可降解復(fù)合止血膠原蛋白海綿的制備及生物應(yīng)用性能研究*

程瑋璐，李 慧，賀金梅，李大龍，王曉峰，吳亞?wèn)|，黃玉東**

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科，黑龍江哈爾濱150001）

可降解復(fù)合止血膠原蛋白海綿的制備及生物應(yīng)用性能研究*

程瑋璐1，李 慧2，賀金梅1，李大龍1，王曉峰2，吳亞?wèn)|1，黃玉東1**

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科，黑龍江哈爾濱150001）

膠原蛋白（Col）是自然界中一種生物相容性?xún)?yōu)異的材料，可用于傷口愈合和組織修復(fù)。然而，由于其本身力學(xué)強(qiáng)度差，止血效果一般，純膠原海綿不能廣泛在齒科手術(shù)中用于止血填充材料。利用氧化再生纖維素（ORC）作為膠原蛋白海綿中的填料可提升材料強(qiáng)度及止血效果。結(jié)果表明：Col-0.25%ORC具有最優(yōu)異的力學(xué)強(qiáng)度，并可有效地縮短止血時(shí)間。所有材料均可以在三周內(nèi)完成體內(nèi)降解，并且無(wú)明顯異常反應(yīng)。

膠原蛋白；氧化再生纖維素；止血；復(fù)合材料

前言

當(dāng)今世界科技的發(fā)展日新月異，與此同時(shí)，醫(yī)療技術(shù)水平也在快速提高，手術(shù)治療范圍不斷擴(kuò)大，如何縮短手術(shù)時(shí)間，減少術(shù)中、術(shù)后出血都對(duì)加速患者傷愈有著重要的影響，尤其在各種突發(fā)事件及惡劣環(huán)境條件下，使創(chuàng)面在短時(shí)間內(nèi)快速有效止血?jiǎng)t是搶救生命最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。為了能夠達(dá)到更加優(yōu)異的止血效果，人們?cè)谠兄寡牧?、技術(shù)的基礎(chǔ)之上，開(kāi)始在新型止血材料的開(kāi)發(fā)方面進(jìn)行研究，并已經(jīng)在臨床應(yīng)用中逐步得以發(fā)展。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，隨著醫(yī)用天然高分子材料和醫(yī)用合成高分子材料用于止血材料和外傷敷料的研究，迄今為止該類(lèi)材料的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用已經(jīng)有了質(zhì)的飛躍[1]。

目前的止血材料有纖維蛋白膠、明膠海綿、氧化再生纖維素、殼聚糖、海藻酸鹽、微纖維膠原、凝血酶、殼聚糖、沸石、膠原蛋白海綿、各種合成的高分子醫(yī)用膠等[2～4]。其中，膠原蛋白是自然界中一種生物相容性?xún)?yōu)異的材料，可用于傷口愈合和組織修復(fù)。然而，由于其本身力學(xué)強(qiáng)度差，止血效果一般，純膠原海綿不能廣泛在齒科手術(shù)中用于止血填充材料[5,6]。氧化再生纖維素以其更加優(yōu)異的性能在眾多止血材料中脫穎而出[7,8]。目前臨床上使用最廣泛的氧化再生纖維素類(lèi)醫(yī)用可吸收止血紗布是美國(guó)強(qiáng)生（Johnson）公司生產(chǎn)的可溶性止血紗布，在國(guó)內(nèi)又稱(chēng)“速即紗”[9]。氧化再生纖維素與血液接觸后可膨脹成為棕色的凝膠塊，有助于形成凝血塊從而達(dá)到止血目的；同時(shí)，氧化再生纖維素還有一定殺菌能力。

本文利用具有一定力學(xué)強(qiáng)度的氧化再生纖維素作為膠原蛋白海綿的填料，制備出了新型可降解膠原蛋白/氧化再生纖維素復(fù)合型止血海綿，并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，考察了其理化性能、止血效果及體內(nèi)降解周期。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 Col/ORC復(fù)合止血海綿的制備

