林蛙頭多糖的提取工藝優(yōu)化及其降血脂功能1)

姜麗冬 田海娟 代偉長 金鑫 樸春紅 王玉華 劉俊梅 胡耀輝 于寒松

(吉林農(nóng)業(yè)大學，長春，130118)

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林蛙頭多糖的提取工藝優(yōu)化及其降血脂功能1)

姜麗冬 田海娟 代偉長 金鑫 樸春紅 王玉華 劉俊梅 胡耀輝 于寒松

(吉林農(nóng)業(yè)大學，長春，130118)

采用生物酶法提取林蛙頭多糖，應用響應面法對提取工藝進行了優(yōu)化，分析了提取物對大鼠降血脂的功效。結果表明：林蛙頭多糖最佳提取工藝參數(shù)為：酶解溫度55 ℃、加酶量2%、林蛙頭水溶液質(zhì)量濃度1∶10 g/mL、酶解時間4.5 h、pH=10.0，此條件下林蛙頭多糖得率最高為4.3%；高脂模型大鼠降血脂試驗結果顯示，林蛙頭多糖能明顯降低高脂模型大鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)質(zhì)量濃度，提高血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)質(zhì)量濃度，對高脂大鼠具有顯著的降血脂作用。

林蛙；林蛙頭多糖；提取工藝；血脂

We extracted the polysaccharides ofRanachensinensishead by ultrasonic assisted enzymatic hydrolysis, optimized the extracting technique with response surface method, and studied the hypolipidemic effects of polysaccharides on rat serum lipids. The optimum technological conditions were the temperature of 55 ℃, 2% of enzyme concentration, solid-liquid ratio of 1∶10, hydrolysis time of 4.5 h, pH of 10.0, and the polysaccharides ofR.chensinensishead yield of 4.3%. The results of hyperlipidemia rats indicated that polysaccharides ofR.chensinensishead could significantly lower the concentration of TC, TG and LDL-C, but significantly improve the concentration of HDL-C, and the crude extract of polysaccharides could significantly lower blood lipid of hyperlipidemia rats.

中國林蛙是棲息于長白山深林中珍貴的兩棲類野生經(jīng)濟動物，經(jīng)傳統(tǒng)中醫(yī)論證和現(xiàn)代營養(yǎng)學研究證實，食用林蛙具有鎮(zhèn)咳祛痰、抗疲勞、增強機體免疫功能、抗脂質(zhì)過氧化等作用[1-2]。中國林蛙的常規(guī)食用部位包括林蛙卵、林蛙油、林蛙肉、林蛙皮等，目前多以林蛙油為研究和開發(fā)對象，而以林蛙頭和林蛙骨肉等副產(chǎn)物為原料的開發(fā)利用相對較少[3-9]。不但導致對被摘除蛙油的雌性林蛙利用率低，而且導致雄性林蛙加工數(shù)量與雌性比相對很少；造成資源的極大浪費，導致林蛙生態(tài)失衡。

多糖(Polysaccharide)又稱多聚糖，具有多種生物功能，如抗炎、抗腫瘤、降血脂等[10-15]，其中大部分多糖存在于植物和微生物中，而動物中一般含量較少，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的動物多糖都具有特殊功能，黃林清等[16]通過對蠶蛹多糖的研究發(fā)現(xiàn)，蠶蛹多糖具有增強B、T淋巴細胞的增殖作用，增強小鼠的免疫功能。孫楠楠等[17]研究發(fā)現(xiàn)，烏賊墨汁多糖具有清除DPPH自由基和羥基自由基的作用，且具有較強的Fe3+還原能力，說明其具有抗氧化能力。姚曉燕等[18]研究表明，質(zhì)量分數(shù)為27 mg/kg的黃鱔骨硫酸軟骨多糖可以抑制小鼠甘油三酯(TG)質(zhì)量濃度的升高，并能降低高脂小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和總膽固醇(TC)質(zhì)量濃度。

