

表1　三組一般資料比較

圖1　基因多態(tài)性電泳圖

3　討論

高血壓是冠心病、腦卒中發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，而高Hcy血癥是引起動(dòng)脈粥樣硬化及相關(guān)并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素[2]，伴有Hcy升高的高血壓患者其血管疾病風(fēng)險(xiǎn)比正常人高10.3倍[4]。Hcy是一種含硫氨基酸，是蛋氨酸的中間代謝產(chǎn)物，在人體內(nèi)不能合成，有關(guān)Hcy升高引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制可能有：①Hcy通過(guò)氧化產(chǎn)生自由基引起血管內(nèi)皮損傷，抑制NO、前列環(huán)素的合成并促進(jìn)其降解，引起高血壓[5]；②通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中Fas分子，使血管內(nèi)皮素-1增多，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂[6]；③通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加Caspase-3的活性，誘導(dǎo)祖細(xì)胞凋亡致動(dòng)脈硬化、血管平滑肌增生[7]，同時(shí)可促進(jìn)膠原纖維合成及平滑肌細(xì)胞增殖。MTHFR是Hcy再甲基化代謝途徑中的關(guān)鍵酶。人類MTHFR基因位于染色體1p36.3，全長(zhǎng)17kb，具有多態(tài)性。當(dāng)MTHFR發(fā)生錯(cuò)位突變（677C→T）置換，使MTHFR活性降低，引起Hcy代謝受阻進(jìn)而引起Hcy升高[8]。所以，很多研究者致力于MTHFR基因多態(tài)性與高血壓合并冠心病關(guān)系的研究。

關(guān)于MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性與高血壓、冠心病的關(guān)系國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果報(bào)道不一。Lwin H等[9]在研究日本男性MTHFR基因C677T多態(tài)性與高血壓的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T多態(tài)性與高血壓無(wú)關(guān)。Muniz等[10]研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T多態(tài)性與冠心病無(wú)關(guān)。然而，Golledge J等[11]對(duì)土耳其人研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T多態(tài)性是高血壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Morita H等[12]研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)。Gupta SK等[13]在研究印第安人時(shí)發(fā)現(xiàn)高Hcy是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，MTHFR不同基因型Hcy水平有差異，冠心病組患者TT型Hcy水平高于CC型和CT型，這與尹春琳等[14]的研究結(jié)果相似。三組中MTHFR基因以CT型最多，冠心病組較對(duì)照組和高血壓組TT基因型頻率及T等位基因頻率增加，提示MTHFR基因C677T多態(tài)性與高血壓患者冠心病的發(fā)病有一定的關(guān)系，攜帶T等位基因的廣西玉林地區(qū)漢族老年人群發(fā)生高血壓合并冠心病的風(fēng)險(xiǎn)較高，T等位基因可能為該地區(qū)發(fā)生高血壓合并冠心病的易感基因。

IIhan N等[15]對(duì)土耳其人MTHFR C677T基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓、冠心病的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，高Hcy水平與冠心病有關(guān)，在冠心病患者中，TT基因型比CC和CT基因型患者的Hcy水平高。由此可推斷，在高血壓條件下，攜帶TT基因型的高血壓患者可促使Hcy水平增高，加劇了高血壓患者發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn)，因此，MTHFR 基因多態(tài)性可能參與高血壓患者冠心病的發(fā)病過(guò)程。

總之，老年高血壓患者合并冠心病比較復(fù)雜，可能與基因型、環(huán)境因素、種族等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Hcy升高及其代謝酶（MTHFR）C677T基因多態(tài)性可能與廣西玉林地區(qū)漢族老年高血壓患者發(fā)生冠心病有關(guān)，TT基因型可能為該人群易感基因型。當(dāng)然，由于本研究樣本例數(shù)偏少，結(jié)果難免存在一定偏差，有待更大規(guī)模的研究揭示該基因與高血壓合并冠心病的關(guān)系。

表2　三組 C677T基因型和等位基因頻率比較（n，%）

[1] Trabetti E. Homocysteine MTHFR gene polymorphisms and cardiocerebrovascular risk[J]. J Appl Genet,2008,49(3)：267-82.

[2] Petramala L,Acca M,Francucci CM,et al. Hyper-homeysteinemia：a biochemical link between bone and cardiovascular system diseases?[J]. J Endocrinol Invest,2009,32(4 Suppl)：10-4.

[3] 中國(guó)高血壓防治指南修訂委員會(huì). 中國(guó)高血壓防治指南（2005修訂版）[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社,2005.

[4] El-Khairy L,Ueland PM,Refsum H,et al. Plasma total cysteine as a risk factor for vascular disease：The European Concerted Action Project[J]. Circulation,2001,103(21)：2544-9.

[5] 林小慧,開(kāi)祥,愛(ài)源,等. 高血壓患者血漿同型半胱氨酸水平及亞甲基四氫葉酸還原酶因多態(tài)性的研究[J]. 實(shí)用心腦肺血管病雜志,2012,20(5)：777-9.

