重組人甲狀旁腺素對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的影響

李丁 王俊芳 張成玉

【摘要】 目的：探討不同濃度的重組人甲狀旁腺素（hPTH1-34）對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）表達(dá)的影響。方法：培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、hPTH1-34組（共3組，PTH濃度分別為40 μg/L、400 μg/L、4000 μg/L組）。給藥后第4、7、14天檢測(cè)堿性磷酸酶活性、BMP2的表達(dá)。結(jié)果：給藥第7、14天，較高劑量組（4000 μg/L、400 μg/L）堿性磷酸酶活性較低劑量組（40 μg/L）有下降。給藥第14天，所有給藥組的堿性磷酸酶活性均低于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05）。給藥第7、14天，較高劑量組（4000 μg/L、400 μg/L）的BMP2含量低于低劑量組（40 μg/L）（P<0.05）。hPTH1-34低劑量組（40 μg/L）BMP2濃度較空白對(duì)照組明顯高（P<0.05）。結(jié)論：在一定濃度范圍內(nèi)，hPTH1-34間歇用藥有促成骨細(xì)胞增生與分化作用，并呈時(shí)間依賴性；超過(guò)一定濃度后則反而抑制成骨細(xì)胞的增殖與分化。

【關(guān)鍵詞】 重組人甲狀旁腺素； 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； BMP2

中圖分類號(hào) R329.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2016）4-0005-03

Effect of Recombinant Human Parathyroid Hormone on the Expression of Bone Morphogenetic Protein 2 in Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells/LI Ding，WANG Jun-fang，ZHANG Cheng-yu.//Chinese and Foreign Medical Research，2016，14（4）：5-6

【Abstract】 Objective：To detect the effect of recombinant human parathyroid hormone（hPTH1-34） on the expression of bone morphogenetic protein 2（BMP2） in human bone marrow mesenchymal stem cells.Method：The cultured human bone marrow mesenchymal stem cells（MSCs） were divided into blank control group，positive control group，hPTH1-34 group（the concentrations were 40 μg/L，400 μg/L，4000 μg/L group）.The alkaline phosphatase activity and the concentration of BMP2 were detected in the 4th，7th and 14th day after administration.Result：In the 7th and 14th day，the alkaline phosphatase activity of high dose group（4000 μg/L，400 μg/L） were lower than low dose group（40 μg/L）.In the 14th day，the activities of the alkaline phosphatase in all hPTH1-34 groups were lower than the positive control group.In the 7th and 14th day，the BMP2 concentration in high dose group（4000 μg/L，400 μg/L） were lower than low dose group（40 μg/L）.The BMP2 concentration in low dose group（40 μg/L） was significantly higher than the control group.Conclusion：In a certain concentration range，intermittent medication of hPTH1-34 can promote the proliferation and differentiation of osteoblast in a time-dependent manner.However，when exceeding certain concentration，hPTH1-34 can inhibit the proliferation and differentiation of osteoblasts.

【Key words】 Recombinant human parathyroid hormone； Human bone marrow mesenchymal stem cells； Bone morphogenetic protein 2

First-authors address：Wuxi Peoples Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Wuxi 214023，China

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.4.003

目前對(duì)于骨質(zhì)疏松的治療主要包括三個(gè)方面，（1）減少或延緩骨吸收：常用雙膦酸鹽類、降鈣素類、雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等；（2）活性維生素D、維生素K、鍶鹽、鈣劑和中藥等則通過(guò)其他途徑改善骨量；（3）增加骨重建的藥物包括氟化物、PTH（parathyroid hormone，甲狀旁腺素）、他汀類和鍶鹽等[1]。

目前已知在體外實(shí)驗(yàn)中，PTH間歇性給藥有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，而連續(xù)大劑量給藥則抑制其向成骨細(xì)胞分化[2-4]。而B(niǎo)MP2是目前已知的最重要的促成骨細(xì)胞分化的生長(zhǎng)因子之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加不同PTH濃度及給藥時(shí)間，檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMP2的表達(dá)量，探討PTH與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)BMP2間關(guān)系，為進(jìn)一步研究PTH促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

重組人甲狀旁腺素1-34氨基酸片段，白色凍干粉，1 mg/支；L-DMEM、維生素C；淋巴細(xì)胞分離液；地塞米松；β-甘油磷酸，低糖DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS），堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），人BMP2測(cè)定試劑盒（Abvona）。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離和培養(yǎng)

采用離心法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。無(wú)菌條件下，取無(wú)骨代謝疾病骨科手術(shù)患者骨髓組織約5 ml。肝素抗凝，等量PBS稀釋，按2∶1比例加入淋巴細(xì)胞分離液。400 g離心30 min，取中間白膜層，PBS洗滌2遍，接種細(xì)胞于含基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

