米糠酶法制備葡萄糖的工藝研究

陳建 夏陳 朱永清 張盈嬌 鄧俊琳 栢鳳女

摘要 以新鮮米糠為原料，脫脂脫蛋白后，經(jīng)單因素試驗摸索酶催化米糠粕中淀粉的液化和糖化工藝條件。得到最佳液化條件為：每1 g物料用α-淀粉酶60 u，水8倍重量于物料，于pH值6.3，加0.2% CaCl2，在90 ℃液化反應(yīng)120 min后得麥芽糖糊精；最佳糖化條件為：pH 值4.5，糖化酶用量400 u/g，溫度60 ℃，時間24 h。按照最佳液化和糖化工藝條件，比較了以新鮮米糠、脫脂米糠、脫蛋白米糠和脫脂脫蛋白米糠為原料制備葡萄糖，結(jié)果以脫脂脫蛋白米糠為原料制備的葡萄糖結(jié)晶粉末質(zhì)量最好，純度高于99%。

關(guān)鍵詞 米糠；酶法；液化；糖化；葡萄糖

中圖分類號 TS245 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）04-0284-03

Process Research of Enzymatic Preparation of Glucose From Rice Bran

CHEN Jian XIA Chen ZHU Yong-qing ZHANG Ying-jiao DENG Jun-lin BAI Feng-nv

（Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu Sichuan 610066）

Abstract In this paper，fresh rice bran was de-fatted and de-proteinized to get residue solid.Then single-factor method was used to study the liquefaction and saccharification process of enzymatic hydrolysis of starch in the residue solid.The results showed that the best liquefaction conditions was as following：α-amylase 60 u per gram material，8 times water by weight，pH value 6.3，0.2% CaCl2 by weight，and at temperature 90 ℃ for 120 minutes.The best saccharification conditions was as following：pH value 4.5，glucoamylase 400 u/g，and at temperature 60 ℃ for 24 hours.With the best liquefaction and saccharification conditions，using fresh rice bran，de-fatted rice bran，de-proteinized rice bran，and de-fatted de-proteinized rice bran as starting materials respectively，comparison reactions to prepare glucose had been conducted.The results showed that the quality of glucose crystalline powder was the best（> 99% purity）to use de-fatted de-proteinized rice bran as material.

Key words rice bran；enzyme process；liquefaction；saccharification；glucose

葡萄糖（圖1）廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品、微生物發(fā)酵及皮革等行業(yè)[1]。目前國內(nèi)結(jié)晶葡萄糖產(chǎn)量大約為100萬t，需求量可達200萬t，并且以每年15%的速度遞增[2]。葡萄糖的制備在國內(nèi)外主要以玉米為原料，玉米是我國四大主糧之一，用玉米制造葡萄糖要消耗大量主糧資源，而且起源于玉米的葡萄糖產(chǎn)品會導(dǎo)致敏感人群食用過敏[3-4]。

米糠在我國年產(chǎn)量約1 300萬t，這是一項巨大的農(nóng)副產(chǎn)品資源[5]。然而，我國只有約10%的米糠用于榨油及精深加工，遠未充分增值利用[6]。米糠來源豐富、價廉并富含多種營養(yǎng)成分及健康活性成分[7-8]。米糠中含20%～30%淀粉可以被有效利用轉(zhuǎn)化成高附加值產(chǎn)品。本課題組研究了以米糠為起始原料制備葡萄糖漿的新技術(shù)[9]，不僅可以節(jié)約主糧資源，而且可以避免玉米葡萄糖食用過敏的缺點。本文報道以米糠經(jīng)酶法制備葡萄糖的工藝研究，為新技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用奠定工藝基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗原料。新鮮米糠購買于稻米加工廠，經(jīng)測定，其中淀粉含量25.2%，水分含量11.6%、粗脂肪含量16.2%、灰分含量8.5%、粗蛋白質(zhì)含量 14.5%。

1.1.2 試驗試劑。高溫α-淀粉酶（江蘇銳陽生物科技有限公司，2萬U/mL，食品級），糖化酶（江蘇銳陽生物科技有限公司，2萬U/g，食品級），正己烷是食品級，其他相關(guān)試劑為化學(xué)純或分析純。

1.1.3 試驗儀器。德國Heidolph Hei-VAP Advantage ML旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；RE5220A中試旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；德國MEMMERT VO500真空加熱干燥箱；DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；HCP-100全鋼高速多功能粉碎機；JA31002電子天平等。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 米糠粕酶催化液化的單因素試驗。①α-淀粉酶用量對米糠淀粉液化效果的影響試驗。稱取米糠粕20 g，加160 mL水攪拌均勻，于pH值6.3、100 ℃糊化30 min，選取20、40、60、80、100 u/g 5個加酶量水平，加入0.2% CaCl2，80 ℃水浴鍋中液化2 h，接著煮沸滅酶5 min，冷卻補水至初重，測定還原度DE值。②溫度對米糠淀粉液化效果的影響試驗。稱取米糠粕20 g，加160 mL水攪拌均勻，于pH值6.3、100 ℃糊化30 min，加酶60 u/g，加入0.2% CaCl2，選取60、70、80、90、100 ℃ 5個水平的溫度進行液化2 h，取出后煮沸5 min，冷卻補水至初重，測定還原度DE值。③時間對米糠淀粉液化效果的影響試驗。稱取米糠粕20 g，加160 mL水攪拌均勻，于pH值6.3、100 ℃糊化30 min，加酶60 u/g，加入0.2% CaCl2，90 ℃液化30、60、90、120、150 min，取出后煮沸5 min，冷卻補水至初重，測定還原度DE值。

