液相芯片技術(shù)同時檢測萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇

梁世正 潘家榮

摘 要 建立了一種同時檢測獸藥萊克多巴胺（RAC）、克倫特羅（CL）、沙丁胺醇（SAL）的多殘留的新方法。采用液相懸浮芯片技術(shù)，基于間接競爭法的原理，將3種獸藥抗原分別偶聯(lián)到不同的熒光微球上作為探針，以藻紅蛋白（PE）熒光標記二抗為信號，通過優(yōu)化實驗條件，分別建立3種獸藥的標準曲線。基于特異性識別實驗，建立3種獸藥同時檢測的標準曲線。結(jié)果表明，同時檢測的3條曲線均呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，RAC， CL和SAL的檢測范圍分別為1～500 μg/L， 0.1～500 μg/L， 1～100 μg/L，檢出限分別為0.68， 0.095和0.88 μg/L。與其它結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均低于1.5%，實際樣品中的加標回收率令人滿意。

關(guān)鍵詞 液相芯片技術(shù)；多殘留分析；萊克多巴胺；克倫特羅；沙丁胺醇

1 引 言

由于“瘦肉精”具有明顯的促生長、提高瘦肉率及減少脂肪的效果，近年來常發(fā)生違法使用“瘦肉精”事件[1]。非法添加的“瘦肉精”以萊克多巴胺（RAC）、克倫特羅（CL）、沙丁胺醇（SAL）較為常見，2012年中華人民共和國農(nóng)業(yè)部1682號公告將其均列為“瘦肉精”，以加強監(jiān)測?！笆萑饩辈粌H危害消費者身體健康，可引起中毒，嚴重者甚至可引起死亡，同時也被世界反興奮劑機構(gòu)列為運動員禁用的興奮劑[2，3]。因此大力研發(fā)“瘦肉精”殘留檢測技術(shù)具有非常重要的現(xiàn)實意義。

現(xiàn)有RAC、CL和SAL等“瘦肉精”的快速檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[4，5]、膠體金法[6]、化學(xué)發(fā)光酶免疫法[7]、傳感器技術(shù)[8]、表面增強拉曼光譜技術(shù)[9]等，但上述方法通常只能針對一種物質(zhì)檢測。文獻報道的多殘留檢測技術(shù)，也只針對這3種物質(zhì)的總量測定[10，11]。在多殘留同時分析中，更多采用的是液相色譜法[ 12，13]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[ 14]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[ 15，16]、毛細管電泳法[17]等，這些方法雖然靈敏度較高，但普遍存在樣品前處理復(fù)雜、耗時長的不足，在檢測樣品量較大時尤為突出。

液相芯片技術(shù)（Suspension array technology，SAT）是20世紀末開發(fā)的基于熒光微球的多功能分析平臺，也是唯一經(jīng)美國食品與藥品管理局批準應(yīng)用于臨床診斷的新型生物芯片產(chǎn)品[18]。它具有靈敏度高、檢測速度快、靈活性強的優(yōu)點，可在2～3 h內(nèi)對大量樣品的多種成分進行篩選分析，主要用于核酸和蛋白質(zhì)檢測，如病原體檢測、核酸測定、細胞因子測定、腫瘤標記物測定等[19～22]?；谵r(nóng)獸藥的抗原及抗體，也已經(jīng)建立了農(nóng)獸藥殘留液相芯片技術(shù)檢測方法[23～26]。然而，同時檢測這3種瘦肉精的研究尚未見報道。本研究結(jié)合液相芯片技術(shù)的優(yōu)點，借鑒間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法的原理，以藻紅蛋白標記二抗為報告分子，實現(xiàn)對RAC、CL和SAL同時快速檢測， 也為其它獸藥殘留的檢測提供了新思路。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Luminex 200液相懸浮芯片系統(tǒng)（美國Luminex公司）；4625型孔板振蕩器；ST16R冷凍離心機（美國Thermo公司）；WP6122050抽濾裝置（美國Millipore公司）。

