快速檢測心型脂肪酸結(jié)合蛋白的熒光免疫微流體測試卡

孟凡達(dá) 霍衛(wèi)松 賀美琳 李昊 廉 潔 石西增 高云華

摘 要 研制出一種以時間分辨熒光微球作為標(biāo)記，自驅(qū)動快速檢測HFABP的熒光免疫微流體測試卡。利用激光切割法在雙面膠上簡便、快速地切割出所設(shè)計的微通道結(jié)構(gòu)，并采用激光切割法制作出聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）測試卡底板及上蓋。使用提拉涂膜的方法在PMMA底板表面修飾馬來酸酐官能團(tuán)，有效地解決了捕獲抗體在PMMA表面的固定問題。使用等離子體處理測試卡上蓋改善其親水性，使液體能夠在微通道內(nèi)自行流動。使用此測試卡可以實(shí)現(xiàn)對心型脂肪酸結(jié)合蛋白（HFABP）的快速檢測，線性檢測范圍為0.5～100 ng/mL，檢出限為0.1 ng/mL（S/N=3），檢測時間少于10 min，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<10%，批間RSD<15%。本方法具有靈敏度高、檢測時間短、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足臨床檢測的需求，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 心型脂肪酸結(jié)合蛋白； 檢測； 微流體； 時間分辨熒光

1 引 言

微流控技術(shù)的發(fā)展為蛋白的快速及其高通量的檢測提供了一個新的思路及平臺[1～6]，并且大大降低了檢測成本。與傳統(tǒng)的分析方法相比，微流體檢測具有高效、快速、試劑消耗少、自動化等優(yōu)點(diǎn)。目前，用于制作微通道的材料主要有單晶硅、無定形硅、玻璃、石英、高分子聚合物，如環(huán)氧樹脂、聚脲、聚氨、聚苯乙烯（PS）和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）以及聚二甲基硅氧烷（PDMS）等[7～10]。高分子聚合物相比于無機(jī)材料具有種類多、價格低廉、加工方法多種多樣以及容易實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)等優(yōu)勢，已成為制作微流體芯片的首選材料。其中PMMA因其出色的光學(xué)性能、良好的加工特性、生物親和性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于體外診斷領(lǐng)域[11]。但是PMMA仍舊存在著表面難以修飾蛋白、表面疏水性強(qiáng)、背景熒光相對較高等缺點(diǎn)，因而限制了其在微流體器件制作中的應(yīng)用。此外，簡單、高精度微通道的加工制作仍是微流體檢測技術(shù)的主要難點(diǎn)之一。

心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（Hearttype fatty acid binding protein，HFABP）是一種低分子量蛋白質(zhì)（相對分子量為15000）[12]，主要擔(dān)負(fù)結(jié)合脂肪酸并調(diào)節(jié)其細(xì)胞內(nèi)代謝的功能。作為心肌細(xì)胞質(zhì)特異性蛋白，HFABP能夠在心肌損傷的早期釋放入血液，因此可作為心肌損傷的一種新的標(biāo)志物，用于急性心肌梗塞（Acute myocardial infarction，AMI）的早期診斷。目前，HFABP的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、側(cè)向?qū)游龇ā⒚庖弑葷岱ǖ萚13～16]，但它們或存在著操作費(fèi)時繁瑣，或存在著靈敏度、準(zhǔn)確性差，或過分依賴于大型檢測儀器等缺點(diǎn)，從而限制了其在即時檢測（Pointcare of test，POCT）中的應(yīng)用。

時間分辨熒光免疫分析法（Timeresolved fluoroimmunoassay， TRFIA）是在傳統(tǒng)熒光免疫分析基礎(chǔ)上，利用稀土離子的螯合物作為標(biāo)記物的一種新型的非放射性免疫分析技術(shù)[17～19]。由于該螯合物的熒光具有長壽命的特點(diǎn)，利用時間分辨的方法可以有效地排除生物樣品中某些蛋白熒光以及基底材料背景熒光的干擾，從而大大地提高檢測的靈敏度。