采用牛跟腱為原材料，利用酶解法在0.2%的醋酸溶液中提取膠原蛋白，4℃間歇攪拌3d，離心取上清液，鹽析，透析6d后凍干備用。將凍干膠原溶于0.5%醋酸溶液中,膠原（干樣品）與ORC（實(shí)驗(yàn)室自制）[10]按多種不同質(zhì)量比復(fù)合：Col-0.25%ORC，Col-0.5%ORC，Col-1%ORC。ORC粉末分散在水中,經(jīng)過(guò)超聲震蕩20min后與膠原分散液混合攪拌,低功率超聲振蕩使混合均勻,風(fēng)干成復(fù)合材料。對(duì)照組采用市售TrauerR 膠原蛋白海綿（Control），以及自制純膠原蛋白海綿（Col）。

1.2 復(fù)合止血海綿的理化性能表征

采用NIGOLET-Nexus670傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行復(fù)合材料的紅外光譜測(cè)定。采用WD-1型電子萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)（拉伸速度為10mm/min）進(jìn)行拉伸實(shí)驗(yàn)，記錄材料斷裂時(shí)的拉力及拉伸斷裂應(yīng)變，計(jì)算材料的拉伸強(qiáng)度。采用JJC-1光學(xué)型接觸角測(cè)定儀測(cè)量材料表面的接觸角。

1.3 復(fù)合止血海綿的止血效果評(píng)價(jià)

將測(cè)試材料剪成2.0cm×2.0cm大小若干塊，稱(chēng)重、滅菌、備用。選取體重3.0～3.5kg的新西蘭兔分為若干組，每組5只。按40mg/kg劑量靜脈緩慢注射戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉。

1.3.1 兔耳動(dòng)脈止血模型

將其中央耳動(dòng)脈區(qū)域備皮、消毒，沿耳動(dòng)脈方向切開(kāi)皮膚，鈍性分離出耳動(dòng)脈、靜脈和神經(jīng)，再用手術(shù)刀橫向切斷動(dòng)脈，待血液涌出后立即用1層測(cè)試材料或?qū)φ諛淤N敷于傷口表面并使用推拉力計(jì)施加3N的壓力，每隔10s觀察止血情況，直至最終完全止血后記錄止血時(shí)間，并取下材料稱(chēng)重，通過(guò)公式（1）計(jì)算出血量，取5組平均值為最終結(jié)果。

式中mBL—出血量；

m1—止血后材料質(zhì)量；

m0—貼敷前材料質(zhì)量。

1.3.2 兔耳動(dòng)脈止血模型

動(dòng)物麻醉后將其腹部朝上固定，腹部備皮尺寸約5cm×4cm，常規(guī)消毒后，于劍突下沿腹中線縱向切開(kāi)皮膚，鈍性分離皮下組織，暴露腹膜，縱向切開(kāi)腹膜，切口長(zhǎng)約5cm，用醫(yī)用消毒紗布吸干切口部位的血液和組織液。充分暴露肝前葉，在其表面用手術(shù)刀作1.0cm×1.0cm的創(chuàng)口，深度約3mm，并將創(chuàng)面肝被膜及其下的肝組織取下。血液涌出后，立即將1層測(cè)試材料或?qū)φ諛淤N敷于創(chuàng)口表面并使用推拉力計(jì)施加3N的壓力，每隔10s觀察止血情況，直至最終完全止血后記錄止血時(shí)間，并取下材料稱(chēng)重，通過(guò)公式（1）計(jì)算出血量，取5組平均值為最終結(jié)果。

1.4 復(fù)合止血海綿的體內(nèi)降解評(píng)價(jià)

將測(cè)試材料裁剪成直徑約為10mm的圓片，滅菌、備用。兔腹腔處緩慢注射戊巴比妥鈉溶液麻醉，然后分別將測(cè)試材料（Col/ORC）和對(duì)照組（Col, Control）植入到兔背部皮下，每只動(dòng)物背部均選取6個(gè)植入點(diǎn)，間隔2～3cm。隨即注射20000U/kg慶大霉素。每種植入材料均選取7d、14d、28d三個(gè)植入期，每種材料每個(gè)植入期使用3只大鼠，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物集中飼養(yǎng)直至植入期結(jié)束。待每個(gè)植入期結(jié)束時(shí)，對(duì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射過(guò)量的戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行人道處死，取出材料植入部位及其周?chē)慕M織，放入20%福爾馬林溶液中固定。待乙醇梯度脫水處理后，進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色，最后進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 Col/ORC復(fù)合海綿的理化性能分析

