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    塞來昔布通過Wnt/β-catenin信號通路對人結腸癌細胞SW480的影響

    2016-11-22 02:47:04楊春勇金若天梁慶模
    中國醫(yī)藥導報 2016年21期
    關鍵詞:塞來磷酸化結腸癌

    楊春勇 金若天 梁慶模

    1.赤峰學院附屬醫(yī)院普外二科,內蒙古赤峰024000;2.南華大學附屬南華醫(yī)院普外科,湖南衡陽420002

    塞來昔布通過Wnt/β-catenin信號通路對人結腸癌細胞SW480的影響

    楊春勇1金若天1梁慶模2

    1.赤峰學院附屬醫(yī)院普外二科,內蒙古赤峰024000;2.南華大學附屬南華醫(yī)院普外科,湖南衡陽420002

    目的觀察非甾體類抗炎藥塞來昔布對體外培養(yǎng)的人結腸癌SW480細胞增殖和凋亡的影響,并研究其與Wnt/β-catenin信號通路的關系,探討塞來昔布抑制結腸腫瘤生長的分子機制。方法應用MTT法測定不同濃度塞來昔布(0、20、40、60、80、100 μmo1/L)對SW480細胞增殖的影響;應用流式細胞術分析不同濃度塞來昔布(0、20、40、80 μmo1/L)處理48 h后對SW480細胞凋亡的影響;應用Western b1ot法分析不同濃度塞來昔布(0、20、40、80 μmo1/L)處理48 h后SW480細胞中β-catenin蛋白和磷酸化的β-catenin蛋白的表達水平。結果MTT結果顯示,塞來昔布對結腸癌細胞的增殖抑制有濃度依賴性和時間依賴性(P<0.05);流式細胞術分析顯示,隨著塞來昔布濃度的增加,結腸癌細胞的凋亡率明顯增加(P<0.05);Western b1ot法檢測結果顯示,隨著塞來昔布濃度的增加,β-catenin蛋白表達顯著下降(P<0.05),而磷酸化的β-catenin蛋白表達顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性。結論塞來昔布可以抑制結腸癌SW480細胞的Wnt/β-catenin信號通路,這可能是其抑制結腸癌細胞增殖、促進凋亡的重要機制。

    塞來昔布;結腸癌;Wnt信號通路;β-catenin

    隨著人們飲食習慣的改變和生活環(huán)境的惡化,結腸癌的發(fā)病逐年增加,2014年全球估計新發(fā)病例數近137萬例,居惡性腫瘤發(fā)病率的第3位[1]。大腸癌的發(fā)病機制復雜,其治療包括手術、化療、放療及基因治療在內的多種治療方法。近年來非甾體類抗炎藥(NSAIDs)的抗腫瘤作用日益受到人們的關注,其可以通過多種途徑對腫瘤生長產生抑制作用[2-4]。而Wnt信號傳導通路在結腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著決定性的作用[5-8],但NSAIDs塞來昔布對Wnt信號通路的作用機制尚不明確。本研究以人結腸癌SW480細胞為研究對象,觀察塞來昔布對結腸癌SW480細胞增殖、凋亡及Wnt/β-catenin信號通路的影響,探討該作用與Wnt/β-catenin信號通路之間的關系,為其用于結腸的治療提供理論依據。

    1 材料與方法

    1.1 主要藥品、試劑

    人結腸癌細胞株SW480購自中南大學腫瘤研究所;塞來昔布(輝瑞制藥公司,生產批號:M72189);新生牛血清(杭州四季清公司);RPMI1640(Gibco公司,USA);胰蛋白酶(Amresco公司,USA);BCA Protein Assay Reagent(PIERCE公司,USA);兔抗人β-catenin多抗和磷酸化β-catenin多抗(Biowor1de Tecno1ogy Inc公司,USA);DMSO和MTT(Sigma公司,USA);PVDF膜(Mi11ipore公司,USA);考馬斯亮藍、Western b1ot Lumino1 Reagent發(fā)光試劑和蛋白質分子量標準,Western b1ot凝膠試劑盒。