本研究將微流體技術(shù)與TRFIA技術(shù)相結(jié)合，使用激光打印技術(shù)切割PMMA，并且在雙面膠上快速打印出所需要的微通道，使用等離子技術(shù)改善PMMA的表面性質(zhì)，制作出一種易組裝的自驅(qū)動測試卡，實(shí)現(xiàn)了對血清中HFABP的一步法快速檢測。本方法在靈敏度、準(zhǔn)確度、檢測范圍等方面均能夠滿足臨床需求，并且具有制作簡易、操作簡便等特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

EnSpire多模式微孔板分析儀（德國PerkinElmer公司）；3K15冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；Laser Systems激光切割機(jī)（美國Universal公司）；GeSim NanoPlotter超微量點(diǎn)樣儀（德國GeSim公司）；高聚合度有機(jī)玻璃板PMMA（1 mm，深圳市鴻年金屬材料有限公司）；3M雙面膠（100 μm，深圳市凱誠興科技有限公司）；鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

HFABP抗原標(biāo)準(zhǔn)品，捕獲抗體FA03和標(biāo)記抗體FA01為兩種不同的抗HFABP單克隆抗體，均購自芬蘭Hytest公司；羧基修飾Eu時間分辨熒光微球（200 nm，上海微測生物科技有限公司）；小牛血清、吐溫20（北京欣經(jīng)科生物科技有限公司）；聚苯乙烯（PS）接枝馬來酸酐、甲苯（北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司）；健康人血清（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院贈予）；1（3二甲氨基丙基）3乙基碳二亞胺（EDC）、硼酸、硼砂、NaCl、無水碳酸鈉、NaHCO3（美國SigmaAldrich公司）；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（EASY pure LF，美國Barnstead公司）。

2.2 時間分辨熒光測試卡檢測原理及組裝

測試卡檢測HFABP的原理是基于一步夾心免疫檢測法，設(shè)計原理如圖1A所示。在微通道檢測區(qū)內(nèi)包被捕獲抗體，在微通道的入口處儲存標(biāo)記抗體修飾的時間分辨熒光微球，當(dāng)血液樣品加入時，血液樣品內(nèi)抗原與標(biāo)記抗體修飾的熒光微球（簡稱標(biāo)記抗體微球）結(jié)合形成復(fù)合物，在流過微通道檢測區(qū)時與固定在微通道內(nèi)的捕獲抗體結(jié)合形成捕獲抗體抗原標(biāo)記抗體微球的免疫復(fù)合物，最終的時間分辨熒光微球的固定量與抗原的濃度呈正相關(guān)，通過測試檢測區(qū)熒光強(qiáng)度從而實(shí)現(xiàn)對檢測靶標(biāo)的定量。

時間分辨熒光測試卡由底板、雙面膠微通道、上蓋3部分組成，組成的測試卡可分為加樣區(qū)、標(biāo)記抗體儲存區(qū)、時間閥1，檢測區(qū)、時間閥2、廢液區(qū)等幾個結(jié)構(gòu)。首先使用激光切割機(jī)在雙面膠上切割出微通道的基本結(jié)構(gòu)，將雙面膠粘貼到用激光切割機(jī)切割的表面預(yù)修飾的PMMA底板上后，在粘貼好雙面膠微通道的PMMA底板的相應(yīng)位置使用點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣包被捕獲抗體，在標(biāo)記抗體儲存區(qū)使用移液槍滴加一定量的標(biāo)記抗體微球溶液于37℃烘干，最后將等離子體處理的表面親水性的上蓋粘貼到底板上，完成檢測卡的組裝，如圖1B所示。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 緩沖溶液、稀釋液等溶液的配制 （1）硼酸緩沖液的配制 稱取硼酸4.02 g，硼砂3.34 g，NaCl 0.95 g，用超純水溶解，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 8.20，定容至500 mL。（2）標(biāo)記抗體微球稀釋液的配制 稱取蔗糖2 g，牛血清白蛋白（BSA）0.20 g，吐溫20 100 μL，使用pH 8.20硼酸緩沖液溶解并稀釋至10 mL。（3）碳酸鹽緩沖液的配制 稱取1.59 g無水Na2CO3、2.93 g NaHCO3，用超純水溶解，使用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 9.60，定容至1000 mL。（4）捕獲抗體點(diǎn)樣緩沖液的配制 稱取海藻糖1 g，用pH 9.60碳酸鹽緩沖液溶解定容至10 mL。（5）HFABP標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 用小牛血清將HFABP標(biāo)準(zhǔn)品配制成所需濃度待用。（6）HFABP實(shí)際血清溶液的配制 在混合健康人血清中添加一定量的HFABP抗原，配制成一定濃度梯度的血清溶液。