[6] Stuhlinger MC,Oka RK,Graf EE,et al. Endothelial dysfunction induced by hyper-homocyst(e)inemia：role of asymmetric dimethylarginine[J]. Circulation,2003,108(8)：933-8.

[7] Li L,Hu BC,Gong SJ,et al. Homocysteine-induced caspase-3 activation by endoplasmic reticulum stress in endothelial progenitor cells from patients with coronary heart disease and healthy donors[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2011,75(7)：1300-5.

[8] Almawi WY,Ameen G,Tamim H,et al. Factor VG1691A, prothrombin G20210A, and methylenetetrahydrofolate reductase [MTHFR]C677T gene polymerphism in angiographically documented coronary artery disease[J]. J Thromb Thrombolysis,2004,17(3)：199-205.

[9] Lwin H,Yokoyama T,Yoshiike N,et al. Polymorphism of methylenetetra hydrofolate reductase gene(C677T MTHFR)is not a confounding factor of the relationship between serum uric acid level and the prevalence of hypertension in Japanese men[J]. Circ J,2006,70(1)：83-7.

[10] Muniz MT,Siqueira ER,Fonseca RA,et al. Evaluation of MTHFR C677T gene polymorphism and homocysteine level in coronary atherosclerotie disease[J]. Arq Bras Endocrinol Metabol,2006,50(6)：1059-65.

[11] Golledge J,Norman PE. Relationship between two sequence variations in the gene for peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and plasma homocysteine concentration.Health in men study[J]. Hum Genet,2008,123(1)：35-40.

[12] Morita H,Taguchi J,Kurihara H,et al. Genetic polymorphism of 5,10-methyletetrahydrofolate ruductase(MTHFR)as a risk factor for coronary artery disease[J]. Circulation,1997,95(8)：2023-6.

[13] Gupta SK,Kotwal J,Kotwal A,et al. Role of homocysteine& MTHFR C677T gene polymor-Phism as risk factors for coronary artery disease in young Indians[J]. Indian J Med Res,2012,135(4)：506-12.

[14] 尹春琳,徐東,魏嘉平,等. 急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者同型半胱氨酸與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性及其與冠心病其它危險(xiǎn)因素的相關(guān)分析[J]. 中國(guó)循環(huán)雜志,2013,28(04)：254-7.

[15] IIhan N,Kucuksu M,Kaman D,et al. The 677 C/T MTHFR polymorphism is associated with essential hypertension,coronary artcry disease,and higher homocysteine levels[J]. Arch Med Res,2008,39(1)：125-30.

本文編輯：姚雪莉

Relationship between homocysteine or gene polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase and essential hypertension complicating coronary heart disease in elderly patients

ZHAO Yan-mei*, WANG Dong-xu, XU Wei-yan, LIN Jing-jing, HUANG Cui-juan, WANG Zheng-dong, LIANG Ping.
*Department of Cardiology, First People's Hospital of Yulin City, Yulin 537000, China.

WANG Dong-xu, E-mail: zhaoyanmeigood@126.com

Objective To discuss the relationship between homocysteine (Hcy) or gene polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and essential hypertension complicating coronary heart disease (CHD) in elderly patients. Methods The patients with essential hypertension (n=200, male 115, female 85 and average age=67.52±3.53) were chosen from the Department of Cardiology of First People’s Hospital of Yulin City from Feb. 2014 to Feb. 2015. The patients were divided, according to outcomes of coronary angiography (CAG), into hypertension group and CHD group (each n=100). At the same time, healthy controls (n=100) were chosen as control group. The genotypes of MTHFR C677T were detected by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method and Hcy level was detected meanwhile in 3 groups. Results Compared with control group, blood pressure, triglyceride (TG), total cholesterol (TC), low-density lipoproteincholesterol (LDL-C) and Hcy increased in hypertension group and CHD group (all P<0.05). In hypertension group, the frequency was 27.0% in CC genotype, 50.0% in CT genotype and 23.0% in TT genotype, and frequency was 52.0% in C allele and 48.0% in T allele at MTHFR C677 locus. In CHD group, the frequency was 12.0% in CC genotype, 55.0% in CT genotype and 33.0% in TT genotype, and frequency was 39.5% in C allele and 60.5% in T allele. In control group, the frequency was 40.0% in CC genotype, 45.0% in CT genotype and 15.0% in TT genotype, and frequency was 62.5% in C allele and 37.5% in T allele. The frequency of TT genotype and frequency of T allele were higher in CHD group than those in hypertension group and control group (all P<0.05). Hcy level was higher in TT genotype than that in CC genotype and CT genotype in CHD group (all P<0.05). Conclusion TT genotype of MTHFR C677T maybe an important genetic risk factor, and T allele maybe a risk allele for CHD in elderly patients with essential hypertension.

Homocysteine; Methylenetetrahydrofolate reductase; Gene polymorphisms; Senile essential hypertension; Coronary heart disease

R544.1

A

1674-4055(2016)10-1191-04

玉林市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(1421036)民醫(yī)院體檢中心

1537000 玉林,玉林市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科;2102209

王東旭,E-mail：zhaoyanmeigood@126.com北京,北京王府中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院急診科;3537000 玉林,玉林市第一人

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.10.11