林蛙多糖的提取有高壓脈沖電場提取、堿法提取、酶法提取等，前者由于成本高很難用于工業(yè)化生產(chǎn)；后兩者提取成本相對較低，有較好的產(chǎn)業(yè)化前景。林蛙多糖的提取，多集中于林蛙皮和整只林蛙，對林蛙頭多糖的提取報道較少。本研究采用酶法提取林蛙頭多糖，以期獲得多糖的高提取率，并進一步對多糖粗提物的降脂功效進行研究，旨在提高林蛙的綜合利用率，為林蛙資源高效利用提供參考。

1 材料與方法

冰鮮林蛙頭，吉林省長白山生態(tài)食品有限公司提供；體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在的大鼠(SPF)級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，雄性，60只，由吉林大學白求恩醫(yī)學院動物實驗中心提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)2013-0001]；堿性蛋白酶(2.4 L FG)，丹麥諾維信公司；TC試劑盒、TG試劑盒、HDL-C試劑盒、LDL-C試劑盒，均購自上?？迫A生物工程股份有限公司。

儀器設備：infinitieM200酶標儀，NanoQuant；FE20K pH計，瑞士梅特勒；Z36HK型高速離心機，德國HERMLE公司；PE52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；獅鼎牌循環(huán)水真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FD-1B50型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康儀器有限公司；UV-1700型分光光度計，日本島津。

林蛙頭多糖的提取工藝：林蛙頭于60 ℃低溫烘干至恒質(zhì)量后粉碎，加3倍體積石油醚，50 ℃索氏抽提脫脂12 h后，40 ℃烘干備用。以脫脂后的林蛙干燥粉為原料酶法提取多糖；提取后95 ℃滅酶10 min，抽濾、減壓濃縮，加入5倍體積95%乙醇溶液沉淀、離心；按一定體積比加入Sevag試劑反復脫蛋白6次，直至溶液中無變性蛋白層；將上清液減壓濃縮，加入3倍體積95%乙醇沉淀12 h，用蒸餾水溶解，裝入分子截流量為8 000～14 000的透析袋中透析24 h，冷凍干燥后制得粗多糖。

林蛙頭多糖提取單因素試驗：按照酶生產(chǎn)廠家提供的最適作用溫度55 ℃為酶水解溫度，通過單因素試驗研究了林蛙頭水溶液質(zhì)量濃度、酶解時間、加酶量、pH對林蛙頭多糖提取率的影響。①選擇林蛙頭水溶液質(zhì)量濃度分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL，加酶量2%(酶和底物的質(zhì)量比)、酶解時間4 h、pH=10.0；②按照林蛙頭水溶液質(zhì)量濃度為1∶10 g/mL制備林蛙頭水溶液，加酶量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，其他條件同①；③加酶量2%，酶解時間分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，其他條件同②；④酶解時間4.5 h，pH為8.5、9.0、9.5、10.0、10.5，其他條件同③。按照4種方案分別研究不同條件對林蛙頭多糖得率的影響。

林蛙頭多糖提取響應面試驗：在單因素試驗基礎上，選取料液比、酶解時間、加酶量、pH值4個因素，以林蛙頭多糖提取率為指標進行響應面試驗(見表1)，優(yōu)化多糖提取工藝，通過Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。

表1 提取林蛙頭多糖Box-Behnken試驗因素與水平

釆用Bradford法，以牛血清白蛋白為標準品，測定粗多糖樣品中的總蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)[19]。

數(shù)碼是基于一個由無限重復的抽象物構建的體系，在那里，原件和它的副本沒有區(qū)別：模擬物則衰老與腐朽，經(jīng)歷時代而逐漸消失，變幻著它的聲音、它的面貌、它的氣味。在模擬的世界里，一張照片的翻拍照片總意味時代遷移，變得失真，有所不同；一張數(shù)碼照片的數(shù)碼照片則無從分辨，于是“原作”失去了意義。[1]4