    1.2 細胞培養(yǎng)

    人結腸癌SW480細胞培養(yǎng)于體積分數為10%的新生牛血清和100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于環(huán)境為37℃、體積分數為5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數生長期的SW480細胞用于實驗。

    1.3 MTT比色法用于細胞生長抑制實驗

    取對數生長期的SW480細胞,將細胞以2×108/L的密度接種于100 mL培養(yǎng)瓶中,每瓶1 mL,再加完全培養(yǎng)基4 mL,培養(yǎng)24 h,同步化后,每瓶分別加入塞來昔布培養(yǎng)液,終濃度分別為0、20、40、60、80、100 μmo1/L,對照組為0 μmo1/L。每濃度設4個復孔,分別在加藥后24、48、72 h后,避光下加入5 mg/mL MTT 20 μL,置培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜(DMSO),10 min后酶標儀測490 nm處吸光度(A)值,計算細胞生長抑制率(IR)。IR的計算公式為:IR(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。實驗重復3次。

    1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

    設對照組(塞來昔布為0 μmo1/L)和實驗組(塞來昔布為20、40、80 μmo1/L)共4個組別,取對數生長期的SW480細胞用于實驗。孵箱內細胞培育48 h后終止培養(yǎng),胰酶消化后分別制成單細胞懸液。調整待測細胞密度為5×105個/mL后上機檢測。實驗重復3次。

    1.5 Western blot檢測細胞內β-catenin蛋白和磷酸化β-catenin蛋白

    設對照組(塞來昔布為0 μmo1/L)和實驗組(塞來昔布為20、40、80 μmo1/L)共4個組別。裂解各組細胞,并提取細胞內的蛋白,BCA測蛋白濃度并定量。制備SDSPAGE凝膠,每孔上樣40 μg蛋白;取28 mA恒流進行電泳,電泳約30 min后待樣品溴酚藍行至分離膠、積層膠界面,再以120 V恒壓、約1.5 h行分離膠電泳;將凝膠中蛋白電轉移至PVDF膜上(預先用甲醇處理),溫度為4℃,恒流105 mA,3 h;5%脫脂奶粉封閉室溫下2 h;4℃孵育一抗,TBST液洗膜3次,每次約5 min;室溫下二抗(1∶5000)孵育1 h,TBST液洗膜3次,每次約5 min;于暗室中加入Western b1ot發(fā)光試劑約1 min,X片曝光、顯影、定影,膠片掃描后采用A1pha ImagerTM2200軟件測定印跡區(qū)帶的灰度面積值。實驗重復3遍。

    1.6 統計學方法

    采用SPSS 13.0統計分析軟件進行統計分析,計量資料數據用均數±標準差()表示,組間比較采用單因素方差分析,組內兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

    2 結果

    2.1 不同濃度塞來昔布對SW480細胞增殖的影響

    MTT法顯示,不同濃度塞來昔布處理SW480細胞24、48、72 h后,抑制率隨藥物濃度增加而增高(P<0.05),隨作用時間的延長而增高(P<0.05),見表1、圖1。表明塞來昔布能抑制SW480細胞的增殖,且呈時間依賴性和劑量依賴性。

    表1 塞來昔布對SW480細胞增殖的影響(%,)

    表1 塞來昔布對SW480細胞增殖的影響(%,)

    塞來昔布(μmo1/L)抑制率24 h48 h72 h F值P值0 0 0 0 20 40 60 80 100 F值P值2.37±0.35 6.95±0.24 10.93±0.94 15.40±0.86 22.90±1.31 573.66 0.000 5.95±0.37 10.93±0.56 15.40±0.18 23.25±0.59 27.28±0.71 1904.89 0.000 7.32±0.39 13.13±0.45 22.27±0.98 26.20±0.26 35.83±0.78 2089.11 0.000 191.87 204.42 279.16 323.28 234.18 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

