不同通氣條件對(duì)土壤中絲狀真菌類(lèi)型的影響

夏　宇?

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南　長(zhǎng)沙 410128）

不同通氣條件對(duì)土壤中絲狀真菌類(lèi)型的影響

夏宇

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

以不同通氣條件處理的水稻田土壤為材料，通過(guò)稀釋涂布平板法篩選得到11株菌株；提取這些菌株的克隆保守序列（ITS序列）并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序、分析，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，鑒定這些菌株的種屬名稱(chēng)。結(jié)果表明：這11株菌株分屬于真菌和放線菌兩大類(lèi)，其中絲狀真菌又分為曲霉和枝孢霉兩類(lèi)，其中青霉屬、曲霉屬親緣關(guān)系最接近。從通氣處理對(duì)土壤中絲狀真菌類(lèi)型的影響結(jié)果可知，對(duì)水稻最有益的通氣方式為白天通氣兩次、在移栽前和分糵期通入0.3‰的H2O2。

絲狀真菌；稻田土壤；IST序列分析；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

水稻是我國(guó)主要的糧食作物，而大部分時(shí)間水田土壤是被水覆蓋的，因此水稻田土壤中的微生物類(lèi)型及其活動(dòng)與旱地的有較大區(qū)別。而土壤通氣狀況對(duì)農(nóng)田微生物區(qū)系、土壤微生物生物量以及植物-微生物共同體（內(nèi)生菌根、根瘤及其與微生物）的活動(dòng)等都有顯著影響，從而間接影響作物的產(chǎn)量[1]。

絲狀真菌（filamentous）俗稱(chēng)霉菌（moulds），廣泛分布于土壤、水域、空氣及動(dòng)植物體內(nèi)外，在潮濕的氣候下大量生長(zhǎng)繁殖，長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的絲狀、絨狀或蜘蛛網(wǎng)狀的菌絲體。霉菌對(duì)人類(lèi)生活有較大危害。例如：許多霉菌會(huì)造成農(nóng)作物和植物的病害；可引起農(nóng)產(chǎn)品、紡織品、食品和其他工業(yè)產(chǎn)品的發(fā)霉變質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失；還有的真菌能產(chǎn)生毒素，使人畜中毒，黃曲霉（Aspergillus flavus）產(chǎn)生的黃曲霉素（alfatoxin）就是典型的真菌毒素，具有較強(qiáng)的致癌作用[2]。

試驗(yàn)?zāi)M水稻田環(huán)境，通過(guò)預(yù)設(shè)管道對(duì)稻田土壤進(jìn)行不同的通氣處理，研究在水稻栽培過(guò)程中不同通氣處理對(duì)土壤中絲狀真菌類(lèi)型的影響，以期對(duì)作物栽培過(guò)程中改善生態(tài)環(huán)境起指導(dǎo)作用。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試材料及試劑供試稻田土壤從湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院附近的水稻田采集。供試水稻品種為深兩優(yōu)876。試驗(yàn)試劑有DNA提取試劑盒、裂解緩沖液（0.4 mol/L Tris-HCl，0.06 mol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，1%SDS，pH值8.0）、變性液（3 mol/L KAc，pH值4.6）氯仿、異丙醇、TE緩沖液、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記物、瓊脂糖、1×電泳緩沖液TBE、6×樣品緩沖液、溴化乙錠等。土壤中真菌采用土豆固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2儀器設(shè)備培養(yǎng)皿、封口膜、試管、移液槍、錐形瓶、玻璃珠、恒溫培養(yǎng)箱、載玻片、顯微鏡、試管架、酒精燈、超凈工作臺(tái)、鑷子、接種環(huán)、PCR儀、冷凍離心機(jī)、研缽、吸水紙、水平板電泳槽、灌膠模具及梳齒、電泳儀、水浴鍋等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1通氣處理（1）水稻種子催芽。將超級(jí)水稻種子放入培養(yǎng)皿中，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中浸水培養(yǎng)5～6 d，期間每天早晚?yè)Q水一次，直到水稻種子長(zhǎng)出白色新芽。（2）移栽。將帶芽水稻種子移栽至稀泥中，長(zhǎng)出水稻苗后轉(zhuǎn)移到玻璃大棚中進(jìn)行栽培，并采用不同的方式對(duì)水稻土壤進(jìn)行通氣，詳見(jiàn)表1。