傳代培養(yǎng)：PBS洗滌2遍，加入0.25%trypsin-EDTA消化2 min，使用等量含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。150 g離心5 min，棄上清，接種細(xì)胞于培養(yǎng)皿中。

培養(yǎng)條件：37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2 95%的濕度，培養(yǎng)72 h后首次換液，以后每3天換液1次。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)采用傳代細(xì)胞進(jìn)行。傳代細(xì)胞隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組（生理鹽水組）、陽(yáng)性對(duì)照組（OS液組，即100 nm地塞米松、10 mmβ-甘油磷酸、50 μg/ml維生素C）、hPTH1-34組（共3組，PTH濃度分別為40 μg/L、400 μg/L、4000 μg/L組）。每組研究數(shù)量n=6。PTH給藥組為間歇性給藥，以48 h為一個(gè)周期。即給藥6 h后，更換不含藥培養(yǎng)基。整個(gè)觀察時(shí)間為14 d。

1.4 堿性磷酸酶活性的測(cè)定

細(xì)胞用PBS洗滌2遍，0.25%trypsin-EDTA消化1 min，等量含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。離心后保存。分別收集空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組4 d、7 d、14 d細(xì)胞，于冰水浴中超聲粉碎。堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞中堿性磷酸酶活性。具體步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 ELISA檢測(cè)hPTH1-34對(duì)BMP2表達(dá)的影響

將P2代細(xì)胞接種于96孔板，在給藥后第4、7、14天測(cè)定。離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞用超聲波破碎儀破碎釋放胞內(nèi)的BMP-2蛋白進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定各組樣品450 nm波長(zhǎng)的吸光度（OD值）。具體步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，各組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)行q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 hPTH1-34對(duì)堿性磷酸酶活性的影響

結(jié)果如表1所示。陽(yáng)性對(duì)照組的堿性磷酸酶活性明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，各組堿性磷酸酶活性均逐漸增加。給藥第7、14天觀察發(fā)現(xiàn)，較高劑量組（4000 μg/L、400 μg/L）與低劑量組40 μg/L相比，堿性磷酸酶活性有下降趨勢(shì)。給藥第14天hPTH1-34給藥組的堿性磷酸酶活性均低于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05）。

2.2 hPTH1-34對(duì)BMP2表達(dá)的影響

檢測(cè)上清液和胞內(nèi)的BMP2表達(dá)總和，結(jié)果詳見(jiàn)表2。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，BMP2含量各組均有升高，陽(yáng)性對(duì)照組的BMP2含量顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），給藥第7、14天觀察發(fā)現(xiàn)，較高劑量組（4000 μg/L、400 μg/L）的BMP2含量低于低劑量組40 μg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白對(duì)照組相比，第7、14天檢測(cè)hPTH1-34低劑量40 μg/L組的BMP2濃度明顯高（P<0.05），提示合適濃度的hPTH1-34可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌BMP2蛋白，具有一定的成骨作用。

表2 各組BMP2吸光度（OD值）比較

組別 第4天 第7天 第14天

空白對(duì)照組（n=6） 0.105±0.018 0.331±0.069 1.159±0.074

陽(yáng)性對(duì)照組（n=6） 0.197±0.027 0.795±0.060 1.406±0.309

PTH40 μg/L組（n=6） 0.095±0.031 0.419±0.019 1.220±0.176

PTH400 μg/L組（n=6） 0.110±0.012 0.357±0.019 1.039±0.142

PTH4000 μg/L組（n=6） 0.133±0.031 0.355±0.033 0.989±0.132

3 討論

人源性甲狀旁腺素在甲狀旁腺的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，其在血中存在有3種形式：（1）具有生物活性的全段PTH，占5%～20%；（2）氨基端PTH片段（N.PTH1-34），含量甚少，具有生物活性；（3）羧基端PTH片段（C-PTH），為血循環(huán)中的主要部分，占75%～95%，但其只有免疫源性，而無(wú)生物活性。對(duì)PTH（1-34）這一生物活性片段的研究表明，PTH可能通過(guò)影響包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨骼內(nèi)襯細(xì)胞、骨細(xì)胞等眾多種類的細(xì)胞系，并激活多種信號(hào)途徑，從而達(dá)到促進(jìn)骨形成的作用[4]。hPTH1-34是最早人工合成的具有全分子活性的PTH氨基端片段，目前被認(rèn)為是最有前途的骨形成促進(jìn)劑，有望應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的防治。國(guó)內(nèi)韓亞娟等[5]報(bào)道在臨床使用PTH（1-34）能顯著提高腰椎（L2～L4）骨密度，對(duì)于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥治療安全有效。目前，PTH已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的治療，而且是第一代骨形成刺激藥的首選藥[6]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為條件成骨細(xì)胞，許多研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在一定理化條件下可向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化，廣泛應(yīng)用于研究各種因素對(duì)成骨分化的影響[3]。其中地塞米松、β-甘油磷酸、維生素C的聯(lián)合誘導(dǎo)作用已被公認(rèn)。

