蘿卜抗蕪菁花葉病毒的研究現(xiàn)狀

劉根新　戴澈　許園園等

男，博士，研究員。江蘇省新長征突擊手，江蘇省第四期“333工程”第三層次培養(yǎng)對象。主要從事絲瓜及蘿卜遺傳育種和高效栽培技術(shù)研究。2C05年主編《袖珍果蔬優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)栽培》系列叢書；2007主編《無公害高效栽培重點(diǎn)、難點(diǎn)與實(shí)例》系列叢書；以第一作者撰寫專業(yè)著作7本，個(gè)人累計(jì)80多萬字。2007年度被江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院授予“發(fā)表論文獎(jiǎng)”。獲得江蘇省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)、南京市科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)、江蘇省科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)、江蘇省農(nóng)業(yè)豐收獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)各1次。獲得絲瓜、蘿卜等相關(guān)的國家授權(quán)發(fā)明專利7項(xiàng)，主持制定絲瓜、蘿卜等江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)7項(xiàng)。作為主要完成人之一育成江蔬一號絲瓜、江蔬肉絲瓜；參與選育雙冠大白菜、夏豐大白菜、熱抗白小白菜、熱抗青小白菜；主持選育寧紅1號蘿卜、蘇麗夏紅1號蘿卜、蘇麗冬白1號蘿卜、蘇秀1號葉用蘿卜和蘇絲3號絲瓜。

DOI：10-3865/j.issn.1001-3547-2016.08.015

摘要：蕪菁花葉病毒（TuMV）寄主范圍寬廣且對十字花科作物為害嚴(yán)重，從TuMV寄主范圍與病原檢測、發(fā)病癥狀、株系劃分、遺傳規(guī)律與抗性資源挖掘等方面簡述了現(xiàn)階段蘿卜TuMV的研究進(jìn)展，以期為蘿卜等十字花科作物抗TuMV育種提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蘿卜；蕪菁花葉病毒（TuMV）；抗性

中圖分類號：S631.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001—3547（2016）08—0031—04

蘿卜（Raphanus sat/vus L.）別名萊菔，一、二年生草本植物，屬于十字花科蘿卜屬，染色體2n=18。蘿卜可四季栽培、周年供應(yīng)，產(chǎn)銷量極大，是一種世界性蔬菜，在全世界范圍尤其是東南亞地區(qū)廣泛栽植。我國是蘿卜的主要起源地之一，蘿卜品種極多，各地均有栽培，全國播種面積大，僅次于大白菜。由于蘿卜營養(yǎng)比較豐富，在預(yù)防和治療中毒、暑熱、腹瀉等疾病方面有較好的效果，且其適宜加工、方便貯運(yùn)，故很受廣大消費(fèi)者歡迎。

病害一直是影響我國蘿卜生產(chǎn)的重要因素，對蘿卜病害調(diào)查的研究發(fā)現(xiàn)，軟腐病、黑腐病、病毒病、黑斑病和霜霉病已成為目前為害蘿卜生產(chǎn)的主要病害，其中病毒病為害較為嚴(yán)重，一旦發(fā)病，不但造成減產(chǎn)，而且嚴(yán)重影響蘿卜的品質(zhì)。一直以來，蘿卜品種的選育都是以提高品質(zhì)和產(chǎn)量為目標(biāo)，因此生產(chǎn)上栽培的品種相對較少，生態(tài)條件多變和長久的連作生產(chǎn)，使蘿卜更易染上病毒病。生產(chǎn)上引發(fā)蘿卜病毒病的主要病原是蕪菁花葉病毒（Tumipmosaic virus，TuMV），其次為黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV），而在長江中下游地區(qū)，由TuMV所引起的蘿卜病毒病發(fā)病率達(dá)90%以上。TuMV常通過有翅蚜進(jìn)行傳播，導(dǎo)致生產(chǎn)上使用普通化學(xué)藥劑及傳統(tǒng)生物防治手段來預(yù)防病害難以達(dá)到預(yù)期效果，不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且還會造成不必要的資源浪費(fèi)。因此基于以上背景，為了有效防治TuMV引起的病毒病，提高我國蘿卜的產(chǎn)量和品質(zhì)，開展蘿卜資源對TuMV的抗性鑒定評價(jià)、篩選優(yōu)異抗原、培育抗病毒病蘿卜新品種工作，從根本上減輕此病害對蘿卜生產(chǎn)造成的為害。