表1　水稻培養(yǎng)中采用的不同通氣條件

1.2.2取樣取樣的時(shí)間為上午8:00～10:00，取距離土壤表面5 cm，靠近根部的土壤約10 g，并標(biāo)記編號(hào)。

1.2.3典型代表菌種的挑選分離土壤中的微生物后選擇其中的絲狀真菌進(jìn)行純化。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后，培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落，根據(jù)菌落特征，初步判斷屬于何種類(lèi)型的微生物，若菌體形態(tài)一致，則可認(rèn)為是初步分離到純菌種。將分離培養(yǎng)所得的純絲狀真菌菌種，從平板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到試管斜面培養(yǎng)基上，保存?zhèn)溆?。觀察并記錄菌種的保存與生長(zhǎng)狀況[3]。

1.2.4真菌總DNA的提取及ITS序列克隆測(cè)序（1）提取。參照何水林[4]的方法提取真菌總DNA。（2）ITS序列擴(kuò)增。選用ITS通用引物[5]（ITS1：5'-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3'，由華大基因公司合成）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μL）：引物（100 μmol/L）1 μL，模板1 μL，Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序：95℃，3 min；94℃，1 min，54℃，45 s，72℃，45 s；35個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。PCR產(chǎn)物于4℃保存。（3）PCR產(chǎn)物電泳。配制1%瓊脂糖凝膠，PCR產(chǎn)物上樣后在100 V恒壓下電泳20 min。電泳完成后，于凝膠成像系統(tǒng)中觀測(cè)是否獲得大小相當(dāng)?shù)哪康钠蝃6]。（4）目的片段回收及測(cè)序。按何水林[4]的方法回收目的片段，送華大科技公司測(cè)序。

1.2.5生物信息學(xué)分析將測(cè)序結(jié)果與BLAST核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，在所得分類(lèi)報(bào)告的結(jié)果中取得分最高的序列（相似度均超過(guò)99%）作為種屬鑒定參照序列，供試真菌樣品的種屬分類(lèi)按參照序列確定，以此構(gòu)建出 11種絲狀真菌ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

圖1　各菌種的表觀特征

2　結(jié)果與分析

2.1不同通氣處理對(duì)水稻土中真菌類(lèi)型的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，除T2和T8處理以外，其他處理均分離得到1種或2種絲狀真菌。其中，T3、T5、T7、T9和CK處理分別得到1種真菌，編號(hào)分別為M11、M2、M6、M4和M8；而T1、T4、T6處理均分離得到兩種真菌，編號(hào)分別為M7和M9、M1和M3、M5和M10。各真菌表觀特征如圖1所示，經(jīng)初步鑒定，M1～M11分別為煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）、黃曲霉菌（Aspergillus flavus）、煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）、M4 草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）、枝孢菌菌（Cladosporium）、煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）、芽枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）、桔青霉素菌（Penicillium citrinum）、尖孢枝孢霉菌 （Cladosporium oxysporum）、鏈霉菌（Streptomyces）和棘孢曲霉菌（ Aspergillus aculeatus）。

2.2各菌種ITS序列克隆結(jié)果

由于試驗(yàn)克隆的是絲狀真菌的ITS序列，而真菌ITS區(qū)域長(zhǎng)度一般在650～750 bp，因此采用1%濃度的凝膠分離得出了比較理想的效果。PCR擴(kuò)增后，所有樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳顯示均能擴(kuò)增出目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物大小在500～750 bp之間（圖2），可以看出目的條帶非常清晰，所有真菌通過(guò)PCR擴(kuò)增出來(lái)的DNA樣品的目標(biāo)帶都一致，且分子量大小相近，11個(gè)樣品都比較干凈，雜帶和降解現(xiàn)象都不明顯。因此可以初步斷定該方法可行，擴(kuò)增產(chǎn)物可用于序列測(cè)定。

圖2　各菌種PCR產(chǎn)物的凝膠電泳（1～11分別為M1～M11的PCR產(chǎn)物）

2.3ITS序列序列生物信息學(xué)分析

根據(jù)BLAST核酸數(shù)據(jù)庫(kù)所得分類(lèi)報(bào)告的結(jié)果，取每個(gè)報(bào)告中得分最高的序列（相似度均超過(guò)99%）作為種屬鑒定參照序列，供試真菌樣品的種屬分類(lèi)按參照序列確定，分類(lèi)結(jié)果如表2所示。