采用苯酚-硫酸法測定多糖質(zhì)量分數(shù)，以葡萄糖為標準品制作標準曲線。取適量分析純葡萄糖置于鼓風干燥箱中80 ℃干燥至恒質(zhì)量，冷卻后準確稱取100 mg葡萄糖于500 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度。反應體系各溶液體積按表2添加，先將標準葡萄糖溶液加入到具塞刻度試管中，再加入6%(按體積計)的苯酚溶液，最后加入10 mL濃硫酸混勻靜置，待其冷卻后于490 nm處測定吸光度，每組3個平行。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度(490 nm時)為縱坐標繪制標準曲線。得線性回歸方程為：y=0.855 5x+0.064 5，R2=0.995。同法測得林蛙多糖水溶液于波長490 nm處的吸光度，通過回歸方程計算樣品中多糖的質(zhì)量分數(shù)，提取率=(提取的多糖質(zhì)量/林蛙頭粉中多糖質(zhì)量)×100%。

表2 苯酚-硫酸法標準曲線繪制

高脂飼料中各組分質(zhì)量百分比為：基礎飼料78.8%、豬油10.0%、蛋黃10.0%、膽固醇1.0%、膽鹽0.2%，混合均勻后制成顆粒并置于通風干燥處待用。大鼠自由攝食高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)30 d。實驗前大鼠自由攝食飲水，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為6組，每組10只。①正常對照組，飼喂普通飼料，灌胃生理鹽水；②高脂模型對照組，飼喂高脂飼料，灌胃生理鹽水；③陽性對照組，飼喂高脂飼料，灌胃洛伐他汀2 mg·kg-1·d-1；④林蛙頭多糖低劑量組，飼喂高脂飼料，灌胃林蛙多糖200 mg·kg-1·d-1；⑤林蛙頭多糖中劑量組，飼喂高脂飼料，灌胃林蛙多糖400 mg·kg-1·d-1；⑥林蛙頭多糖高劑量組，飼喂高脂飼料，灌胃林蛙多糖600 mg·kg-1·d-1。喂養(yǎng)條件為每天光照時間12 h、溫度控制在(20±2)℃、濕度(50±5)%。每周稱量大鼠體質(zhì)量1次。30 d后處死大鼠，取血37 ℃放置1 h、4 ℃放置2 h，再于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，制備血清，-20 ℃保存。按照試劑盒說明書要求，測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的質(zhì)量濃度。

實驗結果采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，用單因素方差分析組間差異的顯著性。

2 結果與分析

2.1 林蛙頭多糖提取工藝條件單因素試驗

試驗結果表明：①不同質(zhì)量濃度林蛙頭水溶液對林蛙頭多糖得率的影響較大。質(zhì)量濃度為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL時，林蛙頭多糖得率分別為2.80%、2.60%、2.50%、2.40%、2.45%。當質(zhì)量濃度為1∶10 g/mL時，林蛙頭多糖得率最，本實驗質(zhì)量濃度選擇1∶10 g/mL。②隨著加酶量的增多，林蛙頭多糖得率呈增加趨勢。加酶量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時，多糖提取率分別為2.60%、2.70%、2.90%、2.92%、2.92%，當加酶量為2%時，多糖提取率達到2.9%，繼續(xù)增加酶量，多糖得率增加不明顯，因此本實驗選擇適宜加酶量為2.0%。③隨著酶解時間的延長，多糖提取率呈顯著增加趨勢。酶解時間為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h時，多糖提取率分別為2.35%、2.50%、2.85%、2.96%、2.90%。當酶解時間達到4.5 h時，多糖提取率達到最大，因此選擇最適酶解時間為4.5 h。④隨著pH的升高，蛙頭多糖得率也隨之增大。pH為8.5、9.0、9.5、10.0、10.5時，多糖提取率分別為2.64%、2.70%、2.81%、2.98%、2.91%。當pH為10.0時多糖提取率最大，因此適宜pH選擇10.0。

2.2 響應面法優(yōu)化林蛙頭多糖提取工藝條件

對表3試驗結果進行統(tǒng)計學分析，4個因子經(jīng)過擬合得到的二次回歸方程為：Y=4.38+0.37A-0.017B-0.16C-0.050D-0.43AB-0.55AC-0.55AD+0.48BC+0.25BD+0.65CD-0.81A2-0.023B2+0.014C2-0.77D2。

