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    基于智能手機(jī)的紙微流控電化學(xué)農(nóng)藥檢測(cè)芯片的研究

    2016-11-19 19:17:21楊文韜張琳劉宏顧忠澤
    分析化學(xué) 2016年4期
    關(guān)鍵詞:智能手機(jī)

    楊文韜 張琳 劉宏 顧忠澤

    摘 要 紙質(zhì)微流控裝置的出現(xiàn)為低成本化學(xué)分析提供了一種簡(jiǎn)單而實(shí)用的平臺(tái)。本研究開(kāi)發(fā)了一種基于濃差電池原理的新型電化學(xué)檢測(cè)紙質(zhì)芯片,通過(guò)智能手機(jī)的輔助實(shí)現(xiàn)了農(nóng)藥的檢測(cè)。檢測(cè)芯片由色譜紙噴蠟打印制作而成。加入樣品與芯片上的預(yù)加試劑反應(yīng)5 min,然后將絲網(wǎng)印刷的電極層置于芯片上,利用模具的重力作用使電極層與紙芯片的兩極緊密接觸,再通過(guò)智能手機(jī)的USB讀取裝置獲取芯片的電位,并由電位農(nóng)藥濃度關(guān)系得到檢測(cè)結(jié)果。使用此芯片實(shí)現(xiàn)了農(nóng)藥敵百蟲(chóng)(三氯磷酸酯)的快速、簡(jiǎn)便、可自供電的電化學(xué)定量檢測(cè),檢出限為0.89 μmol/L。

    關(guān)鍵詞 智能手機(jī); 濃差電池; 紙微流控芯片; 乙酰膽堿酯酶; 農(nóng)藥檢測(cè)

    1 引 言

    作為一種新型檢測(cè)手段,基于智能手機(jī)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)近年來(lái)引起了廣泛關(guān)注。2008年,Martinez等以智能手機(jī)作為檢測(cè)平臺(tái),通過(guò)手機(jī)檢測(cè)色彩強(qiáng)度,并以彩信(MMS)或電子郵件的方式將圖片上傳,進(jìn)行深度比色檢測(cè)分析[1]。目前,已有越來(lái)越多的檢測(cè)技術(shù)與智能手機(jī)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè),如通過(guò)手機(jī)攝像頭檢測(cè)沙門(mén)氏菌的核酸[2]和酶標(biāo)記物[3], 通過(guò)拍攝熒光和明場(chǎng)照片來(lái)進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)[4]。電化學(xué)阻抗譜法也應(yīng)用到了基于智能手機(jī)的檢測(cè)中,檢測(cè)信號(hào)可通過(guò)藍(lán)牙的方式傳輸至智能手機(jī)[5]。上述方法大都使用手機(jī)的照相功能,圖像的標(biāo)準(zhǔn)化處理成為檢測(cè)的難點(diǎn)[6]。相比較而言,電化學(xué)檢測(cè)同時(shí)具有成本低、靈敏度高、可定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。但是,電化學(xué)檢測(cè)需要特定的電極[7]、穩(wěn)定的電源和專業(yè)的檢測(cè)儀器,限制了它在快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的應(yīng)用[8~12]。

    為解決上述問(wèn)題,本研究提出了一種基于濃差電池原理的電化學(xué)檢測(cè)技術(shù),并結(jié)合紙基微流控芯片實(shí)現(xiàn)了有機(jī)磷農(nóng)藥敵百蟲(chóng)(三氯磷酸酯)的快速定量檢測(cè)。此檢測(cè)方案與現(xiàn)有的檢測(cè)手段相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。首先,此芯片不需要傳統(tǒng)電化學(xué)檢測(cè)所需的Ag/AgCl參比電極,僅需要絲網(wǎng)印刷的石墨電極,簡(jiǎn)化了電極制作過(guò)程,降低了成本;其次,與之前所報(bào)導(dǎo)過(guò)的電流法檢測(cè)技術(shù)[13]不同,本研究采用電位法檢測(cè),檢測(cè)設(shè)備得以簡(jiǎn)化,只需要一個(gè)手機(jī)USB的電位讀取裝置,即可進(jìn)行定量檢測(cè);第三,此方法耗能較少,由手機(jī)USB直接供電,無(wú)需外部穩(wěn)壓電源;此外,此芯片采用3D打印模具,解決了紙芯片和電極之間的接觸穩(wěn)定性問(wèn)題,提高了檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    8570N噴蠟打印機(jī)(美國(guó)Fuji Xerox公司);Form1光固化型3D打印機(jī)(美國(guó)Formlabs公司)?;谥悄苁謾C(jī)USB接口的電位檢測(cè)器為本實(shí)驗(yàn)室自制。1級(jí)色譜紙(英國(guó)Whatman公司);導(dǎo)電銀膠(美國(guó)Alfa Aesar公司);PP2910透明膠片(美國(guó)3M公司)。