1.2.2 米糠粕麥芽糖糊精糖化的單因素試驗。①糖化酶用量對糖化效果的影響試驗。稱取米糠粕20 g，按以上1.2.1確定的最佳液化條件處理后，過濾，濾液調(diào)節(jié)pH 值至4.5，控制溫度60 ℃，糖化酶用量分別為100、200、300、400、500 u/g糖化8 h，測定DE值。②溫度對糖化效果的影響試驗。稱取米糠粕20 g，按以上1.2.1確定的最佳液化條件處理后，過濾，濾液調(diào)節(jié)pH值至4.5，糖化酶用量400 u/g，在溫度分別為30、40、50、60、70 ℃條件下糖化8 h，測定DE值。③pH值對糖化效果的影響試驗。稱取米糠粕20 g，按以上1.2.1確定的最佳液化條件處理后，過濾，糖化酶用量400 u/g，選取pH值3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，60 ℃條件下糖化8 h，測定DE值。④糖化時間對糖化效果的影響試驗。稱取米糠粕20 g，按以上1.2.1確定的最佳液化條件處理后，離心，上清液調(diào)節(jié)pH值至4.5，糖化酶用量400 u/g，溫度60 ℃，加酶量400 u/g條件下分別糖化4、8、16、24、28 h，測定DE值。

1.2.3 米糠原料對葡萄糖產(chǎn)品的收率及純度影響試驗。分別稱取1.0 kg新鮮米糠、脫脂脫蛋白米糠、脫脂米糠和脫蛋白米糠按工藝1.2.1和1.2.2的最佳工藝條件反應(yīng)后得到4種粗葡萄糖漿，然后純化、結(jié)晶，得到葡萄糖晶狀固體粉末，測定收率（基于以新鮮米糠原料）和純度。

1.3 指標測定

脂肪含量測定采用索氏抽提法（GB/T 5512-2008）；蛋白含量測定采用凱氏定氮法（GB/T 5511-2008）；淀粉含量測定采用NY/T11-1985法；水分含量測定采用常壓干燥恒重法（GB 5009.3-2010）；灰分測定采用灼燒重量法（GB/T 22510-2008）；葡萄糖漿DE值按國標GB/T20885-2007測試計算。

1.4 工藝流程

米糠酶法制備葡萄糖工藝流程如圖2所示。

1.5 工藝操作

1.5.1 米糠原料的預(yù)處理。取新鮮米糠5 kg，清除米糠中的機械雜質(zhì)、灰分、異物等，粉碎處理，得到100目均勻物料。

1.5.2 米糠脫脂處理。將預(yù)處理的米糠4.0 kg，加入8 L食品級正己烷，于30 ℃攪拌提取5 h，過濾，濾渣重復(fù)浸提1次，提油后的米糠于通風(fēng)良好條件下室溫揮盡溶劑得到脫脂米糠，得到米糠粕（脫脂米糠）3.36 kg。

1.5.3 熱堿水溶液法去除米糠粕中蛋白質(zhì)及其他水溶物質(zhì)。取3.0 kg脫脂米糠，加24 L去離子水，調(diào)至pH值10，于60 ℃溫度攪拌處理2 h，過濾。濾餅以1 mol/L鹽酸洗滌，再以去離子水洗滌至近中性，盡量抽干，60 ℃干燥，得米糠粕2.2 kg。

1.5.4 制備葡萄糖。取適量經(jīng)以上步驟處理過的米糠粕，加入8倍體積的水，攪拌均勻，以稀鹽酸調(diào)于pH值6.3，于100 ℃糊化30 min后，加入原料重量0.2% 的CaCl2，然后將高溫α-淀粉酶加入該物料混合物中，分別考察α-淀粉酶加酶量、液化溫度、液化時間對液化淀粉還原度DE值的影響；液化反應(yīng)后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，過濾，濾液于50～80 ℃熱水浴鍋經(jīng)減壓濃縮至原體積的25%～50%，得麥芽糖糊精溶液；向麥芽糖糊精溶液中加入糖化酶，并考察加酶量、pH值、溫度、糖化時間對糖化反應(yīng)后DE值的影響。檢查糊精成陰性，煮沸滅酶，過濾，得粗葡萄糖漿。將粗葡萄糖漿以活性炭脫色，并經(jīng)離子交換樹脂去除Cl-和Ca2+脫鹽純化處理后，可以得到純品葡萄糖漿；將純化后的葡萄糖漿于55 ℃減壓濃縮，至濃度約為70%，靜置至室溫后，加晶種，冷藏結(jié)晶，過濾，并以少量蒸餾水洗滌濾餅，抽干，于45 ℃真空干燥（用P2O5干燥劑），得葡萄糖晶體。稱重，計算收率（基于以新鮮米糠原料）。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠粕酶催化液化的單因素試驗