    圖1 不同濃度和不同時間段塞來昔布對SW480細胞增殖的影響

    2.2不同濃度塞來昔布對SW480細胞凋亡的影響

    流式細胞儀分析結果顯示,不同濃度的塞來昔布處理SW480細胞48 h后細胞出現了明顯的凋亡,且不同濃度塞來昔布處理組之間的凋亡率差異有統計學意義(F=7839.49,P=0.000),見圖2~3。表明隨著塞來昔布濃度的增加SW480細胞凋亡率增加。

    圖2 不同濃度塞來昔布對SW480細胞凋亡的影響

    圖3 不同濃度塞來昔布對SW480細胞凋亡率的比較

    2.3 不同濃度塞來昔布對SW480細胞中β-catenin蛋白和磷酸化的β-catenin蛋白表達的影響

    Western b1ot法檢測表明,不同濃度塞來昔布處理SW480細胞48 h后,β-catenin蛋白的表達隨塞來昔布濃度的增加逐漸減少,且不同濃度塞來昔布處理組之間的差異有統計學意義(F=206.48,P=0.000),而磷酸化的β-catenin蛋白的表達隨塞來昔布濃度的增加逐漸增加,且不同濃度塞來昔布處理組之間的差異有統計學意義(F=199.96,P=0.000),見圖4~5。表明塞來昔布可以促進結腸癌細胞β-catenin蛋白的磷酸化而降解,從而減少β-catenin蛋白的表達。

    圖4 不同濃度塞來昔布對SW480細胞中β-catenin蛋白和磷酸化的β-catenin蛋白表達的影響

    圖5 不同濃度塞來昔布組間β-Catenin和磷酸化β-Catenin蛋白相對表達量的比較

    3 討論

    結腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一,占胃腸道腫瘤的第3位[9],近年來,結腸癌的發(fā)病率與病死率在我國呈上升的趨勢,高發(fā)年齡普遍在50~60歲[10]。其治療主要是以手術為主的綜合治療,包括術后化療、放療、靶向治療及中醫(yī)治療[11]。而臨床上常用的化療藥物多為細胞毒性藥物,其副作用較大,尤其對晚期腫瘤患者,耐受性較差,往往不能應用其化療,因此,選擇高效低毒的非細胞毒性的藥物成為腫瘤治療的熱點。

    最近研究表明環(huán)氧化酶2(COX-2)在胃癌、結直腸癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌和頭頸部腫瘤等中普遍存在過度表達現象,其表達量為基礎表達量的20~80倍[12]。近年來NSAIDs的抗腫瘤作用日益受到人們的關注,NSAIDs能夠通過多種途徑抑制腫瘤細胞;而高選擇性COX-2抑制劑,如美羅西康、羅非昔布、塞來昔布等成為了研究的焦點,1999年美國FDA批準塞來昔布作為預防大腸腺瘤的藥物[13-14]。本課題選擇塞來昔布作為研究藥物,實驗表明隨著塞來昔布濃度的增加,其能夠抑制結腸癌SW480細胞的增殖,促進凋亡。

    Wnt/β-catenin信號傳導通路的異常激活與人類許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[5-8],其與結腸癌的發(fā)生發(fā)展也密切相關,而塞來昔布對結腸癌Wnt/βcatenin信號傳導通路的影響尚未有研究。

    Wnt/β-catenin信號傳導通路的異常激活的發(fā)生機制如下:①在沒有Wnt信號刺激時,胞漿內β-catenin蛋白與Axin、APC、GSK3和CK1形成“降解復合體”,并被磷酸化,形成磷酸化的β-catenin蛋白,進而被泛素聯接酶β-TrCP識別并被降解,從而不能激活其靶基因[15-20]。②在有Wnt信號刺激時,Wnt配體與其受體LRP5/6和Frizz1ed結合,使得Dv1與Axin結合,從而阻礙“降解復合體”形成,進而β-catenin蛋白在胞漿內累積并進入細胞核,與TCF/LEF結合激活其下游的靶基因,如c-myc和Cyc1in D等[21-23]。本研究表明,隨著塞來昔布濃度的增加,塞來昔布能夠增加磷酸化β-catenin蛋白的表達(P<0.05),而減少β-catenin蛋白的表達(P<0.05),提示塞來昔布能夠通過促進β-catenin蛋白的磷酸化,減少胞漿內β-catenin蛋白的表達,進而抑制Wnt/β-catenin信號傳導通路。