BMP2是目前已知的最重要的成骨細(xì)胞因子之一，是BMP家族中成骨誘導(dǎo)作用最強(qiáng)的因子?？稍趽p傷局部及異位促進(jìn)細(xì)胞增殖，也是唯一能夠在異位誘導(dǎo)成骨的信號(hào)分子[7]。甲狀旁腺素對(duì)骨具有雙向調(diào)節(jié)作用——即可促進(jìn)骨形成，又可促進(jìn)骨吸收，而此作用可能與甲狀旁腺素的作用時(shí)間及作用劑量有關(guān)。Dobnig等[8]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用泵控制給藥時(shí)間小于2 h的引起骨合成，而長(zhǎng)于2 h的則引起骨吸收。日本學(xué)者研究顯示不同劑量重組人甲狀旁腺素連續(xù)刺激對(duì)人成骨樣細(xì)胞的影響也不同[9]。據(jù)此本實(shí)驗(yàn)主要從不同劑量的PTH間斷刺激觀察對(duì)人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化及BMP2表達(dá)的影響。結(jié)果顯示PTH作用后堿性磷酸酶的活性均有提高，提示PTH有促進(jìn)骨形成的作用，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[3，10]一致。隨著給藥實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，PTH濃度為40 μg/L時(shí)堿性磷酸酶活性為三組中最高，說(shuō)明在間歇刺激下低劑量PTH更能促進(jìn)骨形成。三種濃度的實(shí)驗(yàn)組的堿性磷酸酶均低于陽(yáng)性對(duì)照組，尤其是第14天甚至低于空白對(duì)照組；這提示PTH的長(zhǎng)時(shí)間使用不利于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化。雖然給藥初期隨著劑量的增加，堿性磷酸酶活性略有增加，可能與給藥時(shí)間較短，骨合成作用占優(yōu)勢(shì)有關(guān)。這與張玲等[3]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。已有的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PTH促成骨細(xì)胞表達(dá)BMP2具體機(jī)制可能為激活cAMP（cyclic adenosine monophosphate，環(huán)腺苷酸）-PKA（protein kinase A，蛋白激酶A）-CREB（cAMP response element binding protein，cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白）通路[11-12]。PTH與其受體結(jié)合，引起cAMP生成，激活PKA活性，進(jìn)一步磷酸化激活CREB；CREB進(jìn)而與其余一些共激活因子，通過(guò)CRE（cAMP response element，cAMP效應(yīng)元件）與靶基因結(jié)合，從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。Fei等[13]研究表明在骨折愈合過(guò)程中FGF2信號(hào)通路與PTH信號(hào)在骨形成和修復(fù)方面存在交聯(lián)，并相應(yīng)引起B(yǎng)MP2表達(dá)改變。Yu等[14]研究發(fā)現(xiàn)PTH誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化通過(guò)PTH和脂蛋白受體相關(guān)蛋白6（LRP6）實(shí)現(xiàn)，主要是通過(guò)增強(qiáng)BMP信號(hào)通路，增強(qiáng)Smad1的磷酸化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果PTH作用后BMP2含量均有所提高，驗(yàn)證了PTH與BMP2的相關(guān)性。與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。隨著給藥實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，PTH濃度為40 μg/L時(shí)BMP2含量為三組中最高，說(shuō)明PTH的促成骨作用并非劑量依賴性，僅低濃度有利于成骨分化，在今后的臨床應(yīng)用中應(yīng)注意給予合適的濃度。

本研究結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)間歇用藥有促成骨細(xì)胞增生與分化作用，與既往文獻(xiàn)[2，4]結(jié)果相似，并呈時(shí)間依賴性；超過(guò)一定濃度后則反而抑制成骨細(xì)胞的增殖與分化，同時(shí)給藥濃度越高抑制作用越強(qiáng)。然而由于條件所限，確切的機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)通路未能進(jìn)行深入研究。另外本研究的觀察時(shí)間為14 d，14 d后的細(xì)胞增殖和分化有待于研究進(jìn)一步完善；而PTH用于臨床中促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化從而用于防治骨質(zhì)疏松的合適濃度等問(wèn)題則需設(shè)計(jì)合理的臨床研究進(jìn)一步明確。

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（收稿日期：2015-10-13）