TLR 4在糖尿病腎病足細胞損傷中的作用△

林　苗　林　帆　洪富源　吳家斌（.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院腎內(nèi)科，福建省立醫(yī)院福州35000；.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院干部特診二科，福建省立醫(yī)院福州35000）

TLR 4在糖尿病腎病足細胞損傷中的作用△

林苗1林帆2洪富源1吳家斌1（1.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院腎內(nèi)科，福建省立醫(yī)院福州350001；2.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院干部特診二科，福建省立醫(yī)院福州350001）

目的：探討Toll樣小體4（TLR4）在糖尿病腎病足細胞損傷中的作用。方法：分別以TLR+/+和TLR4-/-小鼠為動物模型，檢測尿蛋白/肌酐比值和血肌酐水平，透射電鏡觀察腎小球足細胞的形態(tài)，采用熒光實時定量PCR法測定足細胞相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達。結(jié)果：與TLR4+/+非糖尿病組相比，TLR4+/+糖尿病組小鼠尿白蛋白/尿肌酐比值明顯升高，透射電鏡可見足突融合現(xiàn)象，足突消失，足細胞相關(guān)標(biāo)志物Podocin表達量明顯下調(diào)；TLR4基因敲除的糖尿病小鼠較TLR4+/+糖尿病組尿白蛋白/尿肌酐比值顯著下調(diào)，足細胞損傷減輕，Podocin表達量上調(diào)。結(jié)論：TLR4基因敲除可以降低糖尿病小鼠蛋白尿水平，減輕足細胞損害，這種足細胞保護作用與上調(diào)足細胞標(biāo)志物Podocin的表達水平有關(guān)。

糖尿病 足細胞 動物模型 Toll樣小體

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者最主要的慢性并發(fā)癥之一。DN發(fā)病率在慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的比例呈逐年上升趨勢。近年來，炎癥和免疫機制在DN的發(fā)生和發(fā)展中的重要作用已逐漸被認(rèn)識。進一步了解炎癥機制可能揭示復(fù)雜的代謝紊亂與DN結(jié)構(gòu)和功能改變之間的關(guān)系。Toll樣受體4（Toll-like receptor，TLR4）是參與天然免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子。已知糖尿病腎小球足細胞的病變在蛋白尿發(fā)生中起重要作用，然而，TLR4是否在糖尿病腎病足細胞損傷中也發(fā)揮作用，還不十分清楚。本文以TLR4基因敲除小鼠模型，探討TLR4在糖尿病腎病足細胞損傷中的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：雄性12周齡TLR4基因敲除（TLR4-/-）小鼠（杰克遜實驗室，美國）16只，對照組（TLR4+/+）為相同周齡雄性C57BL/6小鼠16只（上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司SCXK（滬）2012-0002），隨機分為TLR4-/-糖尿病組，TLR4-/-非糖尿病組，TLR4+/+糖尿病組，TLR4+/+非糖尿病組，每組各8只。實驗小鼠自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20℃～25℃。

1.1.2試劑和儀器Trizol RNA抽提試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄酶，Olig dT，SYBR?Premix Ex TaqTM熒光實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，均按說明書操作。熒光定量實時PCR儀為Applied Biosystems 7300（美國Applied Biosystems公司）。透射電鏡（菲利普CM120）由福建醫(yī)科大學(xué)電鏡室提供。

1.2方法

1.2.1糖尿病小鼠模型的建立：糖尿病組小鼠以鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，美國Sigma公司）50mg/kg連續(xù)腹腔注射5d，在注射2周后血糖≥250mg/dl定義為糖尿病造模成功。每周稱體重，每4周用血糖儀（Accu-Check，羅氏公司）測定血糖，尾靜脈取血，并于代謝籠內(nèi)收集小鼠尿液送檢驗科測定血肌酐，尿微量白蛋白及尿肌酐。于實驗第24周，小鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉后處死小鼠，取腎皮質(zhì)組織進一步實驗。