    綜上所述,塞來昔布可抑制結腸癌SW480細胞的Wnt/β-catenin信號通路,這可能是其抑制結腸癌細胞的增殖、促進其凋亡的重要機制,這可為臨床上塞來昔布治療結腸癌提供理論基礎。

    [1]Siege1 R,Desantis C,Jema1 A.Co1orecta1 cancer statistics[J]. CA Cancer J C1in,2014,64(2):104-117.

    [2]可飛,鄭杰.Hedgehog信號通路對塞來昔布介導抗結腸癌效應的影響[J].江蘇醫(yī)藥,2014,40(3):268-271.

    [3]李琛,于良.塞來昔布通過ERK1/2信號通路對肝癌細胞株SMMC-7721增殖、凋亡的影響[J].陜西醫(yī)學雜志,2013,42(6):649-651.

    [4]張鳳香,孫大鵬,范瑩,等.塞來昔布促進結直腸癌細胞凋亡的機制研究[J].軍醫(yī)進修學院學報,2012,33(7):759-762.

    [5]Kikuchi A.Wnt signa1ing:its abnorma1ities and diseases[J]. Seikagaku,2009,81(9):780-792.

    [6]E1 Waki1 A,La11i E.The Wnt/beta-catenin pathway in adrenocortica1 deve1opment and cancer[J].Mo1 Ce11 Endocrino1,2011,332(1-2):32-37.

    [7]馮進武,吳發(fā)明,劉朝奇.結腸癌中TLRs、Wnt/β-catenin的表達與腫瘤的相關性研究[J].海南醫(yī)學,2016,27(2):254-256.

    [8]Chen Y,Gruid1 M,Remi1y-Wood E,et a1.Quantification of beta-catenin signa1ing components in co1oncancer ce11 1ines,tissue sections,and microdissected tumor ce11s using reaction monitoring mass spectrometry[J].J Proteome Res,2010,9(8):4215-4227.

    [9]孫敬國,蔣曉忠.Twist蛋白表達與結腸癌發(fā)生發(fā)展的關系研究[J].中國全科醫(yī)學,2011,4(14):1311-1314.

    [10]Simog1ou C,Gymnopou1ou I,Baba1is D,et a1.Surgery of co1on cancer in a district hospita1[J].He11enic Journa1 of Surgery,2012,84(1):71-75.

    [11]劉見榮,侯風剛.結腸癌治療概況[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2014,16(2):99-101.

    [12]Ghosh N,Chaki R,Manda1 V,et a1.COX-2 as a target for cancer chemotherapy[J].Pharmaco1 Rep,2010,62(2):233-244.

    [13]楊春勇,梁慶模.Wnt與MAPK信號通路在腫瘤發(fā)生中的串話[J].醫(yī)學分子生物學雜志,2010,7(5):441-447.

    [14]Macdona1d BT,Semenov MV,He X.Snap-Shot:Wnt/beta-catenin signa1ing[J].Ce11,2007,131(6):1204.

    [15]Krishnan V,Bryant HU,Macdouga1d OA.Regu1ation of bone mass by Wnt signa1ing[J].J C1in Invest,2006,116(5):1202-1209.

    [16]Seifert JR,M1odzik M.Frizz1ed/PCP signa11ing:a conserved mechanism regu1ating ce11 po1arity and directed moti1ity[J]. Nat Rev Genet,2007,8(2):126-138.

    [17]馬海芝,史振軍,楊振淮.蛇葡萄素對大腸癌細胞株SW480增殖、凋亡的影響[J].現代醫(yī)院,2015,15(8):12-14.