    K3Fe(CN)6、K2Fe(CN)6、氯化硫代乙酰膽堿(ATCh)、乙酰膽堿酯酶(AChE,來(lái)自電鰻)、三氯磷酸酯(敵百蟲(chóng))、磷酸鹽緩沖鹽(pH 7.4)均購(gòu)于SigmaAldrich公司,未經(jīng)純化直接使用;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

    2.2 微流控芯片的總體設(shè)計(jì)

    芯片包含兩個(gè)部分。第一部分是表面噴蠟打印了圖案的色譜紙。從進(jìn)樣口分出兩個(gè)逐漸分離的通道形成濃差電池的兩極,其末端通過(guò)一條很窄的通道相連,起到鹽橋作用。第二部分是3D打印的外殼,可拆分成兩部,如圖1所示。底端部分有凹槽結(jié)構(gòu)和支架以固定和支撐紙張,上端部分類(lèi)似印章的用途,通過(guò)重力作用使電極緊貼濃差電池的兩極,可獲取電壓信號(hào)。

    圖1 使用智能手機(jī)實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥檢測(cè)的過(guò)程示意圖(a)試劑預(yù)加載在噴蠟打印過(guò)的紙芯片上,

    (b)芯片放置在3D打印的外殼中由進(jìn)樣口滴加樣品,(c)合上裝置的蓋子,開(kāi)始檢測(cè)。(d)芯片與檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)物圖

    2.3 3D打印外殼

    使用軟件SolidWorks設(shè)計(jì)外殼,將零件文件轉(zhuǎn)變?yōu)镾TL格式,由3D打印機(jī)使用光固化樹(shù)脂材料打印出外殼。打印完成后,再將其浸入異丙醇中,直至完全凝固。為了使外殼更加堅(jiān)固,可以在紫外光下照射10 s。

    2.4 紙芯片和電極層的制作

    使用軟件CorelDraw 12設(shè)計(jì)紙芯片的圖案,將疏水的部分用100%黑色表示,吸水通道用白色表示。使用富士施樂(lè)噴蠟打印機(jī)在色譜紙上打印出該圖案。完成打印后,將色譜紙放置在125℃的熱臺(tái)上加熱1 min,使表面蠟層滲透到紙內(nèi)。

    參照文獻(xiàn)[14]的方法,在透明膠片上制作絲網(wǎng)印刷石墨電極,室溫下干燥,在電極末端通過(guò)導(dǎo)電銀膠連接兩根銅導(dǎo)線,以連接電壓檢測(cè)裝置,導(dǎo)線和石墨電極的導(dǎo)電銀膠連接處用丙烯酸AB膠進(jìn)行固定。

    2.5 試劑配比

    配制100 mmol/L K3Fe(CN)6與40 mmol/L氯化硫代乙酰膽堿的混合溶液以及52 U/mL乙酰膽堿酯酶溶液。如圖1a所示,在通道兩側(cè)分別滴加0.30 μL混合試劑,在其中一側(cè)滴加0.30 μL 乙酰膽堿酯酶溶液,然后在室溫下充分干燥,待用。

    2.6 基于智能手機(jī)的檢測(cè)

    檢測(cè)時(shí),首先將芯片放置在3D打印的支架外殼上,由進(jìn)樣口添加待測(cè)樣品進(jìn)行反應(yīng)。5 min后,將電極層置于芯片上方,石墨電極末端對(duì)準(zhǔn)芯片上電池的兩極,然后蓋上打印的“印章”模具,通過(guò)重力使電極層與紙上濃差電池的兩極相接觸以獲取電壓信號(hào)(圖1b)。信號(hào)通過(guò)銅導(dǎo)線傳輸至檢測(cè)裝置,檢測(cè)裝置內(nèi)部包括差分放大器、濾波器、AD轉(zhuǎn)換、USB控制傳輸?shù)葞讉€(gè)重要模塊,可以采樣輸入端的電壓信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)并以USB方式傳輸至智能手機(jī)。手機(jī)上安裝了配套的檢測(cè)軟件,以接收和處理檢測(cè)裝置的數(shù)據(jù),并將結(jié)果顯示在屏幕上(圖1c)[15]。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 檢測(cè)原理

    樣品由進(jìn)樣口加入后,分別進(jìn)入兩邊的反應(yīng)通道,僅在一條通道中預(yù)加了乙酰膽堿酯酶。乙酰膽堿酯酶可催化氯化硫代乙酰膽堿的水解反應(yīng),三氯磷酸酯農(nóng)藥可以抑制其催化活性。而氯化硫代乙酰膽堿的水解產(chǎn)物硫代膽堿(Thiocholine)具有還原性,可以將溶液中[Fe(CN)6]3