2.3.2 標(biāo)記抗體熒光微球的制備 取100 μL微球，用pH 8.20硼酸緩沖溶液稀釋至500 μL；加入10 mg/mL EDC，室溫振蕩活化15 min； 10000 r/min離心，移去上清液，硼酸緩沖液重懸微球至500 μL；加入100 μg FABP抗體FA01，4℃振蕩反應(yīng)12 h；加入50 μL含10% BSA的硼酸緩沖液，振蕩反應(yīng)2 h；10000 r/min離心，移去上清液，以含有0.1% BSA硼酸緩沖液重懸復(fù)溶微球，4℃儲存。

2.3.3 捕獲抗體的固定

PMMA底板表面不能穩(wěn)定有效的固定捕獲抗體，本研究采用提拉法涂膜的方法對底板進(jìn)行表面修飾：將測試卡底板浸入一定濃度的PS接枝馬來酸酐甲苯溶液中后緩慢提出，置于通風(fēng)櫥中晾干。用GeSim NanoPlotter超微量點(diǎn)樣儀在測試卡底板指定位置點(diǎn)上捕獲抗體，在濕度為70%的環(huán)境中37℃溫育10 min后，組裝測試卡。

2.3.4 免疫分析過程 向測試卡加樣區(qū)中滴加80 μL血清樣品，樣品由于毛細(xì)作用進(jìn)入微通道，首先將干燥儲存在微通道前端的標(biāo)記抗體微球復(fù)溶，樣品中的抗原與標(biāo)記抗體微球形成抗原標(biāo)記抗體微球復(fù)合物；樣品在微通道內(nèi)繼續(xù)向前流動，流經(jīng)檢測區(qū)時，抗原標(biāo)記抗體微球復(fù)合物與捕獲抗體反應(yīng)形成捕獲抗體抗原標(biāo)記抗體微球的免疫復(fù)合物固定在檢測區(qū)，待樣品最終全部流入廢液區(qū)后，使用多模式微孔板分析儀對測試卡檢測區(qū)位置熒光強(qiáng)度進(jìn)行測試。整個檢測過程在10 min內(nèi)完成。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測條件的選擇

時間分辨熒光微球的激發(fā)光譜和不同延遲時間的發(fā)射光譜如圖2A所示，微球的最大激發(fā)波長為340 nm，最大發(fā)射波長為615 nm。因此在實(shí)驗(yàn)中設(shè)定激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為340和615 nm；延遲一定時間檢測，熒光微球仍然具有較強(qiáng)的熒光信號，說明微球可以用于時間分辨檢測。

評估了延遲時間檢測對背景噪音的影響。圖2B和圖2C為微通道中充滿人血清的空白測試卡的檢測區(qū)在340 nm激發(fā)時，不同延遲時間下的發(fā)射光譜。結(jié)果顯示，當(dāng)延遲時間為0 μs時，在檢測波長615 nm處熒光值較高，說明測試卡本身及血清帶來的背景熒光值相對較高；當(dāng)延遲時間達(dá)到600 μs時，背景熒光對檢測帶來的影響很小，所以實(shí)驗(yàn)采用延遲時間600 μs作為最終檢測條件。