編號No.18、No.20和No.29的微球（美國Luminex公司）；鹽酸萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅、硫酸沙丁胺醇、西馬特羅、馬布特羅、鹽酸齊帕特羅等標準品購自德國Dr. Ehrenstofer公司；牛血清蛋白BSA（美國Sigma公司）；1.2 μm 96孔過濾板（美國Millipore公司）；RAC、CL和SAL的抗原及其單克隆抗體購自中檢維康公司； PE標記二抗購自上海繪辛公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純；豬肉購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

活化緩沖液：0.1 mol/L NaH2PO4Na2HPO4，pH 6.2。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）：138 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，8 mmol/L Na2HPO4， 1.5 mmol/L KH2PO4。洗滌緩沖液：PBS，0.05% Tween20，pH 7.4。分析緩沖液：PBS，1% BSA，pH 7.4。儲存緩沖液：PBS，0.1% BSA，0.02% Tween20，0.05%疊氮化鈉，pH 7.4。

2.2 實驗方法

2.2.1 實驗原理 Luminex微球用熒光染料進行編碼，通過調(diào)節(jié)兩種熒光染料的配比獲得100種不同特征光譜的微球[27]。首先將3種瘦肉精抗原分別共價交聯(lián)到3種微球表面。類似間接競爭法原理，以微球為固相載體，樣品中的獸藥分子、微球上的獸藥抗原競爭結(jié)合獸藥抗體，再用抽濾方式除去未結(jié)合物質(zhì)，結(jié)合上報告分子（PE熒光標記二抗）。懸浮芯片系統(tǒng)中有兩個激光發(fā)射器，紅色激光可以一次性激發(fā)熒光微球上的兩種熒光染料，熒光信號被兩個光電二極管所識別，根據(jù)熒光圖譜不同確定微球編號，進而確定微球上偶聯(lián)的探針，達到定性分析的目的；另一個激發(fā)報告分子，該熒光信號被光電倍增管識別，通過量化微球上結(jié)合的報告信號，即中位熒光強度值（Mean fluorescent intensity， MFI），實現(xiàn)定量分析，如圖1所示。

2.2.2 實驗步驟 （1）取出偶聯(lián)微球，恢復(fù)至室溫后漩渦30 s，超聲處理10 s。 （2）1.2 μm的96孔過濾板中加入100 μL PBS預(yù)濕實驗孔。抽去孔內(nèi)液體，每孔中加入適量預(yù)混好的偶聯(lián)微球（每種約2000個），用150 μL PBS洗滌兩次后。將適量標準品或樣品分別加入合適的孔中，空白孔加入等量PBS，再加入適量的各種抗體，用PBS補齊各孔至100 μL。 （3）用移液器反復(fù)抽吸混勻孔內(nèi)溶液，避光條件下37℃振蕩60 min。 （4）反應(yīng)完畢后，抽去孔內(nèi)液體，用150 μL PBS洗滌兩次。 （5）每孔中加入100 μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的PE標記二抗，移液器反復(fù)抽吸混勻。 （6）避光條件下， 37℃振蕩45 min后，抽去孔內(nèi)液體，用150 μL PBS洗滌兩次。 （7）加入100 μL PBS，重懸浮微球并混勻，置于液相芯片系統(tǒng)進行測試，每種微球讀取100個。

2.3 實驗條件優(yōu)化以及標準曲線的建立

2.3.1 最佳抗原加入量 參照Luminex公司提供的蛋白質(zhì)偶聯(lián)方法[23]并優(yōu)化： 取微球100 μL（1.25×106個/mL）置于EP管，14000 g離心5 min，棄上清液。加入活化緩沖液，振蕩和超聲各30 s， 重懸，再加入50 mg/mL NHS和EDC各50 μL， 混勻， 37℃振蕩20 min。離心棄上清液， 用PBS洗滌3次，加入150 μL PBS重懸，再加入抗原，用PBS補齊至500 μL，37℃振蕩6 h。離心棄上清液后，用1% BSA封閉，儲存緩沖液保存?？乖尤肓糠謩e為1， 2， 4， 8和10 ng。其中，微球No.18， No.20， No.29分別偶聯(lián)RAC抗原、CL抗原和SAL抗原。