    [18]毛海波,朱國棟,劉國龍,等.結腸癌細胞株SW480中CD133+的分選及Bmi-1基因的表達[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2015,12(17):15-18.

    [19]馬宇霆,王丹,王瑞平,等.健脾化瘀方對缺氧微環(huán)境下結腸癌SW480細胞生物學行為的影響[J].成都醫(yī)學院學報,2015,10(3):265-268.

    [20]劉樺,楊曉龍,唐麗,等.NGAL重組蛋白的表達與純化及其促進結腸癌轉移的研究[J].成都醫(yī)學院學報,2015,10(2):142-146,151.

    [21]劉聲,王笑民,楊國旺,等.扶正防癌方聯合化療對晚期結腸癌患者生活質量及免疫功能的影響[J].世界中醫(yī)藥,2015,10(2):209-211,215.

    [22]金芳玲,蔡忠芳,葛陽麗,等.miRNA-34a靶向抑制Rb/ E2F1通路激活增強結腸癌放療敏感性[J].中國醫(yī)藥導報,2015,12(32):13-16,29.

    [23]楊春勇.奧曲肽與塞來昔布聯合應用對人結腸癌SW480細胞及其Wnt/β-catenin信號通路的影響[D].衡陽:南華大學,2011.

    Effects of Celecoxib on the human colon cancer SW480 cells through Wnt/β-catenin Pathway

    YANG Chunyong1JIN Ruotian1LIANG Qingmo2
    1.The Second Department of Genera1 Surgery,Affi1iated Hospita1 of Chifeng Co11ege,Inner Mongo1ia Autonomous Region,Chifeng024000,China;2.Department of Genera1 Surgery,Affi1iated Nanhua Hospita1,University of South China,Hu'nan Province,Hengyang420002,China

    Objective To exp1ore the effects of nonsteroida1 anti-inf1ammatory drugs Ce1ecoxib on the pro1iferation and apoptosis of human co1on cancer SW480 ce11s cu1tured in vitro,and to research the corre1ation between the effects and Wnt/β-catenin pathway,to approach the mo1ecu1ar mechanisms of Ce1ecoxib in inhibiting co1on tumor.Methods MTT assay was used to test the effect of different concentrations of Ce1ecoxib(0,20,40,60,80,100 μmo1/L)on the pro1iferation of SW480 ce11s;the f1ow cytometry was used to ana1yze the effects of different concentrations of Ce1ecoxib(0,20,40,80 μmo1/L)after administration for 48 h on the apoptosis of SW480 ce11s;the Western b1ot was used to examine the expression of β-catenin protein and phosphory1ated β-catenin protein which were treated with different concentrations of Ce1ecoxib(0,20,40,80 μmo1/L)after administration for 48 h.Results MTT assay showed that Ce1ecoxib cou1d inhibit the pro1iferation of SW480 ce11s in a dose and time dependent manner(P<0.05);the f1ow cytometry ana1ysis showed that the ce11 apoptosis rate was significant1y increased with the increase of concentrations of Ce1ecoxib(P<0.05);the Western b1ot showed that the expression of β-catenin protein was significant1y down-regu1ated(P<0.05)and the expression of phosphory1ated β-catenin protein was significant1y up-regu1ated(P<0.05)with the increase of concentrations of Ce1ecoxib,in a dose dependent manner.Conclusion Ce1ecoxib can inhibit Wnt/β-catenin pathway of human co1on cancer SW480 ce11s,and this may be the important mechanism of Ce1ecoxib in inhibiting the pro1iferation of co1on cancer ce11s and promoting apoptosis.

    Ce1ecoxib;Co1on cancer;Wnt pathway;β-catenin

    R735.3

    A

    1673-7210(2016)07(c)-0054-04

    2016-03-06本文編輯:張瑜杰)

    梁慶模(1956-),男,碩士研究生,教授,碩士生導師;研究方向:結直腸癌的治療。

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