聚乙烯吡咯烷酮-羧甲基殼聚糖原位水凝膠的研究*

劉群峰，陳 軍，耿志杰，張 錦，張澤榮，裴大婷

國家醫(yī)療保健器具工程技術(shù)研究中心，廣東省醫(yī)用電子儀器及高分子材料制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省醫(yī)療器械研究所，廣東 廣州 510500

?

聚乙烯吡咯烷酮-羧甲基殼聚糖原位水凝膠的研究*

劉群峰，陳 軍，耿志杰，張 錦，張澤榮，裴大婷

國家醫(yī)療保健器具工程技術(shù)研究中心，廣東省醫(yī)用電子儀器及高分子材料制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省醫(yī)療器械研究所，廣東 廣州 510500

將聚乙烯吡咯烷酮溶液和羧甲基殼聚糖溶液簡單混合，通過調(diào)整體系pH值可制備出原位水凝膠.經(jīng)衰減全反射傅里葉紅外光譜分析表明，羧甲基殼聚糖與聚乙烯吡咯烷酮之間存在相互作用.該凝膠具有良好的溶脹性能及生物相容性，無細(xì)胞毒性.

原位；水凝膠；殼聚糖；溶脹；交聯(lián)

水凝膠是一種能吸收大量水且具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì).通常水凝膠是通過單體交聯(lián)劑化學(xué)交聯(lián)而成，其缺點(diǎn)是結(jié)構(gòu)中往往含有少量的小分子單體和交聯(lián)劑等物質(zhì)，影響水凝膠的相容性[1].近來，原位交聯(lián)的水凝膠引起了關(guān)注，其特點(diǎn)是液態(tài)組分可以在生理?xiàng)l件下形成凝膠.形成原位凝膠的主要機(jī)理包括：氫鍵作用、紫外光輻照、離子相互作用等.這些方法都不需要交聯(lián)劑和引發(fā)劑，即可使得原位凝膠具有良好的生物相容性，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到重視[2].

本研究采用聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基殼聚糖制備原位水凝膠體系.殼聚糖具有生物降解性和光譜抗菌性能，聚乙烯吡咯烷酮是一種具有高度生物相容性的親水高分子材料，兩者形成的凝膠有望用于創(chuàng)面敷料和藥物載體[3-4].聚乙烯吡咯烷酮側(cè)鏈含有吡咯烷酮結(jié)構(gòu)，通過開環(huán)產(chǎn)生羧基或者羧基鹽基團(tuán).有文獻(xiàn)報(bào)道開環(huán)聚乙烯吡咯烷酮可與殼聚糖中的衍生物發(fā)生相互作用形成凝膠[5].本研究發(fā)現(xiàn)未開環(huán)聚乙烯吡咯烷酮與檸檬酸結(jié)合后，可與殼聚糖作用形成性能優(yōu)異的原位凝膠.

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

羧甲基殼聚糖(羧化度>60%，南京奧多福尼生物科技有限公司)；殼聚糖(食品級(jí)，濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K90(分析純，天津市博迪化工有限公司)；氫氧化鈉(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；檸檬酸(分析純，天津啟輪化學(xué)科技有限公司)；鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%，廣州化學(xué)試劑廠)；透析袋(截留分子量8000～14000，美國Life Science公司)；Nicolet 6700型衰減全反射傅里葉紅外光譜分析(ATR，廠商ThermoFisher).

1.2 水凝膠體系的制備

將5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶于45 g去離子水中，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% PVP溶液.然后添加適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%檸檬酸溶液，制成pH為3～5的PVP-K90溶液.將1 g羧甲基殼聚糖溶解于49 g去離子水中，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%羧甲基殼聚糖溶液.按羧甲基殼聚糖溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液的質(zhì)量比為0.5～1︰1，將PVP-K90水溶液緩慢加入羧甲基殼聚糖溶液中，靜置10 min，即可獲得半透明的原位凝膠.獲得的原位凝膠具有固定形狀，但力學(xué)強(qiáng)度較弱,觸碰容易被破壞.