2.4各菌種的發(fā)育系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

表2　各菌株的序列比對(duì)結(jié)果及其種屬鑒定分析

構(gòu)建出11種絲狀真菌ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3），系統(tǒng)關(guān)系圖顯示分離出的絲狀真菌的親緣關(guān)系比較接近，只有M10與其他的絲狀真菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)遺傳距離可以將11個(gè)菌株分為 3個(gè)類(lèi)群。

圖3　絲狀真菌菌株系統(tǒng)關(guān)系圖

其中，M1、M2、M3、M4、M6、M8、M11為同一類(lèi)群——A群。種屬鑒定分析顯示：M1、M2、M3、M6、M11為曲霉屬，M4、M8為青霉屬，青霉屬和曲霉屬同屬于曲霉科的常見(jiàn)屬，區(qū)別僅僅是：曲霉屬的孢子梗是輻射狀排列，呈頭狀，分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，一般呈球形，頂囊表面長(zhǎng)滿一層或兩層輻射狀小梗（初生小梗與次生小梗），最上層小梗瓶狀，頂端著生成串的球形分生孢子；而青霉屬分生孢子成帚狀，從菌絲體伸向空中，各頂端的小梗產(chǎn)生鏈狀的青綠—褐色的分生孢子，分生孢子頂端無(wú)膨大。圖3中顯示同屬于煙曲霉的M1、M3、M6親緣關(guān)系最近，而屬于棘孢曲霉菌的M11親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

M5、M7、M9為同一類(lèi)群——B群，種屬鑒定分析顯示M5為枝孢霉菌，M7為芽枝狀枝孢菌，M9為尖孢枝孢霉菌，都為枝孢霉屬，親緣關(guān)系非常接近。枝孢菌能夠產(chǎn)生分生孢子，是暗色孢科的一種，室內(nèi)和室外都比較常見(jiàn)，顏色為深綠色，因此經(jīng)常與曲霉菌弄混。其實(shí)，枝孢菌與曲霉菌的區(qū)別主要在于枝孢菌的菌絲也帶有顏色，菌落整體呈現(xiàn)深色。

M10單獨(dú)為一類(lèi)群——C群，通過(guò)種屬鑒定分析為鏈霉菌，鏈霉菌屬有發(fā)育良好的分枝菌絲，菌絲無(wú)橫隔，分化為營(yíng)養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、孢子絲。營(yíng)養(yǎng)菌絲又名基內(nèi)菌絲，色淺，較細(xì)，具有吸收營(yíng)養(yǎng)和排泄代謝廢物的功能；氣生菌絲是顏色較深、直徑較粗的分枝菌絲；氣生菌絲成熟分化成孢子絲，孢子絲再形成分生孢子。鏈霉菌是最高等的放線菌，不屬于真菌，因此與其他10種菌的親緣關(guān)系非常遠(yuǎn)。

由以上分析可將不同通氣條件下絲狀微生物分為兩大類(lèi)：真菌和放線菌。其中絲狀真菌又包含曲霉和枝孢霉兩類(lèi)。

3　討　論

rNDA-ITS序列分析可以初步斷定不同通氣條件下，土壤中絲狀真菌的大致分類(lèi)地位，分析結(jié)果顯示各真菌的親緣關(guān)系比較接近，絕大多數(shù)都屬于叢梗孢目下的分支。這一結(jié)果表明叢梗孢目微生物可能是通氣土壤中真菌微環(huán)境構(gòu)成要素。試驗(yàn)分離得到的絲狀真菌對(duì)動(dòng)物、植物都有不同程度的危害。

（1）煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）：該菌為致病菌，能引起人、畜和禽類(lèi)的肺曲霉病及其他疾病，可侵染棉鈴和蘋(píng)果等，引起果實(shí)腐爛，或?qū)㈡咦蛹牟赜诜N子上引發(fā)棉鈴曲霉病等[7-8]。

（2）黃曲霉菌（Aspergillus flavus）：該菌的主要危害在于其代謝產(chǎn)物——黃曲霉毒素。研究表明，除了致癌作用以外，黃曲霉毒素的毒性作用主要與抑制蛋白質(zhì)合成有關(guān)，其分子結(jié)構(gòu)中的雙呋喃環(huán)是產(chǎn)生毒性的主要原因；另外，黃曲霉毒素的細(xì)胞毒作用主要是干擾信息RNA和DNA的合成，進(jìn)而干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致動(dòng)物全身性損害[9]。因此，我國(guó)規(guī)定大米、食用油中黃曲霉毒素允許量標(biāo)準(zhǔn)為10 μg/kg，其他糧食，豆類(lèi)及發(fā)酵食品為5 μg/kg，嬰兒代乳食品不得檢出。