    Symbolm@@ 還原為[Fe(CN)6]4

    Symbolm@@ 。反應(yīng)一段時(shí)間后,兩條通道內(nèi)有不同濃度的[Fe(CN)6]3

    Symbolm@@ 和[ Fe(CN)6]4

    Symbolm@@ 離子,并由“鹽橋”連接,形成濃差電池。該電池的電壓與[Fe(CN)6]3

    Symbolm@@ 和[ Fe(CN)6]4

    Symbolm@@ 離子的濃度比相關(guān),因此與乙酰膽堿酯酶的活性以及樣品中農(nóng)藥濃度相關(guān)。

    圖2 在K3[Fe(CN)6]與K4[Fe(CN)6]不同的濃度比例時(shí)芯片的電極電位(E)。電解質(zhì)溶液為0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4),含有不同濃度比例的K3[Fe(CN)6]與K4[Fe(CN)6]。圖中直線為能斯特公式計(jì)算出的電極電位與濃度比例的關(guān)系。插圖為不同檢測(cè)過(guò)程中電壓(E)隨時(shí)間(t)變化的關(guān)系曲線。

    Fig.2 Influence of concentration ratio of[ Fe(CN)6]3

    Symbolm@@ to[ Fe(CN)6]4

    Symbolm@@ on electrode potential. Electrolyte solution is 0.01 mol/L phosphate buffered saline (pH 7.4) containing[ Fe(CN)6]3

    Symbolm@@ and[ Fe(CN)6]4

    Symbolm@@ at different concentration ratio. The straight line represents potential calculated using Nernst equation as a function of concentration ratio. Inset: potential as a function of time measured in different electrolyte solutions.

    3.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

    濃差電池的電位取決于氧化還原電對(duì)的濃度差,在已知氧化還原電對(duì)的濃度前提下可以通過(guò)能斯特公式計(jì)算出電極電位。首先在芯片上的一條通道中預(yù)加入0.30 μL含有100 mmol/L K3Fe(CN)6和100 mmol/L K4Fe(CN)6的磷酸鹽緩沖液(0.010 mmol/L,pH 7.4)溶液;在另一側(cè)同樣加入該混合溶液,K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6的濃度分為5組:1和100 mmol/L,10和100 mmol/L,100和100 mmol/L,100和10 mmol/L,100和1 mmol/L,即兩者的濃度比值為0.01, 0.1, 1, 10, 100。試劑避光充分干燥后,加入磷酸鹽緩沖液,使用智能手機(jī)檢測(cè)紙芯片的電極電位。如圖2所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與能斯特方程的計(jì)算結(jié)果基本相符。

    對(duì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的3個(gè)主要參數(shù),即底物(氯化乙酰硫代膽堿)、電活性物質(zhì)(K3Fe(CN)6)和酶(乙酰膽堿酯酶)的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)電活性物質(zhì)和酶的濃度足夠高時(shí),酶的催化反應(yīng)受到底物濃度的影響[16]。如圖3A所示,維持電活性物質(zhì)濃度為200 mmol/L,酶的濃度為52 U/mL時(shí),測(cè)定電位隨著底物濃度的增加而增大,在底物濃度為40 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值64 mV。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中底物濃度確定為40 mmol/L。

    如圖3B所示,K3[Fe(CN)6]對(duì)電位的影響趨勢(shì)與底物濃度相似,但是電極電位對(duì)K3Fe(CN)6濃度的變化更加敏感。此外,當(dāng)K3[Fe(CN)6]的濃度超過(guò)100 mmol/L時(shí),電極電位開(kāi)始下降。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中K3[Fe(CN)6]濃度選擇為100 mmol/L。

    確定了最適的底物濃度和電活性物質(zhì)濃度后,考察了乙酰膽堿酯酶濃度對(duì)電壓的影響。如圖3C所示,初期的電極電位隨著酶濃度的增加而增大,在52 U/mL時(shí)電位達(dá)到最大值68 mV;酶濃度繼續(xù)升高,電位略降。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中酶濃度選擇為52 U/mL。