1.3 凝膠的吸水性能及表征

將干燥的凝膠置于室溫水中，每隔一定時(shí)間取出樣品，用濾紙小心拭去凝膠表面的水并稱重，直至樣品質(zhì)量不變?yōu)橹?時(shí)間t時(shí)，水凝膠的溶脹率(Rt)為：

Rt=(mt-m0)/m0=Wt/m0，

(1)

式(1)中m0為t=0時(shí)凝膠的質(zhì)量，即干凝膠的質(zhì)量；mt為時(shí)間t時(shí)凝膠的質(zhì)量;Wt即為t時(shí)凝膠中水的質(zhì)量.水凝膠的平衡溶脹率(Re)為：

Re=(me-m0)/m0=We/m0，

(2)

式(2)中me為達(dá)到溶脹平衡時(shí)凝膠的質(zhì)量，We為達(dá)到溶脹平衡時(shí)凝膠中水的質(zhì)量.

1.4 水凝膠生物相容性評(píng)價(jià)

主要對(duì)原位凝膠的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測，樣品制備及細(xì)胞毒性測試在廣東省醫(yī)療器械研究所質(zhì)檢部進(jìn)行.浸提原液組：樣品質(zhì)量0.1 g，加入6 ml血清質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10 %的MEM細(xì)胞培養(yǎng)基.陽性對(duì)照：以20%苯酚溶液為浸泡液，用直徑10 mm的圓形無菌濾紙片輕輕沾取浸泡液作為陽性對(duì)照.陰性對(duì)照：以 0.2 g/ml高密度聚乙烯為浸泡液，37 ℃下浸提 24 h，用直徑10 mm的圓形無菌濾紙片輕輕沾取浸泡液作為陰性對(duì)照.

細(xì)胞毒性測試：將傳代2次對(duì)數(shù)生長的3T3(L929)細(xì)胞加胰酶消化后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打均勻后顯微鏡下計(jì)數(shù).根據(jù)細(xì)胞濃度，加培養(yǎng)液稀釋成250000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，然后在3個(gè)平皿中各加入10 ml，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h.24 h細(xì)胞生長近匯合，棄去原培養(yǎng)液，在每個(gè)平皿中分別加入溶化瓊脂與含10%血清的MEM培養(yǎng)基的混合液6 ml.待混合培養(yǎng)基凝固后將培養(yǎng)皿分組，分別加入供試品、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，然后置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h.藥物作用24 h后，在皿底標(biāo)出試驗(yàn)樣輪廓，取下瓊脂表面試驗(yàn)樣，并在各皿中加入0.1%中性紅染液2 ml，繼續(xù)避光培養(yǎng)1 h，最后在顯微鏡下觀察拍照，記錄細(xì)胞毒性情況.

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 原位水凝膠的影響因素

本體系的水凝膠是通過聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基殼聚糖在室溫下簡單共混后制得，制備中未采用化學(xué)交聯(lián)劑，形成的水凝膠結(jié)構(gòu)為物理水凝膠.這類水凝膠在一定條件下能發(fā)生溶膠-凝膠態(tài)的可逆轉(zhuǎn)化，力學(xué)強(qiáng)度不高，但是具有良好的生物安全性.表1為組分對(duì)形成凝膠的影響.由表1可知，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與殼聚糖和羧甲基殼聚糖直接作用并不能產(chǎn)生凝膠(1，2號(hào)試驗(yàn))；添加適量的檸檬酸，將體系調(diào)至酸性有利于形成凝膠(3，4號(hào)試驗(yàn)).在相同的試驗(yàn)條件下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%殼聚糖醋酸溶液和PVP制備水凝膠，沒有形成凝膠.可見，在制備水凝膠的過程中，體系的pH值、凝膠的組分等對(duì)凝膠的形成有較大的影響.本體系采用檸檬酸來調(diào)節(jié)體系的pH值，因?yàn)闄幟仕釣槿跛崆覐V泛用于食品添加劑，具有較好的生物安全性.圖1為3號(hào)凝膠樣品的外觀圖.由圖1可看出，凝膠呈現(xiàn)透明果凍狀.凝膠在去離子水中經(jīng)過長時(shí)間的浸泡不發(fā)生溶解.