1.1蘿卜TuMV寄主范圍與發(fā)病癥狀

蕪菁花葉病毒（TuMV）是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的重要一員，據(jù)多個(gè)國家和地區(qū)對病毒病的調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，TuMV已成為世界范圍內(nèi)為害蔬菜最嚴(yán)重的5種病毒之一。TuMV寄主范圍特別廣泛，侵染能力僅次于黃瓜花葉病毒，是侵染大田蔬菜的一個(gè)重要病原，能夠侵染十字花科蔬菜如蘿卜、白菜、花椰菜、甘藍(lán)及重要經(jīng)濟(jì)作物如油菜等在內(nèi)的43科156屬的318種植物。在自然界中，TuMV可由蚜蟲刺吸和汁液接觸傳染，田間病毒傳播主要靠蚜蟲，不同地區(qū)傳播病毒的蚜蟲不同，但均通過非持久的方式進(jìn)行傳播，土壤和成熟的種子不能傳播。該病毒在不同的寄主上表現(xiàn)出不同癥狀，蘿卜被TuMV侵染后初期表現(xiàn)為輕花葉、皺縮、沿葉脈褪綠等癥狀，后期則出現(xiàn)葉脈褐色壞死、矮化、整株畸形等現(xiàn)象，造成蘿卜品質(zhì)變差、產(chǎn)量下降。

1.2蘿卜TuMV株系分化

TuMV研究歷史悠久，且TuMV株系的劃分一直以來都是研究的熱點(diǎn)，但由于TuMV為單鏈RNA，RNA聚合酶不具有3′-5′的核酸外切酶的校正功能，極易造成其無法對復(fù)制過程中發(fā)生的錯(cuò)配進(jìn)行有效修復(fù)，高頻率突變使得TuMV存在廣泛的株系變異。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)TuMV出現(xiàn)了多種株系和致病型，這些株系往往具備地理分布寬、寄主范圍廣的特點(diǎn)，鑒于此，國內(nèi)尚未制定出統(tǒng)一完善的標(biāo)準(zhǔn)，給TuMV的防治帶來更大困難。

過去TuMV株系劃分主要根據(jù)TuMV病毒對不同植株的侵染能力和由此產(chǎn)生的癥狀反應(yīng)來評價(jià)，而現(xiàn)在主要是根據(jù)TuMV病毒的血清學(xué)、寄主譜的鑒定乃至病毒外殼蛋白基因序列進(jìn)行劃分。Green等將篩選到的4個(gè)大白菜品種作為新的鑒定譜，把TuMV株系劃分為C₁～C₄，以此為基礎(chǔ)，又對我國臺灣十字花科蔬菜的TuMV株系進(jìn)行鑒定分析，還額外發(fā)現(xiàn)了C₅株系，最終將我國十字花科TuMV株系劃分為C₁～C₅。由于我國十字花科蔬菜具有資源豐富、地理差異顯著的特點(diǎn)，因此劉栩平等認(rèn)為Green以大白菜鑒別品種作為劃分依據(jù)不能全面體現(xiàn)我國不同十字花科蔬菜TuMV株系的分化情況，他們選取蘿卜屬和蕓薹屬中8種蔬菜共94個(gè)品種，以其中6個(gè)蔬菜品種包括甘藍(lán)、白菜、蘿卜和花椰菜等組成鑒別寄主，經(jīng)過篩選后，最終把我國10省市的十字花科蔬菜的TuMV株系劃分為Tu₁～Tu₇共7個(gè)株系。另外，馮蘭香等則通過病毒侵染試驗(yàn)鑒定C₄為北京地區(qū)十字花科蔬菜TuMV的主流株系。