2.1.1 α-淀粉酶用量對米糠淀粉液化效果的影響。由圖3可知，加酶量為20～60 u/g時，底物較多，酶較少，DE值隨著加酶量增大而升高，當加酶量為60 u/g時，DE值達21.8，此后，加酶量繼續(xù)增大，但底物濃度相對較低，DE值增加緩慢。因此，以60 u/g為最佳加酶量。

2.1.2 溫度對米糠淀粉液化效果的影響。由圖4可知，當溫度從60 ℃升至90 ℃時，DE值逐漸增大，這可能是溫度升高，逐漸接近淀粉酶的最適溫度，且淀粉分子的運動增強，增加了酶與淀粉分子內(nèi)部糖苷鍵的接觸，使受降解的糖苷鍵增加[10]。但當溫度超過90 ℃時，DE值開始下降，這可能是因為溫度已超過淀粉酶的最適溫度，最佳液化溫度選取90 ℃。

2.1.3 時間對米糠淀粉液化效果的影響。由圖5可知，隨著時間的延長，DE值逐漸增大，但120 min以后增加緩慢，因此以120 min為最佳液化時間。

根據(jù)以上各單因素試驗結(jié)果，確定最佳液化工藝條件為：米糠粕20 g，水160 mL，pH值6.3，100 ℃糊化30 min，α-淀粉酶60 u/g，0.2% CaCl2，90 ℃液化120 min。

2.2 米糠粕麥芽糖糊精糖化的單因素試驗

2.2.1 糖化酶用量對糖化效果的影響。由圖6可知，隨著酶量的增加，DE值逐漸增大，但400 u/g以后增加緩慢，因此以400 u/g為最佳加酶量。

2.2.2 溫度對糖化效果的影響。由圖7可知，隨著溫度的升高，DE值逐漸增大，但60 ℃以后增加緩慢，因此以60 ℃為最佳糖化溫度。

2.2.3 pH值對糖化效果的影響。由圖8可知，當pH值為3.5～4.5之間時，DE值隨著pH值升高而快速增大，但當超過4.5以后，DE值則隨著pH值增加而快速下降。pH值的改變可能會引起酶活性中心或酶分子構(gòu)象改變，影響酶與底物的結(jié)合與催化能力[11]。

2.2.4 糖化時間對糖化效果的影響。由圖9可知，隨著時間的延長，DE值逐漸增大，但24 h以后增加緩慢，因此以24 h為最佳糖化時間。

根據(jù)以上各單因素試驗結(jié)果，確定最佳糖化工藝條件為：pH值4.5，糖化酶用量400 u/g，溫度60 ℃，時間24 h。

2.3 米糠原料對葡萄糖產(chǎn)品的收率及純度影響

由表2可以看出，在優(yōu)化的液化和糖化工藝條件下，以脫脂脫蛋白米糠為原料經(jīng)酶法制得的葡萄糖純度最好。先去除米糠原料中的油脂和蛋白質(zhì)，避免了它們對糖化液化反應(yīng)的影響，特別是避免了水溶性蛋白質(zhì)混入葡萄糖產(chǎn)品難以分離純化，因而制得的產(chǎn)品純度高達99.2%。表中脫脂脫蛋白米糠原料對應(yīng)的收率是10.2%，主要是因為新鮮米糠中淀粉在脫蛋白過程中溶于水而有所損失。

3 結(jié)論與討論

以新鮮米糠，先經(jīng)脫脂脫蛋白質(zhì)后為原料，由單因素試驗得米糠淀粉最佳液化工藝條件為：水8倍重量于物料，于pH 值6.3，100 ℃糊化30 min后，1 g物料用α-淀粉酶60 u，加0.2% CaCl2，在90 ℃液化反應(yīng)120 min后得麥芽糖糊精；由單因素試驗得米糠麥芽糖糊精最佳糖化工藝條件為：pH值4.5，糖化酶用量400 u/g，溫度60 ℃，時間24 h；所得粗葡萄糖漿經(jīng)活性炭脫色、離子交換樹脂脫鹽、濃縮結(jié)晶、真空干燥得高于99%含量的葡萄糖晶狀固體。并且在最佳液化糖化工藝條件下，比較了以新鮮米糠、脫脂米糠、脫蛋白米糠和脫脂脫蛋白米糠為原料制備葡萄糖，結(jié)果表明，以脫脂脫蛋白米糠為原料制備的葡萄糖晶狀粉末質(zhì)量最好。

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