HPLC法測定黃丹蘭顆粒劑中苦參堿和氧化苦參堿含量

陳妍，邢正英，李繼彬，李晗，房志仲

（1.天津醫(yī)科大學藥學院藥劑學教研室，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070；2.天津海濱人民醫(yī)院藥劑科，天津300280）

論著

HPLC法測定黃丹蘭顆粒劑中苦參堿和氧化苦參堿含量

陳妍1，2，邢正英1，李繼彬1，李晗1，房志仲1

（1.天津醫(yī)科大學藥學院藥劑學教研室，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070；2.天津海濱人民醫(yī)院藥劑科，天津300280）

目的：建立高效液相色譜（H PLC）法測定黃丹蘭顆粒劑中苦參堿和氧化苦參堿含量的方法。方法：采用HPLC法以苦參堿、氧化苦參堿標準品為對照品，黃丹蘭顆粒劑為樣品，使用TIANHE?Kromasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為磷酸鹽緩沖液（pH=3.0）-甲醇（93∶7），流速為0.8 mL/min，柱溫為35℃，檢測波長為220 nm，進樣量為20 μL。結果：苦參堿回歸方程為Y=40 074.09X-14.73，其進樣濃度在2.5～25 μg/mL范圍內呈良好線性關系（r=0.999 9，n=3），平均加樣回收率為99.99%，RSD=0.057 7%（n=6）；氧化苦參堿回歸方程為Y=53 380.27X+46.35，其進樣濃度在2.0～20.0 μg/mL范圍內呈線性關系（r=0.999 9，n=3），平均加樣回收率為99.78%，RSD=0.443 2%（n=6）?？鄥A和氧化苦參堿平均含量分別為0.505 6 mg/g和0.306 7 mg/g，RSD分別為0.298 7%和0.154 2%。結論：HPLC方法分離效果好、專屬性強、簡便、靈敏和準確，可作為黃丹蘭顆粒劑中苦參堿和氧化苦參堿含量的測定方法。

黃丹蘭顆粒劑；苦參堿；氧化苦參堿；高效液相色譜法

黃丹蘭顆粒劑是由苦參、黃芪、丹參、三七總苷、螺旋藻、絞股蘭總皂甙和蝙蝠蛾孢菌絲體粉等組成，具有調節(jié)免疫功能，逆轉纖維化進程，溶解纖維斑塊的功效。苦參中主要活性成分為苦參堿和氧化苦參堿。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抑制免疫、抗纖維化、抗腫瘤等生物學作用［1-3］。在動物實驗中，對肝纖維化、肺纖維化及溶解纖維斑塊等具有很好的治療效果。中藥苦參是黃丹蘭顆粒劑處方中的主藥，為了有效控制產品的質量，參考相關文獻［4-9］采用HPLC法測定了該顆粒劑中苦參堿和氧化苦參堿的含量，建立該制劑的質量控制標準，為申報醫(yī)院制劑提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1儀器美國高效液相色譜儀（Spectra-physics），輸液泵（SP8810 precision isocratic，BIO-RAD），檢測器（Spectra 100 variable wavelength detector），Anastar色譜工作站，TIANHE?Kromasil C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），KQ-100B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），ALC-210.4電子分析天平（ACCULAB Sartorius group，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），pH計（雷磁pHs-25型，上海精密科學儀器有限公司）。

1.2藥品與試劑苦參堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為110805-200306，供含量測定用）和氧化苦參堿對照品（中國藥品生物質品檢定所，批號為110780-200506，供含量測定用）；黃丹蘭顆粒劑（本室自制3批，批號：141014、141018和141022）；甲醇（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；乙腈（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；其它試劑均為市售分析純；重蒸水（自制）。

1.3色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱：TIANHE?Kromasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為磷酸鹽緩沖液（磷酸調節(jié)pH=3.0）-甲醇（93∶7）；流速為0.8 mL/min；檢測波長為220 nm；柱溫為35℃；進樣量20 μL。

1.4樣品溶液的制備

1.4.1對照品溶液的制備精密稱取苦參堿對照品12.5 mg、氧化苦參堿對照品10 mg，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，密塞。精密量取上述溶液各10 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，密塞，制備成50 μg/mL的苦參堿對照品儲備液和40 μg/mL的氧化苦參堿對照品儲備液，備用。

1.4.2供試品溶液的制備取黃丹蘭顆粒劑至乳缽中研細，取粉末1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入濃氨水1 mL，CHCl350 mL，密塞，搖勻，精密稱定質量，放置4 h，隨時振搖，超聲提取20 min，再精密稱定質量，用CHCl3補足其減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，立即取下，殘渣加甲醇1 mL使其溶解，定量轉移至10 mL量瓶中，加磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4.3陰性樣品對照液的制備按處方比例，取除苦參外的其余藥味，按工藝要求制成不含苦參的陰性樣品，再按“1.4.2項下”中的方法制成陰性樣品對照液。