盡管目前國內(nèi)外研究尚不能確認(rèn)各地TuMV主流株系是否完全相同，但是現(xiàn)有的研究則表明，TuMV-C4是為害我國蘿卜等十字花科作物的主流株系之一。

1.3蘿卜TuMV病原檢測

隨著對TuMV的深入探索，在TuMV病原鑒定與檢測方法上逐漸向高效、穩(wěn)定的方向發(fā)展。目前檢測十字花科作物TuMV主要是采用生物學(xué)、電子顯微鏡觀察、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法。

①生物學(xué)鑒定法是檢測TuMV病原最原始的方法，但該方法檢測TuMV的結(jié)果易受環(huán)境因素影響，不穩(wěn)定，且周期長、操作繁瑣，不能將TuMV存在情況準(zhǔn)確反映出來，目前一般建議將此方法與其他檢測技術(shù)相結(jié)合。

②電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的出現(xiàn)為鑒定TuMV病毒提供了直觀的方法，但該技術(shù)比較復(fù)雜，且每次只能處理少量樣品。因此，在檢測過程中通常將此技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合使用，如Suh等運(yùn)用免疫電鏡技術(shù)（ISEM）來檢測TuMV，發(fā)現(xiàn)效果比單獨(dú)使用其中一種技術(shù)效果更加明顯。

③ELISA法酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)既可以進(jìn)行定性分析，又可以定量分析，是目前診斷植物病毒病最廣泛的一種免疫學(xué)方法。潘熙萍等通過間接酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)（ID-ELISA）檢測結(jié)果表明，TuMV工作的最適稀釋濃度是10000倍。ELISA技術(shù)簡便、不僅特異性強(qiáng)而且靈敏度極高，其原理是通過酶催化后產(chǎn)生的顏色變化來反映抗原與抗體是否有效結(jié)合。該技術(shù)適用于對田間大量樣品進(jìn)行檢測，也被廣泛用于脫毒、病毒檢測以及無性繁殖等。

④分子生物學(xué)技術(shù)近年來，分子生物學(xué)技術(shù)逐漸被應(yīng)用于TuMV檢測，且隨著TuMV株系CP蛋白序列的大量發(fā)表，為使用該技術(shù)對TuMV進(jìn)行鑒定提供了更多參考依據(jù)。隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)，利用病毒基因組少量DNA或cDNA即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此方法利用病毒基因來檢測病毒，靈敏度更高、特異性更強(qiáng)。

⑤RT-PCR技術(shù)雖然以上檢測方法能對TuMV進(jìn)行有效檢測，但是操作起來仍然較為繁瑣。莊木等則建立了簡單有效的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)（RT-PCR），基于蕪菁花葉病毒外殼蛋白基因（CP）序列進(jìn)行特異引物設(shè)計(jì)，然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，對部分十字花科蔬菜田間病樣簡單處理后，即可使用此方法準(zhǔn)確、高效地檢測TuMV病毒。

1.4蘿卜抗TuMV資源挖掘

TuMV為RNA病毒，在十字花科作物中，存在對TuMV高抗甚至免疫的優(yōu)良抗原材料，在我國蘿卜品種中亦存在對TuMV表現(xiàn)優(yōu)良抗性的抗源。汪隆植等曾對我國260個(gè)蘿卜品種和自交系進(jìn)行鑒定，其中抗TuMV的資源有11份，且其對我國收集到的269份夏秋蘿卜材料進(jìn)行田間篩選，初選得到53份優(yōu)異材料，最終篩選到對TuMV（N-100）高抗材料1份（R-7）、抗病材料3份（R-40、R-41、R-42）、耐病材料3份（R-50、R-52、R-53）。