從紅外譜圖中（圖1）我們可以看出3335cm-1處的峰是分子間氫鍵O-H伸縮振動(dòng)。1724cm-1處的峰是ORC的酯鍵上C=O伸縮振動(dòng)特征峰，1314cm-1處的峰可能是亞甲基的彎曲振動(dòng)，也可能是酯的C-O伸縮振動(dòng)，而1080cm-1峰在復(fù)合材料里可能是仲醇上C-O伸縮振動(dòng)，在膠原蛋白里則可能是與氨基相連的碳的C-H伸縮振動(dòng)峰。1031cm-1處的峰是伯醇的伸縮振動(dòng)，也是ORC的特征峰。

Col/ORC復(fù)合材料的紅外光譜圖中，隨著ORC含量的增加，1724cm-1以及1031cm-1處的峰越來(lái)越明顯，Col-1%ORC該處的峰最尖最突出，而1080cm-1處的峰逐漸減弱，推測(cè)1080cm-1處的峰是在膠原蛋白里與氨基相連的碳的C-H伸縮振動(dòng)峰的可能性更大。兩處吸收振動(dòng)峰的趨勢(shì)性變化說(shuō)明二者混合相互作用后，ORC的加入使膠原蛋白的官能團(tuán)產(chǎn)生變化，發(fā)生了分子間的相互作用。

從拉伸試驗(yàn)結(jié)果看出（圖2A）：Col力學(xué)性能最佳因其拉伸力最大，Col-0.25%ORC次之，復(fù)合材料最大拉伸力隨OMC含量增加而減小，Control最小。在氣、液、固三相交界處，自固-液界面經(jīng)過(guò)液體內(nèi)部到氣-液界面的夾角稱(chēng)為接觸角,用以表示材料能被潤(rùn)濕的性能。根據(jù)濕潤(rùn)角的大小判斷潤(rùn)濕情況：θ=0°不存在鋪展，0°<θ<90°浸濕，90°<θ<180°粘濕，θ=180°完全不潤(rùn)濕。理論上講，較小的接觸角，意味著材料表面濕潤(rùn)良好。從圖2B中得出Col表面接觸角最小,因此其濕潤(rùn)性最佳，Col-0.25%ORC的表面濕潤(rùn)性次之，復(fù)合材料接觸角隨ORC含量增加而增加，Control最大。

圖1 不同材料的紅外譜圖Fig.1The FTIR spectra of control,Col,Col/ORC composites（Col-0.25%ORC,Col-0.5%ORC,Col-1%ORC）,and ORC

圖2 Col與Col/ORC復(fù)合海綿物理性能對(duì)比：（A）拉伸強(qiáng)度；（B）接觸角測(cè)定Fig.2The physical properties comparison between the Col and the Col/ORC composites:（A）Tensile strength;（B）Contact angle.

2.2 Col/ORC復(fù)合海綿的止血性能分析

與對(duì)照材料的止血時(shí)間相比（表1），不論是兔耳動(dòng)脈止血模型還是兔肝部止血模型，Col及其與ORC的復(fù)合材料止血時(shí)間均明顯減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異p<0.05。止血時(shí)間最短的是Col-0.25% ORC，耳部止血時(shí)間為22.5±3.99s,肝部止血時(shí)間為23.17±1.33s,與所有的測(cè)試材料相比，止血最為迅速。耳動(dòng)脈止血實(shí)驗(yàn)中，Col-0.5%ORC材料止血時(shí)間為30.5±8.29s，止血速度較快。肝部止血實(shí)驗(yàn)中，Col也可迅速止血，時(shí)間為26.17±3.76s。

與對(duì)照材料組的出血量相比，在兔耳動(dòng)脈止血模型或兔肝部止血模型中，Col及Col/ORC復(fù)合材料組的出血量均明顯減小，經(jīng)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)差異p< 0.05，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，Col-0.25% ORC組的出血量最小，耳部模型出血量是為36.87±9.07mg,肝部模型出血量為52.4±16.12mg。

圖3 兩種創(chuàng)傷模型中Col及不同Col/ORC復(fù)合海綿的平均出血量Fig.3The amount of bleeding of Col and different Col/ORC composites in injury models

表1 兩種創(chuàng)傷模型中Col及不同Col/ORC復(fù)合海綿的平均止血時(shí)間Table 1The mean hemostatic time of Col and different Col/ ORC composites in two kinds of rabbit injury models