表1 組分對(duì)凝膠形成的影響

圖1 聚乙烯吡咯烷酮-羧甲基殼聚糖凝膠照片F(xiàn)ig.1 Photo of the hydrogel of polyvinyl pyrrolidone and carboxymethyl chitosan

2.2 水凝膠的形成機(jī)理和吸水性能

羧甲基殼聚糖由于含有羧甲基鈉結(jié)構(gòu)使其在中性條件下溶于水，聚乙烯吡咯烷酮的側(cè)鏈存在環(huán)羰基結(jié)構(gòu).兩者共混可能產(chǎn)生多重作用：(1)羧甲基殼聚糖與聚乙烯吡咯烷酮形成分子間絡(luò)合和纏繞[6]；(2)隨pH值減小羧甲基殼聚糖的親水性下降而疏水性增加.前一種作用力主要發(fā)生在殼聚糖和聚乙烯吡咯烷酮之間，形成絡(luò)合物；后一種作用力主要在殼聚糖組分中發(fā)生.試驗(yàn)中對(duì)形成的凝膠反復(fù)用水浸泡、抽取，然后對(duì)干燥處理后的凝膠進(jìn)行衰減全反射傅里葉紅外光譜分析(ATR)表征.圖2為浸泡、抽取前后樣品的ATR圖譜.由圖2可知，2940 cm-1是聚乙烯吡咯烷酮C—H伸縮振動(dòng)峰；1644 cm-1是聚乙烯吡咯烷酮C=O伸縮振動(dòng)和羧甲基殼聚糖NH3峰的疊加，因而這個(gè)峰強(qiáng)度較大.通過對(duì)比可發(fā)現(xiàn)，凝膠在浸泡前后變化不大，說明凝膠中大部分聚乙烯吡咯烷酮在浸泡后仍保留在凝膠中.因而可判斷羧甲基殼聚糖與聚乙烯吡咯烷酮之間存在相互作用.

圖2 凝膠的紅外ATR圖譜Fig.2 ATR spectrum of gel

將所制得的原位凝膠先制成高約1 cm小圓柱，然后用乙醇置換出凝膠中的水分，在真空45 ℃下除去乙醇獲得干燥凝膠.這種處理方法較簡單，同時(shí)可保持凝膠在干燥過程中不發(fā)生較大的形變而脆裂.通過稱量干燥凝膠片的吸水量可測試原位水凝膠的吸水性能.試驗(yàn)結(jié)果表明，聚乙烯吡咯烷酮-羧甲基殼聚糖原位凝膠體系的溶脹性對(duì)pH值的變化較敏感.在堿性溶液(pH﹥8)中進(jìn)行溶脹，凝膠會(huì)較快溶解.原因是堿性環(huán)境下殼聚糖羧基的親水性變大，分子鏈產(chǎn)生溶解作用，從而破壞了凝膠結(jié)構(gòu).圖3為中性和酸性條件下凝膠的吸水溶脹曲線.從圖3可以看出，原位凝膠在pH=5.5弱酸性介質(zhì)中具有良好的吸水性能，吸水倍率可達(dá)7倍；在中性介質(zhì)中的吸水倍率能達(dá)8.2倍，溶脹平衡時(shí)間均為3 h.