（3）青霉菌（Penicillium）：該菌代謝產(chǎn)物青霉素是抗菌素的一種，含有青霉烷，能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用，是第一種能夠治療人類(lèi)疾病的抗生素。

（4）枝孢菌（Cladosporium）：枝孢菌不會(huì)產(chǎn)生任何對(duì)人體的直接毒素，但是枝孢菌孢子是一種廣泛的過(guò)敏原，會(huì)引發(fā)哮喘病人發(fā)作或有類(lèi)似呼吸系統(tǒng)疾病患者的過(guò)敏反應(yīng)；另外某些枝孢屬菌種可以引起人類(lèi)感染，如枝狀枝孢可引起皮膚暗色絲孢霉病，多主枝孢可引起著色芽生菌病和皮膚暗色絲孢霉病等[10]。

綜上所述，在水稻種植過(guò)程中對(duì)土壤采取不同的通氣處理，可影響土壤中的微生物類(lèi)型，進(jìn)而對(duì)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生一定影響。其中，白天通氣產(chǎn)生的真菌比晚上通氣產(chǎn)生的真菌數(shù)量少；一日通氣兩次比一日通氣一次和兩日通氣一次產(chǎn)生的真菌少；灌漿期使用H2O2處理會(huì)使產(chǎn)生的絲狀真菌變多。其他時(shí)期，如移栽前和分蘗期用H2O2處理對(duì)水稻的影響不大。因此，對(duì)水稻栽培最有益的通氣方式為：白天采用排氣量50 L/min的空氣泵通過(guò)土壤中事先埋設(shè)的PVC塑料軟管向土壤根際輸氣4 min，輸氣時(shí)間采用定時(shí)器確定在每天8:00，17:00；同時(shí)，可在移栽前和分糵期采用同樣的空氣泵通過(guò)土壤中埋設(shè)的PVC塑料軟管向土壤根際輸入0.3‰的H2O2。

[1] 李 元，牛文全，張明智，等. 加氣灌溉對(duì)大棚甜瓜土壤酶活性與微生物數(shù)量的影響[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2015，（8）：121-129.

[2] 周德慶. 微生物學(xué)教程[M]. 北京：高等教育出版社，2011.

[3] 周德慶. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 北京：高等教育出版社，2006.

[4] 何水林. 基因工程[M]. 北京：科學(xué)出版社，2008.

[5] 陳劍山. ITS序列分析在真菌分類(lèi)鑒定中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（13）：3785-3786，3792.

[6] 王金婷. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 武漢：華中科技大學(xué)出版社，2010.

[7] 劉 華，賀湘玲. 侵襲性曲霉菌感染現(xiàn)狀及實(shí)驗(yàn)室研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)臨床研究，2014，（11）：2262-2264.

[8] 史先英，韓宏分. 棉花鈴病的發(fā)生及其防治對(duì)策[J]. 中國(guó)棉花，2007，（2）：28.

[9] 趙玲玲 都啟晶 王世清，等. 黃曲霉毒素B_1的等離子體降解產(chǎn)物的急性毒性研究[J]. 食品科技，2016，（1）：325-330.

[10] 張中義，秦 蕓. 6種枝孢菌病害研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，（4）：315-319.

（責(zé)任編輯：成平）

Effects?of?Different?Ventilation?Conditions?on?Filamentous?Fungi?Type?in?Soil

XIA Yu
（College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Took the paddy soil as material， treated with different ventilation conditions and 11 strains were screened by dilution coating plate method; cloning and sequence (ITS sequence) of these strains were amplified， sequenced and analyzed， and phylogenetic tree was established to identify the species of these strains. The results showed that the 11 strains were divided into fungi and actinomycetes， and filamentous fungi were divided into two groups: Aspergillus and Cladosporium， among them， the genetic relationship of the genus and Aspergillus was the closest. From the results of treatment effects of filamentous fungi type in the soil， the most beneficial ventilation method for rice was twice during the day， transplanting and tillering stage bubbled into 0.3 ‰ of H2O2.

filamentous fungi; paddy soil; IST sequence analysis; phylogenetic tree

S154.38

A

1006-060X（2016）10-0052-04

2016-06-29

夏 宇（1981-），男，湖南湘陰縣人，碩士研究生，研究方向：生物工程。