2.3 Col/ORC復(fù)合海綿的體內(nèi)降解性能分析

種植28d時(shí)，按原切口位置及大小再次切開(kāi)皮膚組織暴露的植入?yún)^(qū)，可見(jiàn)三個(gè)切口內(nèi)組織恢復(fù)良好，無(wú)化膿、滲出液、充血或炎性水腫等情況。分別將植入7，14及28d后的材料從組織中分離出來(lái)，并測(cè)量材料直徑大小，圖4結(jié)果顯示，植入7d時(shí)，很容易從植入點(diǎn)觀察到三種材料，形狀近似團(tuán)狀，手術(shù)器械將其從組織中分離出來(lái)容易，（a）Control材料直徑約為6mm，（b）Col材料與（c）Col-0.25% ORC材料直徑約為4.5mm，（c）顏色為乳白色，（a）及（b）材料顏色較（c）渾濁暗紅，疑似植入后組織內(nèi)炎癥反應(yīng)過(guò)程中組織液滲出所致。植入14d時(shí)，肉眼觀察植入點(diǎn)材料較困難，用器械尋找，發(fā)現(xiàn)材料與周?chē)M織粘連，但仍可剝離，（d）Control材料及（e）Col材料形狀為條狀，半透明，（f）Col-0.25%ORC呈圓形，直徑較7d時(shí)明顯減小，約為1.0mm。植入28d時(shí)，肉眼未見(jiàn)材料樣物質(zhì)，用器械亦未探查到。

圖5為各材料種植于兔腿部肌肉1,7,14,28d后的組織病理圖。經(jīng)HE染色的材料呈不規(guī)則團(tuán)狀或散在的碎片狀，顏色為比正常組織深的深紫色或紫紅色。由于切片及染色過(guò)程存在一定誤差，所以有些材料并未著色，或呈不規(guī)則島狀空腔。

1d組可見(jiàn)：圖5a中部分肌纖維壞死消失，中間可見(jiàn)不規(guī)則Control材料。圖5b肌肉組織內(nèi)不著色Col材料，圖5c肌組織及其周?chē)梢?jiàn)大量的炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn).

7d組可見(jiàn)：圖5d部分壞死的肌纖維被纖維性結(jié)締組織取代，可見(jiàn)不規(guī)則Control材料和多核巨細(xì)胞,圖5e肌組織內(nèi)出血、大量的炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增生，圖5f肌肉組織中有大量的多核巨細(xì)胞以及被其吞噬的材料Col-ORC碎片。

14d組可見(jiàn)：圖5g～i中均可見(jiàn)炎癥反應(yīng)，圖5g可見(jiàn)殘存的材料碎片，同時(shí)仍有多核巨細(xì)胞。圖5h和圖5i中肌肉發(fā)生纖維組織增生，圖5i中炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)較圖5h更為嚴(yán)重。

28d組可見(jiàn)：圖5j～l中，肌肉組織內(nèi)均未見(jiàn)材料碎片，圖5k和圖5l組織恢復(fù)良好，圖5j內(nèi)仍可見(jiàn)局部的炎癥性反應(yīng).

圖4 不同材料體內(nèi)植入7，14d局部組織肉眼觀察及28d植入部位肉眼觀察Fig.4（A）The observation of subcutaneously implanted materials（control,Col and Col-0.25%ORC）stripped out after 7 and 14 days of implantation;（B）The healing of incision after 28 days implantation surgery;（C）The status of the tissues surrounding planting areas after 28 days implantation surgery

圖5 不同材料分別植入兔腿部1，7，14和28d后的局部組織病理圖（HE染色）Fig.5The histopathological examination of control,Col and Col-0.25%ORC materials after 1,7,14 and 28 days of implantation.