3.2 表面修飾條件選擇

3.2.1 捕獲抗體的固定方法選擇 本研究采用提拉法涂膜的方法，在PMMA表面涂鍍上一層PS接枝馬來酸酐薄膜，有效地解決了捕獲抗體在PMMA表面的固定。圖3A為PS接枝馬來酸酐的紅外光譜圖，可以明顯的看出其在1860 cm

Symbolm@@ 1處的酸酐的吸收峰；圖3B為PMMA表面修飾前后對捕獲抗體固定能力對比圖，結(jié)果表明，修飾后的PMMA表面固定捕獲抗體能力有了極大提高，從而提高了檢測靈敏度。

圖3 PS接枝馬來酸酐紅外吸收光譜圖（A）和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）修飾前后抗體固定能力對比圖（B）

Fig.3 Infrared （IR） spectrum of poly stylene （PS） grafted maleic anhydride （A） and antibody immobilizing ability of different polymethyl methacrylate （PMMA） surface （B）

3.2.2 表面修飾溶液濃度的優(yōu)化 分別使用0， 0.5， 1.0， 1.5， 2.0和2.5%（w/V）的PS接枝馬來酸酐的甲苯溶液在高聚合度PMMA表面采用提拉法涂膜，由于高聚合度的PMMA難溶于冷的甲苯溶液，所以采用提拉法可以在其表面涂鍍，形成一層均勻的PS接枝馬來酸酐的薄膜。在薄膜表面固定100 μg/mL HFABP捕獲抗體，分別用含有0， 7和50 ng/mL HFABP的小牛血清溶液進(jìn)行一步法夾心免疫反應(yīng)，評估薄膜固定抗體的性能。如圖4A所示，當(dāng)PS接枝馬來酸酐的濃度達(dá)到1.0%以上時，熒光強(qiáng)度不再隨濃度的增加而增加，說明捕獲抗體固定量達(dá)到飽和值。為保證足夠的蛋白固定量，本實(shí)驗(yàn)采用2.0% PS接枝馬來酸酐溶液作為涂膜溶液。

3.2.3 表面固定捕獲抗體條件的選擇 由于馬來酸酐暴露在空氣中容易吸收水分水解，降低表面固定抗體的能力，因此，制備好的PS接枝馬來酸酐薄膜應(yīng)當(dāng)在干燥條件下使用，或置于干燥條件下儲存?zhèn)溆??？疾炝诵揎桺S接枝馬來酸酐薄膜的測試卡底板在恒溫恒濕箱中不同濕度下放置一定時間對表面固定捕獲抗體能力的影響，如圖4B所示。當(dāng)HFABP濃度為10 ng/mL時，隨著放置時間的延長以及濕度增加，薄膜表面固定蛋白的能力大幅下降。但是，薄膜在相對濕度10%條件下放置2天，表面固定抗體的能力基本穩(wěn)定。為保證薄膜表面固定抗體量的一致性，本實(shí)驗(yàn)在底板修飾后在10%濕度條件下1天內(nèi)完成捕獲抗體的固定。

接枝馬來酸酐濃度對檢測結(jié)果的影響（A）和不同濕度放置一定時間后表面固定蛋白能力的變化（B）

Fig.4 （A） Effect of PS grafted maleic anhydride concentration on detection and （B） change of antibody immobilizing ability of PS grafted maleic anhydride surface under different relative humidity

3.2.4 捕獲抗體點(diǎn)樣濃度的選擇 在HFABP濃度為0， 7和50 ng/mL的條件下，考察捕獲抗體點(diǎn)樣濃度對免疫反應(yīng)的影響。如圖5A所示，當(dāng)捕獲抗體濃度達(dá)到50 μg/mL時，檢測的熒光信號值不再隨抗體濃度的增加而增加，說明在測試卡表面捕獲抗體的量達(dá)到飽和。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，確定捕獲抗體的點(diǎn)樣濃度為100 μg/mL。