1.2.2小鼠腎臟透射電鏡觀察：取新鮮腎臟上、下極皮質(zhì)標(biāo)本，切成1mm×1mm×1mm大小，用3％戊二醛固定后送電鏡室制備標(biāo)本及觀察攝像。

1.2.3小鼠腎皮質(zhì)RNA抽提及實時熒光定量PCR檢測：將新鮮腎臟皮質(zhì)標(biāo)本用Trizol法抽提組織總RNA，經(jīng)SuperScriptTMⅢRT試劑盒合成cDNA。由Takara公司合成。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：Stage 1 95°C 10s，Stage 2 95°C 5s，60°C 31s，共40個循環(huán)，Stage 3 Dissociation。以βactin為內(nèi)參，校正每個樣本的Ct，以ΔCt代表每個基因的表達差異，確保每個模板的Ct值與起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。

2　結(jié)果

2.1STZ糖尿病小鼠模型鑒定STZ注射后第24周，與非糖尿病TLR4+/+和TLR4-/-小鼠病組相比，STZ糖尿病TLR4+/+和TLR4-/-小鼠體重均顯著降低（分別為P<0.05，P<0.01），空腹血糖均顯著升高（P<0.01）。說明本實驗STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠造模成功。（表1）

表1　實驗第24周各組實驗小鼠的生理生化指標(biāo)

2.2小鼠尿微量白蛋白和血肌酐測定：與TLR4+/+非糖尿病小鼠相比，TLR4+/+糖尿病小鼠腎臟體重比顯著升高（P<0.01），尿白蛋白與尿肌酐比值（ACR）顯著升高（P<0.01），血肌酐水平顯著升高（P<0.01）。提示糖尿病腎病模型造模成功。與TLR4+/+糖尿病小鼠相比，TLR4-/-糖尿病小鼠腎臟體重比，尿白蛋白與尿肌酐比值，血肌酐水平均顯著下調(diào)（P<0.05）。（表1）

2.3腎臟透射電鏡觀察：TLR4+/+糖尿病小鼠足細胞細胞膜破損，相鄰足突之間出現(xiàn)融合現(xiàn)象，非糖尿病對照組足細胞細胞膜完整，未出現(xiàn)足突融合現(xiàn)象，而TLR4-/-糖尿病小鼠上述病變顯著改善。（圖1）

與非糖尿病小鼠相比，TLR4+/+糖尿病小鼠出現(xiàn)足細胞融合，足突消失，TLR4-/-糖尿病小鼠上述病變顯著改善。GBM基底膜；Pd足細胞；Cap毛細血管。

2.4足細胞相關(guān)標(biāo)志物mRNA表達情況：與對照組相比，TLR4+/+糖尿病小鼠Podocin，WT1（分別P<0.01，P<0.05）表達顯著下調(diào)，而Nephrin水平有下調(diào)趨勢，但未達統(tǒng)計學(xué)意義。與TLR4+/+糖尿病小鼠相比，TLR4-/-糖尿病小鼠podocin水平顯著上調(diào)（P<0.05）。（圖2）

與非糖尿病TLR4+/+對照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01；與TLR4+/+糖尿病小鼠相比，#：P<0.05。

3　討論

糖尿病腎病特征性的腎小球病理改變包括系膜細胞的增生和腎小球基底膜的增厚，然而上述病理改變只能解釋30％～50％的糖尿病蛋白尿發(fā)生和腎小球濾過率的改變。近年來，足細胞損傷在糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生中病理機制逐漸被認(rèn)識。足細胞是腎小球濾過屏障的組成部分，與其他腎小球細胞不同，足細胞的再生能力有限，因此在出現(xiàn)損傷后足細胞足突融合，足細胞附著能力減弱，腎小球基底膜裸露區(qū)域增多，蛋白質(zhì)屏障被破壞，最終導(dǎo)致蛋白尿產(chǎn)生。因此研究足細胞損傷的機制可能為治療糖尿病腎病蛋白尿提供新的依據(jù)。