由此可見(jiàn)，三種材料埋入體內(nèi)后隨時(shí)間逐漸被降解，初期都會(huì)引起周?chē)∪饨M織的炎癥性反應(yīng)甚至局部壞死，而后成纖維細(xì)胞增多，纖維組織增生，這些過(guò)程促進(jìn)組織愈合，同時(shí)炎癥逐漸減弱。28d時(shí)三種材料基本降解完全，Col及Col-ORC組肌肉組織恢復(fù)良好，Control組仍見(jiàn)局部炎癥反應(yīng)，說(shuō)明需更長(zhǎng)時(shí)間才能恢復(fù)正常。

3 結(jié)論

本文制備了一種以O(shè)RC短纖為填料的膠原蛋白復(fù)合止血材料。通過(guò)紅外譜圖可以看出，添加ORC之后，膠原蛋白復(fù)合材料中羧基特征峰明顯。與對(duì)照組（TrauerR 膠原蛋白海綿）相比，本實(shí)驗(yàn)室研制出的Col-0.25%ORC復(fù)合材料具有更好的力學(xué)強(qiáng)度，潤(rùn)濕性更為優(yōu)異。因此，該材料的止血效果大幅提升，并可以在植入體內(nèi)28d后完全降解，對(duì)周?chē)M織無(wú)明顯異常影響。綜上所述，此復(fù)合材料可以作為止血填充體廣泛地用于口腔頜面外科手術(shù)中，具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］TIMOR L S,GOLDBART A D,SEGAL N,et al.Circulating cytokines in patients undergoing tonsillectomy with fibrin glue［J］.International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology,2012, 76:419～422.

［2］李若慧，?？低?，王思.殼聚糖-羥丙基纖維素共混膜的生物黏附性［J］.化學(xué)與黏合,2012,35（4）:23～27.

［3］王勇.體內(nèi)可吸收止血材料研究及臨床應(yīng)用［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2009,26（4）:922～926.

［4］于美麗，杜智.可吸收止血材料的研究現(xiàn)狀及臨床應(yīng)用［J］.北京生物醫(yī)學(xué)工程,2008,27（2）:208～211.

［5］何薇婧，黃玉東，李艷輝.交聯(lián)膠原蛋白的降解表征［J］.化學(xué)與黏合,2005,27（3）:139～142.

［6］段志廣.類(lèi)人膠原蛋白止血海綿的性能研究［D］.西北大學(xué),2008.

［7］SCHER K S,COIL J A.Effects of oxidized cellulose and microfibrillar collagen on infection［J］.Surgery,1982,91:301～304.

［8］SCHONAUER C,TESSITORE E,MORACI A C,et al.The use of local agents:bone wax,gelatin,collagen,oxidized cellulose［J］.European Spine Journal,2004,13:（Supp1.1）:S89～S96.

［9］SPANGLER D,ROTHENBURGER S,NGUYEN K,et al.In vitro antimicrobial activity of oxidized regenerated cellulose against antibiotic-resistant microorganisms［J］.Surgical Infections,2003, 3（4）:255～262.

［10］CHENG W L,HE J M,HUANG Y D,et al.Preparation and characterizationofoxidizedregeneratedcellulosefilmfor hemostasis and the effect of blood on its surface［J］.Cellulose, 2013,20:2547～2558.

Preparation and Characterization of Collagen Composite Hemostatic Sponge and the Study on Its Biodegradation

CHENG Wei-lu1,LI Hui2,HE Jin-mei1,LI Da-long1,WANG Xiao-feng2,WU Ya-dong1and HUANG Yu-dong1
（1.College of Chemical Engineering and Technology,Harbin Institute of Technology,Harbin 150001,China;2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China）

The collagen is widely used in wound healing and organ repair which is a material with excellent biocompatibility.However,the limited strength and fair hemostatic effect of collagen restrains its application as hemostasis and filling materials in dental treatment.In this study,the ultra-porous collagen（Col）/oxidized regenerated cellulose（ORC）composites is prepared.The results of physical properties measurement indicated that the Col has the most excellent tensile strength,and the Col-0.25%ORC performed optimized wettability,porosity and water absorption.The Col-0.25%ORC has the most outstanding strength and can effectively shorten the hemostatic time,and it can be degraded completely without inflammatory reaction after 3 weeks.

Collagen;oxidized regenerated cellulose;hemostatic;composite

TQ342.87

A

1001-0017（2016）04-0231-05

2016-04-07*基金項(xiàng)目：威海市經(jīng)濟(jì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013GNS028）；中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：2013M541372）

程瑋璐(1987-)，女，吉林省吉林市人，博士在讀，研究方向?yàn)樯镝t(yī)用高分子材料。

**通訊聯(lián)系人：黃玉東(1965-)，男，博士，教授，主要從事復(fù)合材料相關(guān)研究。E-mail:ydhuang.hit1@aliyun.com