3.2.5 捕獲抗體穩(wěn)定性研究 包被在底板上的捕獲抗體的穩(wěn)定性會影響測試卡檢測樣品的精密度及準(zhǔn)確性?？疾炝藴y試卡在37℃放置一定時間對捕獲抗體免疫反應(yīng)性能的影響，其中HFABP的濃度為10 ng/mL。如圖5B所示，在37℃放置6天后，捕獲抗體仍能保持很高的反應(yīng)活性。

3.2.6 其它條件的確定 由于微通道檢測區(qū)的體積僅為4.5 μL， 相對來說，80 μL的樣品量足夠大，相當(dāng)于有一部分樣品充當(dāng)了清洗液的作用，因此反應(yīng)不需要額外的沖洗步驟。此外，由于免疫反應(yīng)時間較短，而且相對于抗原來說血液樣品內(nèi)的其它蛋白的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗原的含量，微球在非反應(yīng)區(qū)吸附量極低，非反應(yīng)區(qū)的非特異性吸附帶來的背景信號很低，所以實(shí)驗(yàn)中未對微通道表面進(jìn)行封閉。

3.3 方法的分析特性

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在最佳的檢測條件下，熒光強(qiáng)度與HFABP濃度在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=11823x+24725（n=4），如圖6A所示，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9966，檢出限為0.1 ng/mL（S/N=3）。

3.3.2 特異性 當(dāng)HFABP濃度為10 ng/mL時，在小牛血清中添加臨床上常與HFABP同檢的心臟標(biāo)志物檢測抗原10 μg/mL C反應(yīng)蛋白（CRP）和50 ng/mL 人心肌肌鈣蛋白T（cTnT），從圖6B可見，加入其它抗原，對HFABP的檢測沒有顯著影響，檢測信號變化小于5%，說明此檢測方法的特異性良好。

圖6 HFABP檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線（A）和檢測卡的檢測特異性（B）

Fig.6 Standard curve for hearttype fatty acid binding protein （HFABP） detection（A）and specificity of test card（B）

3.3.3 回收率和精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)加入法考察了測試卡在HFABP的Cutoff值（7 ng/mL）及其臨近濃度的批內(nèi)及批間精密度（RSD）。如表1所示，平均回收率為97.3%～102.1%，批內(nèi)RSD小于10%，批間RSD小于15%，說明此方法檢測HFABP具有良好的精密度和重現(xiàn)性。

3.4 實(shí)際人血清添加法測試對比研究

將30人份的健康人血清混合，使用制作的微流體時間分辨熒光測試卡測定，其中HFABP的含量

為1.88 ng/mL。分別在其中添加0.5， 1.0， 5.0， 10， 20， 40， 60， 80和100 ng/mL的HFABP標(biāo)準(zhǔn)品，熒光測試卡測試（每個濃度至少測試4次）。將測得濃度與實(shí)際添加濃度進(jìn)行相關(guān)分析，

圖7 實(shí)際血清添加值與測試值結(jié)果相關(guān)性

Fig.7 Correlation of added concentration and measured results

如圖7所示，兩者的相關(guān)系數(shù)R2=0.99。平均回收率大于90%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，說明本方法具有良好的實(shí)際應(yīng)用能力。

4 結(jié) 論

以時間分辨熒光微球作為標(biāo)記，制作了快速檢測HFABP的熒光免疫微流體測試卡。對HFABP的檢測范圍和檢出限和均可達(dá)到臨床檢測要求，具有簡便、快速的特點(diǎn)。本方法適用于大多數(shù)蛋白的檢測。此外，本測試卡還可以拓展到多靶標(biāo)的高通量檢測，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

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