圖3 凝膠溶脹曲線Fig.3 Gel swelling curve

2.3 水凝膠的生物相容性評(píng)價(jià)

與通過戊二醛等化學(xué)交聯(lián)制備的殼聚糖水凝膠相比，聚乙烯吡咯烷酮-羧甲基殼聚糖原位自交聯(lián)水凝膠是一種通過物理相互作用形成的水凝膠，不含有毒的小分子物質(zhì)，因而具有良好的生物相容性.對(duì)制備的原位凝膠，不作任何處理直接進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn).細(xì)胞毒性試驗(yàn)形態(tài)如圖4所示.圖4顯示，原位凝膠樣品(圖4c)的細(xì)胞形態(tài)正常，無細(xì)胞溶解，細(xì)胞毒性計(jì)分為0，無細(xì)胞毒性；陰性對(duì)照組(圖4a)的細(xì)胞形態(tài)正常，無細(xì)胞溶解，細(xì)胞毒性計(jì)分為0，無細(xì)胞毒性；陽性對(duì)照組(圖4b)的整個(gè)培養(yǎng)區(qū)細(xì)胞層幾乎完全破壞，細(xì)胞溶解，細(xì)胞毒性計(jì)分為3，重度細(xì)胞毒性.可見，本研究原位形成的水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性.

圖4 原位凝膠的細(xì)胞毒性測試(a)陰性對(duì)照; (b)陽性對(duì)照;(c)原位凝膠Fig.4 The cell toxicity test of in situ gel (a) negative control;(b) positive control;(c) in situ gel

3 結(jié) 論

將聚乙烯吡咯烷酮溶液和羧甲基殼聚糖溶液簡單混合，通過調(diào)整適當(dāng)?shù)膒H值，可制備出原位水凝膠.該方法簡單有效，制備的凝膠具有良好的吸水溶脹性，且生物相容性良好，無細(xì)胞毒性，有望作為一種新型的生物醫(yī)用材料，如用作創(chuàng)面敷料、組織工程支架、藥物載體、細(xì)胞培養(yǎng)基等.

[1] 王薇，關(guān)國平，王璐.生物醫(yī)用水凝膠研究進(jìn)展[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)展，2015，36(4): 221-225.

[2] WANG Y, CAIL Q, NUGRAHA U B, et al.Current hydrogel solutions for repairing and regeneration of complex tissues[J].Curr Med Chem，2014，21(22): 2480-2496.

[3] SMITH Le, COLLNS S, LIU Z, et al.Synthesis and properties of functional poly(vinylpyrrolidinone) hydrogels for drug delivery polymers for biomedical applications[J].ACS Symposium Series，2009，977(1): 196-203.

[4] KUMAR M，MUZZARELLI R，MUZZARELLI C，et al.Chitosan chemistry and pharmaceutical perspectives chem[J].Rev，2004，104(12): 6017-6084.

[5] D’SOUZA A，SCHOWEN R, TOPP E M. Polyvinylpyrrolidone-drugconjugate：synthesis and release mechanism[J]．J Control Release，2004，94：91-100．

[6] ABASHZADEH S, DINARVAD R, SHARIFZADEH M, et al. Formulation and evaluation of an in situ gel forming system for controlled delivery of triptorelin acetate[J]. Eur J Pharm Sci，2011，44(4): 514-521.

Research about a in situ hydrogel of polyvinyl pyrrolidone and carboxymethyl chitosan

LIU Qunfeng，CHEN Jun，GENG Zhijie，ZHANG Jin，ZHANG Zerong,PEI Dating

NationalEngineeringResearchCenterforHealthcareDevices，GuangdongKeyLabofMedicalElectronicInstrumentsandPolymerMaterialProducts，GuangdongInstituteofMedicalInstruments，Guangzhou510500，China

In the research, an in-situ hydrogel was prepared by simple blending of the polyvinyl pyrrolidone solution and the carboxymethyl chitosan solution and adjusting the pH value. Attenuated total internal reflectance Fourier transform infrared spectroscopy analysis showed that there was an interaction between carboxymethyl chitosan and polyvinyl pyrrolidone. The gel had good swelling property and bio-compatibility without cell cytotoxicity.

in-situ；hydrogel；chitosan；swelling；cross-linking

1673-9981(2016)03-0209-05

2016-08-17

廣東省高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(2012B010200029)；廣州市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013J4300038)

劉群峰(1977-)，男，湖南邵陽人，副教授，博士.

TQ427.6

A