TLR4是機體天然免疫的一個經(jīng)典受體，它可特異性識別病原微生物繼而激活核因子NFκB，最終促進炎癥因子的釋放。近年來，許多研究表明，內(nèi)源性的配體例如高血糖，游離脂肪酸，脂蛋白，血管緊張素II也能激活TLR4/NFκB通路，促進炎癥反應(yīng)發(fā)生。因此，TLR4通路在非感染性炎癥中也起重要作用。例如2型糖尿病患者血中單核巨噬TLR4表達升高，與患者糖基化血紅蛋白水平和胰島素抵抗密切相關(guān)。免疫組化研究已證實，TLR4在腎臟固有細胞例如腎小管上皮細胞，介導(dǎo)糖尿病腎小管間質(zhì)病變和腎間質(zhì)纖維化。此外TLR4也在系膜細胞和腎小球內(nèi)皮細胞上廣泛表達，參與糖尿病腎病系膜增生和免疫相關(guān)腎病的炎癥反應(yīng)。在冷球蛋白血癥相關(guān)膜增生性腎小球腎炎動物模型中，免疫復(fù)合物沉積激活足細胞TLR4促進炎癥介質(zhì)釋放在發(fā)病中發(fā)揮重要的作用。本研究中，我們采用STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型，在24周后，糖尿病組小鼠已出現(xiàn)ACR顯著升高，與此一致，電鏡下足細胞出現(xiàn)脫落、足突融合現(xiàn)象，提示糖尿病腎病早期足細胞形態(tài)已發(fā)生改變。而TLR4基因敲除的小鼠ACR和血肌酐水平較未敲除的TLR4+/+組均顯著降低，提示TLR4可能促進糖尿病腎病蛋白尿產(chǎn)生，這種作用獨立于血糖水平存在，各實驗組血糖無明顯差異。電鏡下，TLR4基因敲除組足細胞脫落，足突融合明顯減輕，提示TLR4基因敲除對足細胞有保護作用。

我們進一步檢測了足細胞相關(guān)標(biāo)志物Nephrin、Podocin、WT-1 mRNA的表達情況，結(jié)果研究顯示糖尿病組上述足細胞標(biāo)志物表達均下調(diào)與電鏡下足細胞損傷結(jié)果一致。TLR4基因敲除上調(diào)了Podocin的表達而Nephrin和WT-1表達無明顯差異，提示TLR4在足細胞損傷的作用可能是作用于Podocin從而導(dǎo)致足突融合，濾過屏障受損。國外Ishwarlal et al.在STZ誘導(dǎo)的糖尿病17周的TLR4敲除小鼠模型也發(fā)現(xiàn)Podocin在TLR4敲除的小鼠顯著上調(diào)，與本實驗一致，然而同時WT-1表達水平也上調(diào)，可能與該實驗?zāi)Ｐ团c我們的實驗?zāi)Ｐ驼T導(dǎo)的病程不同有關(guān)。TLR4基因敲除對足細胞的保護機制可能與足細胞的磷酸肌醇依賴的激酶1（PDK1）上調(diào)，從而激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑，抑制足細胞的凋亡密切相關(guān)。此外，高血糖可能通過激活蛋白激酶C和細胞內(nèi)活性氧自由基，進而激活TLR4相關(guān)途徑促進足細胞炎癥因子的釋放，引起足細胞損傷。進一步通過足細胞培養(yǎng)體外實驗，可揭示其中更多的機制。

總之，TLR4信號傳導(dǎo)途徑在糖尿病腎病的足細胞損傷、腎小球濾過屏障受損和蛋白尿形成中發(fā)揮重要的作用。進一步探索抑制TLR4通路的藥物可能對治療糖尿病腎病、延緩蛋白尿進展有重要的意義。

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R 587.2

B

1672-8351（2016）11-0124-02

△福建省自然科學(xué)基金（2014J05083）