2　結果

2.1專屬性試驗精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品對照液各20 μL，按照“1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。苦參堿和氧化苦參堿對照品的保留時間分別為9.7和12.3 min左右，供試品色譜行為與苦參堿和氧化苦參堿對照品色譜峰相應的位置上有相應的色譜峰，陰性對照對測定結果無干擾，色譜見圖1。

圖1　黃丹蘭顆粒劑中苦參堿和氧化苦參堿色譜

2.2線性關系考察

2.2.1苦參堿精密量取苦參堿對照品儲備液，配制成2.5、5、10、15、20和25 μg/mL系列對照品溶液。精密量取上述標準溶液20 μL注入液相色譜儀測定，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對苦參堿濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程Y=40 074.09X－14.73（r=0.999 9，n=3），結果表明：苦參堿進樣量在2.5～25 μg/mL范圍內，呈良好線性關系。

2.2.2氧化苦參堿精密量取氧化苦參堿對照品儲備液，配制成2.0、4.0、8.0、10.0、15和20 μg/mL系列對照品溶液。精密量取上述標準溶液20 μL注入液相色譜儀測定，記錄色譜圖。以峰面積（Y）對苦參堿濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程Y= 53 380.27X＋46 035（r=0.999 9，n=3），結果表明：氧化苦參堿進樣量在2.0～20.0 μg/mL范圍內，呈線性關系。

2.3穩(wěn)定性試驗精密吸取供試品溶液20 μL，在0、2、4、6、8及12 h測定苦參堿和氧化苦參堿峰面積值，結果苦參堿的RSD為1.510 5%，氧化苦參堿RSD為0.991 3%（n=6），表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.4精密度試驗精密吸取供試品溶液20 μL，按上述色譜條件，連續(xù)測定6次，結果其中苦參堿RSD為1.050 7%，氧化苦參堿RSD為0.227 5%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.5重復性試驗按“1.4.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別取20 μL進樣測定，結果苦參堿和氧化苦參堿的含量分別為0.504 2，0.306 9 mg/g，RSD分別為0.217 8%，0.703 8%（n=6），表明本法的重復性良好。

2.6回收率試驗

2.6.1苦參堿精密稱取已知含量的樣品，精密加入不同量的苦參堿對照品，按供試品溶液的制備方法制得待測液，測定含量，平均回收率為99.99%，RSD為0.057 7%，見表1。

表1　苦參堿回收率試驗結果

2.6.2氧化苦參堿精密稱取已知含量的樣品，精密加入不同量的氧化苦參堿對照品，按供試品溶液的制備方法制得待測液，測定含量，平均回收率為99.78%，RSD為0.443 2%，見表2。

表2　氧化苦參堿回收率試驗結果

2.7樣品測定按上述色譜條件和含量測定方法，精密測定3批樣品，記錄峰面積，計算含量?？鄥A平均含量為0.505 6 mg/g，氧化苦參堿平均含量0.306 7 mg/g，見表3。

表3　樣品含量測定結果

3　討論

3.1流動相的選擇分別考察3種不同比例的流動相：（1）乙腈-0.1%KH2PO4溶液；（2）乙腈-水（含KH2PO4和庚烷磺酸鈉）；（3）磷酸鹽緩沖液（pH=3.0）-甲醇（93∶7）。結果表明：使用流動相為磷酸鹽緩沖液（pH=3.0）-甲醇（93∶7），流速為0.8 mL/min，柱溫為35℃時，色譜峰對稱，基線平穩(wěn)，分離效果最好。

3.2供試品提取純化條件的選擇根據(jù)苦參堿和氧化苦參堿的溶解性能，并參考有關文獻［4-9］的提取純化方法，最終選取如下方法：取黃丹蘭顆粒劑至乳缽中研細，置具塞錐形瓶中，加入濃氨水使樣品充分潤濕，加入CHCl3，密塞，搖勻，放置4 h，隨時振搖，超聲提取20 min，濾過。超聲的方法比回流法更為簡便。

3.3薄層層析試驗薄層色譜（TLC）分析在藥物制劑等快速檢測中具有獨特的優(yōu)勢，簡便易行，可以作為定量分析初始依據(jù)。在建立HPLC定量分析中，同時利用“1.4項下”的樣品溶液進行了TLC試驗，硅膠G加2%NaOH溶液的自制板，展開劑為氯仿∶甲醇∶濃氨溶液（5∶0.6∶0.3），上行展開8 cm，顯色劑為依次噴以稀碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉試液，日光下苦參堿和氧化苦參堿顯紅棕色斑點，陰性對照液無干擾［8-11］，結果顯示TLC分析可以作為該制劑的定性分析方法。

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（2016-02-02收稿）

R927.2

A

1006-8147（2016）05-0452-03

陳妍（1983-），女，主管藥師，碩士在讀，研究方向：臨床藥學；通信作者：房志仲，E-mail：fangzhizhong@tm u.edu.cn。