    圖3 (A)底物濃度對(duì)檢測(cè)電位的影響。200 mmol/L K3Fe(CN)6,52 U/mL乙酰膽堿酯酶以及不同濃度的氯化乙酰硫代膽堿(a, 80; b, 40; c, 20; d, 10; e, 5; f, 2.5 mmol/L); (B)電活性物質(zhì)濃度對(duì)檢測(cè)電位的影響。40 mmol/L氯化乙酰硫代膽堿,52 U/mL乙酰膽堿酯酶以及不同濃度的K3Fe(CN)6 (a, 100; b, 200; c, 50; d, 25; e, 12.5 mmol/L) ; (C)酶濃度對(duì)檢測(cè)電位的影響。200 mmol/L K3Fe(CN)6, 40 mmol/L氯化乙酰硫代膽堿以及不同濃度的乙酰膽堿酯酶(a, 69; b, 52; c, 26; d, 13; e, 6.5; f, 3.2 U/mL)。插圖為檢測(cè)過(guò)程中電壓隨時(shí)間變化的曲線, 電解質(zhì)溶液為0.01 mol/L的磷酸緩沖鹽(pH 7.4)。

    3.3 對(duì)農(nóng)藥的檢測(cè)性能

    使用乙酰膽堿酯酶等檢測(cè)農(nóng)藥含量的方法已有文獻(xiàn)報(bào)道[17,18],其基本原理是乙酰膽堿酯酶可催化水解硫代乙酰膽堿生成具有電活性的硫代膽堿,而有機(jī)磷農(nóng)藥抑制乙酰膽堿酯酶的活性,使生成的硫代膽堿量減少,通過(guò)恒電位儀檢測(cè)硫代膽堿,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)藥的檢測(cè);或利用光學(xué)檢測(cè)法,檢測(cè)酶催化產(chǎn)物對(duì)紫外可見(jiàn)光的吸收,實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥的檢測(cè)。與文獻(xiàn)方法不同,本研究提出了基于智能手機(jī)和電化學(xué)紙芯片定量檢測(cè)農(nóng)藥三氯磷酸酯的方法,如圖4所示。采用本法測(cè)定三氯磷酸酯農(nóng)藥,測(cè)得的電極電位與三氯磷酸酯農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R=0.98,線性檢測(cè)范圍為1.6~400.0 μmol/L,檢出限為0.89 μmol/L(S/N=3)。本方法具有簡(jiǎn)單、快速、成本低的特點(diǎn)。

    電化學(xué)體系中參比電極多為Ag /AgCl電極,不利于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[19]。為了解決這一問(wèn)題,本研究構(gòu)建了基于濃差電池的檢測(cè)體系,所使用的絲網(wǎng)印刷石墨電極無(wú)需額外的處理即可滿足使用要求。本傳感器工作時(shí)采用智能手機(jī)供電,無(wú)需額外的外部電源,適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。與常見(jiàn)的分層結(jié)構(gòu)的紙質(zhì)微流控芯片不同, 本方法中芯片固定在3D打印外殼結(jié)構(gòu)中,確保溶液在紙上的流動(dòng)免受其它層的影響,而在檢測(cè)電極電位時(shí),利用3D打印印章的重力使電極與芯片接觸,保證了檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性。本方法中的絲網(wǎng)印刷電極可以重復(fù)使用[20]。此外,芯片裝置制造過(guò)程不需要熱處理,因而避免了試劑失活等問(wèn)題。

    4 結(jié) 論

    基于濃差電池原理的電位檢測(cè)法,采用3D打印的外殼裝置,通過(guò)智能手機(jī)輔助實(shí)現(xiàn)了對(duì)三氯磷酸酯農(nóng)藥的快速定量檢測(cè),檢出限達(dá)到0.89 μmol/L。裝置制備過(guò)程簡(jiǎn)單且成本低廉,有望應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè),以滿足資源有限的偏遠(yuǎn)地區(qū)的檢測(cè)需求,具有良好的應(yīng)用前景。

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    Smartphonebased Paper Microfluidic Device for

    Potentiometric Detection of Pesticide

    YANG WenTao, ZHANG Lin, LIU Hong*, GU ZhongZe

    (State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science and Medical Engineering,

    Southeast University, Nanjing 210096, China)

    Abstract The paperbased microfluidic devices have emerged as simple yet powerful platforms for performing lowcost analytical tests. A novel paperbased microfluidic chip for potentiometric detection using the principle of concentration cell was developed and examined for smartphonebased pesticide detection. Paperbased device was fabricated via wax printing and preloaded with reagents. After sample introduction and reaction for 5 minutes, screenprinted electrodes were attached and assembled into a 3Dprinted holder for the potentiometric measurement using the smartphonebased reader. For the proofofconcept, a pesticide (trichlorfon) was quantitatively detected with a limit of detection of 0.89 μmol/L.

    Keywords Smartphone; Concentration cell; Paperbased microfluidic chip; Acetylcholinesterase; Pesticide detection

    (Received 27 February 2016; accepted 3 March 2016)

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 21405014) and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, China (No. BK20140619)

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