關(guān)于蘿卜病毒病抗性鑒定方面，日本學(xué)者曾根據(jù)16個(gè)蘿卜品種的田間發(fā)病率高低將蘿卜抗病性分成強(qiáng)、中、弱3個(gè)類群，但未進(jìn)行明確的劃分。李燁等通過對11個(gè)蘿卜品種苗期的TuMV抗性進(jìn)行初步鑒定發(fā)現(xiàn)，秋魁青、鴨蛋頭、熱白蘿卜為高抗TuMV品種，夏長白二號、揚(yáng)花蘿卜、小紅頭、南研30天為感病品種，如果要在生產(chǎn)上栽植，則需引進(jìn)相關(guān)抗性基因。

1.5蘿卜TuMV抗性遺傳規(guī)律

受鑒定植株的生長發(fā)育時(shí)期、外界環(huán)境、病毒株系、遺傳分析模型以及基因型等方面的影響，不同雜交組合抗性類型存在差異，甚至同一雜交組合的植株于不同時(shí)期鑒定其抗性類型也不盡相同，因此，國內(nèi)外關(guān)于抗TuMV的遺傳規(guī)律歷來存在爭議。

黃祖儀曾報(bào)道蘿卜對TuMV的抗性符合加性一顯性模型，以加性效應(yīng)為主，抗性是顯性，其屬于數(shù)量性狀遺傳，并且受主效基因控制。汪隆植等用高抗品種為保持系，中抗不育系為母本育成的2個(gè)不育系均表現(xiàn)抗病，后用感病品種為父本與其雜交，其F₁代也表現(xiàn)抗病。

李紅雙等以TuMV高抗和高感自交系為親本，構(gòu)建了6個(gè)群體包括P₁、P₂、B₂、B₂、F₁及F₂，采用數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳的6世代聯(lián)合分析法，發(fā)現(xiàn)蘿卜對TuMV的抗性受2對主基因控制，符合加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性-上位性多基因模型，不受環(huán)境因素影響。

綜上所述，目前盡管對多種十字花科作物TuMV的抗病遺傳規(guī)律研究較多，但是結(jié)果均不完全一致，這充分說明TuMV抗病遺傳規(guī)律的復(fù)雜性。而在蘿卜上，相關(guān)研究報(bào)道相對較少，因此無論是從水平還是垂直育種方向考慮，均需對多種特征材料進(jìn)行更加廣泛的深入研究，以期為蘿卜TuMV抗病育種提供參考依據(jù)。

2問題與展望

近年來，雖然通過育種工作者的不懈努力，我國蘿卜栽培育種技術(shù)與新優(yōu)品種選育工作取得較大成績，如成功篩選到部分抗TuMV材料，并能初步應(yīng)用于蘿卜抗性育種研究工作中，但此方面研究技術(shù)與國外先進(jìn)水平仍存在一定差距。具體表現(xiàn)為：目前，研究中可應(yīng)用的蘿卜抗TuMV優(yōu)異抗源材料仍然比較有限：雖然已有蘿卜抗TuMV遺傳規(guī)律的研究，但是由于不同研究采用的方法和材料不同，導(dǎo)致結(jié)論不一致：尚未有關(guān)于蘿卜抗TuMV的分子機(jī)理研究方面的報(bào)道。

因此，接下來的蘿卜抗TuMV研究工作中，首先仍要持續(xù)進(jìn)行新優(yōu)種質(zhì)資源的鑒定、收集以及不斷加強(qiáng)創(chuàng)新優(yōu)異抗源材料，尤其是加強(qiáng)利用和開發(fā)中國部分傳統(tǒng)的地方優(yōu)良品種，充實(shí)現(xiàn)有的種質(zhì)資源基因庫，通過分子生物學(xué)方法盡快發(fā)掘鑒定TuMV抗性關(guān)鍵基因及可能存在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；其次要在堅(jiān)持傳統(tǒng)常規(guī)育種的過程中，對蘿卜抗蕪菁花葉病毒病的理論基礎(chǔ)進(jìn)行深入探索，將分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)、分子標(biāo)記定位技術(shù)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)高效地應(yīng)用于抗TuMV育種中，在提高蘿卜產(chǎn)量品質(zhì)的同時(shí)，大力提高蘿卜育種效率，以期在蘿卜抗TuMV育種研究方面實(shí)現(xiàn)新的突破。