2.3.2 最佳抗體加入量 按照2.2.2節(jié)方法，在不加樣品和標準品情況下，分別加入對應(yīng)抗體1， 5， 10， 20和40 ng，加入過量的PE標記二抗，采用液相芯片系統(tǒng)測試。

2.3.3 單一標準曲線建立 3種標準品按照一定比例稀釋成梯度液，采用液相芯片系統(tǒng)測試。按照ELISA所采用的抑制率計算方式（抑制率B =（A1-An）/A1，其中， A1為不加樣品孔MFI值； An為加標準品或者樣品孔MFI值），將各孔MFI值換算成抑制率，以抑制率為縱坐標，濃度的對數(shù)值為橫坐標，建立RAC， CL， SAL的單一標準曲線。

2.3.4 特異性識別實驗 參照文獻[28]的高通量檢測的特異性識別實驗方法，測試所制備的熒光微球表面的抗原是否能被各自的抗體特異性識別。按照2.2.2節(jié)實驗步驟，其中，1， 2， 3號孔分別加入偶聯(lián)抗原的微球No.18， No.20， No.29和對應(yīng)的最佳抗體加入量，4號孔加入3種偶聯(lián)抗原的微球和對應(yīng)的最佳抗體加入量。5， 6， 7號孔僅分別比1， 2， 3號孔多加入對應(yīng)的過量標準品，8號則比4號多加入過量的3種標準品。8個孔均加入適當(dāng)PE標記二抗反應(yīng)后，采用液相芯片系統(tǒng)測試。

2.3.5 多元標準曲線建立 將3種偶聯(lián)微球等數(shù)量混合后，按照2.2.2節(jié)，每孔加入偶聯(lián)好微球混合液（每種微球約2000個），再加入按照一定比例稀釋的3種標準品，采用液相芯片系統(tǒng)測試。

2.4 交叉反應(yīng)性

分別對RAC、CL、SAL、西馬特羅、馬布特羅和鹽酸齊帕特羅進行交叉反應(yīng)性測試，以結(jié)構(gòu)類似物濃度對數(shù)值為橫坐標，抑制率為縱坐標，建立標準曲線，計算IC50，按照交叉反應(yīng)率公式[29]（交叉反應(yīng)率為目標物IC50與結(jié)構(gòu)類似物IC50的百分比）計算結(jié)果。

2.5 加標回收實驗

參照文獻[30]的樣品前處理方法，在已知量的豬肉組織樣品中，加入標準品后充分絞碎；準確稱取2.0 g，加入6 mL乙腈0.1 mol/L HCl（84∶16， V/V）， 振蕩離心；用正己烷萃取3次后旋蒸至近干，用純水定容至1 mL。分別測試添加濃度為1， 5， 10和50 ng/g的RAC， CL和SAL單標和混標時的回收率。

3 結(jié)果與討論

3.1 抗原加入量優(yōu)化

如圖2所示，起初隨著抗原加入量增加，MFI值逐漸升高，這是因為微球表面上的位點越來越多地被抗原占據(jù)。隨后，隨著抗原加入量增加時，MFI值反而降低，這可能是由于微球表面結(jié)合過多抗原，形成空間位阻，不利于抗體的結(jié)合[23]。以MFI最高時的抗原量為最佳加入量，即SAL， CL， RAC分別為2， 4和4 μg。