根據(jù)Design Expert8.0.6軟件分析可得響應面的3D圖和等高線圖(見圖1)。經(jīng)分析可知，提取林蛙頭多糖的最佳條件是：在酶解溫度為55 ℃的條件下，林蛙頭水溶質(zhì)量液濃度為1∶13 g/mL、酶解時間為4.4 h、加酶量1.95%、pH為10.0，此時林蛙頭多糖提取率為4.3%。為驗證模型的準確性，在最佳提取工藝條件下多糖提取率為4.42%，與預測值相近，表明響應面法所得的模型準確可靠。

2.3 林蛙頭多糖對大鼠體質(zhì)量的影響

由表5可見：各劑量組分別與空白對照組、模型對照組、藥物陽性對照組比較，大鼠體質(zhì)量隨著飼喂時間的延長，均呈現(xiàn)上升趨勢，其中陽性對照組、低劑量組、中劑量組體質(zhì)量上升趨勢低于模型對照組，但以上3組大鼠在飼喂過程中皮毛光滑、生理狀態(tài)未出現(xiàn)異常，表明林蛙頭多糖對大鼠沒有毒副作用。

表3 提取林蛙頭多糖Box-Behnken試驗設計與結果

表4 提取林蛙頭多糖響應面模型方差分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)；** 表示差異極顯著(P<0.01)。

2.4 林蛙頭多糖對大鼠血清脂質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

由表6可見：4種血清指標中，模型對照組均與空白對照組具有極顯著差異(P<0.01)，說明高脂模型建模成功。陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組與模型組相比，可降低高脂血癥大鼠的TC、TG指標，其中陽性對照組、低劑量組與模型對照組在TC、TG兩個指標中差異極顯著(P<0.01)，TC指標中，低劑量組和中劑量組與模型對照組具有極顯著差異(P<0.01)；HDL-C和LDL-C指標中，陽性對照組和各劑量組均有不同程度的升高，其中HDL-C指標中，中劑量組與模型對照組具有顯著差異(P<0.05)，高劑量組與模型對照組具有極顯著差異(P<0.01)；在LDL-C指標中，陽性對照組、低劑量組、高劑量組對模型組具有極顯著關系(P<0.01)。由此可知，林蛙頭多糖粗提物，可通過降低大鼠血清中TC、TG和LDL-C的質(zhì)量濃度以及升高HDL-C質(zhì)量濃度發(fā)揮其調(diào)節(jié)血脂的功效。

(1)為林蛙頭水溶液質(zhì)量濃度與酶解時間的響應面和等高線圖；(2)為林蛙頭水溶液質(zhì)量濃度與加酶量的響應面和等高線圖；(3)為林蛙頭水溶液質(zhì)量濃度與pH的響應面和等高線圖。

圖1 響應面法優(yōu)化林蛙頭多糖提取工藝的響應面和等高線圖

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標準差”，n=10。

表6 林蛙頭多糖對血清脂質(zhì)質(zhì)量濃度的影響

g·L-1

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標準差”。與空白對照組比較，▲▲ 表示P<0.01；與模型對照組比較，** 表示P<0.01、*表示P<0.05。

3 結論

本文以取油后的林蛙頭為原料，采用堿性蛋白酶水解法對其多糖的提取工藝條件進行優(yōu)化，并通過體內(nèi)實驗研究林蛙頭多糖對高脂模型大鼠的降血脂作用。結果表明：林蛙頭多糖的最佳提取工藝為：酶解溫度55 ℃、加酶量2%、林蛙頭水溶液質(zhì)量濃度1∶10 g/mL、酶解時間4.4 h、pH值9.5，此時林蛙頭多糖的提取率最高為4.3%；林蛙頭多糖能顯著降低高脂模型大鼠血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)質(zhì)量濃度，提高血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的質(zhì)量濃度，表明林蛙頭多糖具有良好的調(diào)節(jié)血脂功效。

[1] 劉仁杰，孫旸，王剛，等.中國林蛙產(chǎn)品的開發(fā)現(xiàn)狀與研究進展[J].糧油加工(電子版)，2014，12：72-75.

[2] 丁保金，金麗琴，呂建新.多糖的生物活性研究進展[J].中國藥學雜志，2004，39(8)：561-564.

[3] 王戰(zhàn)勇，李寧，蘇婷婷.中國林蛙皮抗菌肽的提取純化及抑菌活性檢測[J].食品科學，2010，31(3)：132-135.

[4] IWAKOSHI-UKENA E， UKENA K， OKIMOTO A， et al. Identification and characterization of antimicrobial peptides from the skin of the endangered frogOdorranaishikawae[J]. Peptides，2011，32(4)：670-676.

[5] 趙桂華，梁悅，王宇，等.中國林蛙肉的營養(yǎng)成分分析與評價[J].營養(yǎng)學報，2007，29(6)：623-624.

[6] 李妍妍，鄭衛(wèi)星，王日昕，等.林蛙營養(yǎng)成分的多元分析[J].食品科學，2007，28(12)：472-475.

[7] 陳曉平，崔敬愛，胡耀輝.林蛙油主要營養(yǎng)成分的研究[J].食品科學，2005，26(8)：361-363.

[8] 王彬彬，張文革，夏艷潔.中國林蛙腿肉的營養(yǎng)成分分析與評價[J].經(jīng)濟動物學報，2012，16(2)：89-93，118.

[9] 孫建忠，王玉華，于寒松，等.雙酶法制備林蛙油小分子肽的研究[J].食品科學，2008，29(11)：408-412.

[10] XIN H， TIAN J W， YU Z Q， et al.Laminariajaponicapolysaccharide reduces lipids and leptin levels in hyperlipedemic mice[J]. Basic Research Journal of Medicine and Clinical Sciences，2013，2(2)：22-26.

[11] LUO Q， CAI Y Z， YAN J， et al. Hypoglycemic and hypolipidemic effects and antioxidant activity of fruit extracts fromLyciumbarbarum[J]. Life Sciences，2004，76(2)：137-149.

[12] MA M， LIU G H， YU Z H， et al. Effect of theLyciumbarbarumpolysaccharides administration on blood lipid metabolism and oxidative stress of mice fed highfat diet in vivo[J]. Food Chemistry，2009，113(4)：872-877.

[13] 張彥民，李寶才，朱利平，等.多糖化學及其生物活性研究進展[J].昆明理工大學學報(理工版)，2003，28(3)：140-145，149.

[14] LI H F， XU J， LIU Y M， et al. Antioxidant and moisture-retention activities of the polysaccharide fromNostoccommune[J]. Carbohydrate Polymers，2011，83(4)：1821-1827.

[15] CAI W R， XIE L L， CHEN Y， et al. Purification， characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea[J]. Carbohydrate Polymers，2013，92(2)：1086-1090.

[16] 黃林清，周世文，張詩平，等.蠶蛹多糖對小鼠免疫功能的影響[J].解放軍藥學學報，2002，18(1)：11-13.

[17] 孫楠楠，李和生，張麗媛，等.烏賊墨汁多糖的提取及抗氧化作用研究[J].食品科學，2011，32(22)：95-99.

[18] 姚曉燕.黃鱔骨硫酸軟骨素多糖降血脂功能研究[J].中國醫(yī)藥導報，2011，8(30)：31-33.

[19] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72(1/2)：248-254.

Optimizing Extraction and Hypolipidemic Effects of Polysaccharides from the Heads ofRanachensinensis//

Jiang Lidong, Tian Haijuan, Dai Weichang, Jin Xin, Piao Chunhong, Wang Yuhua, Liu Junmei, Hu Yaohui, Yu Hansong

(Jilin Agricultural University, Changchun 130118, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(10)：107-111.

Ranachensinensis; Polysaccharides ofRanachensinensishead; Extraction technology; Serum lipid

1)國家科技支撐計劃項目(2013BAD16B09)；吉林省重大攻關項目(20140203021NY)。

姜麗冬，女，1988年5月生，吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，博士研究生。E-mail：529116685@qq.com。

胡耀輝，吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，教授。E-mail：huyaohui@vip.163.com。

于寒松，吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，教授。E-mail：yuhansong@163.com。

2016年6月13日。

S718.62；S852.5

責任編輯：張 玉。