3.2 抗體加入量優(yōu)化

如圖3所示，低濃度時，隨著抗體加入量增加，MFI值迅速升高?？贵w量增大一定值后， 3種抗體的

MFI值均趨于平穩(wěn)，此時獸藥抗原的位點已被全部占據(jù)[23]。選擇MFI的拐點為最佳抗體加入量，因為

此時靶標物和探針競爭結(jié)合獸藥抗體的競爭結(jié)果變化最顯著，同時考慮節(jié)省抗體，SAL， CL和RAC的

抗體加入量分別為10， 20和5 ng。

3.3 一元標準曲線建立

在最佳實驗條件下，建立了3種瘦肉精的一元標準曲線。在一定濃度范圍內(nèi)，抑制率與3種瘦肉精濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。 RAC（圖4A）的線性方程為y=0.2733x+0.1933，R2=0.9933，線性范圍0.5～500 ng/mL，IC10=0.456 ng/mL。CL（圖4B）的線性方程為y=0.1881x+0.2929，R2=0.9961，線性范圍0.1～100 ng/mL，IC10=0.094 ng/mL。SAL（圖4C）的線性方程為y=0.3376x+0.1302，R2=0.9943，線性范圍為1～500 ng/mL，IC10=0.814 ng/mL。3種獸藥的檢出限均低于1 ng/mL，表現(xiàn)出較高的靈敏度。

圖4 檢測萊克多巴胺（A）、 克倫特羅（B）和沙丁胺醇（C）的一元標準曲線

Fig.4 Standard curves for detection of RAC （A）， CL （B） and SAL （C）

3.4 特異性識別實驗

特異性識別實驗結(jié)果如圖5所示，利用軟件SPSS19的單樣本t檢驗方法對數(shù)據(jù)進行分析。4號孔的No.18， No.20， No.29的MFI分別與1， 2， 3號孔的MFI對比，p>0.05，無顯著性差異，說明各獸藥抗體均能特異性識別其對應(yīng)微球上的獸藥抗原，而與其它獸藥抗原無明顯交叉反應(yīng)。同樣， 8號孔與5， 6， 7號孔對比，p>0.05，無顯著性差異，說明在競爭條件下，獸藥仍能特異性識別對應(yīng)微球上的獸藥抗原，而不會干擾其它獸藥抗體與對應(yīng)微球上的獸藥微球結(jié)合。而4號孔與8號孔對比，p<0.05，差異性顯著，說明加入標準品后，標準品能與微球上的獸藥抗原顯著競爭獸藥抗體。以上結(jié)果表明，在混合體系中，3種抗體均能準確特異性識別各自的探針，各抗體與其它探針和標準品幾乎不結(jié)合，無明顯干擾，因此，可以實現(xiàn)RAC， CL和SAL的多元分析。

3.5 多元標準曲線建立

以抑制率為縱坐標，標準物濃度對數(shù)值為橫坐標，建立多元標準曲線，如圖6所示。3條曲線的參數(shù)如表1所示，R2﹥0.99，但略小于單一標準曲線，檢測范圍及檢出限均也均有細小差別。一方面，目

標物增加后，反應(yīng)體系變得更復(fù)雜，雖然3種目標物同時檢測時無明顯干擾，但微小的干擾仍難以避免。此外，3種物質(zhì)均為β2受體激動劑，結(jié)構(gòu)相似，存在極低的交叉反應(yīng)率，會影響檢測范圍及檢出限。與進出口標準中RAC， CL， SAL的檢出限（分別為0.5， 0.05和0.5μg/kg）相比[31]，本分析方法靈敏度高，檢測范圍更寬。

3.6 回收率

RAC， CL和SAL的添加濃度均為1， 5， 10和50 ng/g時，分別測試豬肉樣品中3種物質(zhì)的回收率，結(jié)果見表2和表3。可見對于單標和混標樣品，添加回收率均在80%～115%之間。

3.7 交叉反應(yīng)測試

分別對RAC、CL、SAL、西馬特羅、馬布特羅和鹽酸齊帕特羅進行測試，結(jié)果如表4所示，對所測的幾種結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均低于1.5%，表明本方法交叉反應(yīng)率低，特異性強，可用于RAC， CL， SAL多殘留檢測。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，本方法具有通量高、靈敏度高、特異性強、檢測速度快的優(yōu)點，實現(xiàn)了RAC， CL和SAL的多殘留分析，為研制多殘留檢測的商業(yè)化試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

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