鴟鸮科27種鳥類COⅠ序列變異及系統(tǒng)發(fā)育分析

康慧丁鵬李波

(1.東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040；2.國家林業(yè)局野生動(dòng)植物檢測中心，哈爾濱，150040)

鴟鸮科27種鳥類COⅠ序列變異及系統(tǒng)發(fā)育分析

康 慧丁 鵬李 波1，2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040；2.國家林業(yè)局野生動(dòng)植物檢測中心，哈爾濱，150040)

鴟鸮科；

(1.Northeast Forestry University，Harbin，150040，China；2.State Forestry Administration Dectecting Center of Wildlife，Harbin，150040，China)

鴟鸮科(Strigidae)鳥類是一類適應(yīng)夜行性生活的猛禽，隸屬于鳥綱鸮形目(Strigiformes)。該科鳥類多棲息于森林中，主要捕食鼠類，處于食物鏈的頂層，對(duì)控制鼠害和維護(hù)生態(tài)平衡有著不可替代的作用[1-2]。目前鴟鸮科鳥類的種屬分類仍存在一些爭議[3]。例如，漁鸮屬(Ketupa)和雪鸮屬(Nyctea)是否應(yīng)并入雕鸮屬(Bubo)。漁鸮屬鳥類為大型鸮類，形態(tài)上與雕鸮相似，有學(xué)者將該屬并入雕鸮屬[4]。但鄭作新等基于漁鸮屬鳥類專一化的食性，以及跗跖部分甚至全部裸出，跖底具刺突等形態(tài)特征，認(rèn)為它應(yīng)為獨(dú)立于雕鸮屬外另一個(gè)屬[5]。但新近基于細(xì)胞色素B(Cytb)基因的系統(tǒng)發(fā)育研究則支持將它作為一個(gè)亞屬置于雕鸮屬內(nèi)[6-7]。類似的情況也出現(xiàn)在雪鸮屬。傳統(tǒng)分類學(xué)認(rèn)為它是一單型屬，下轄一單型種雪鸮(Nycteascandiaca)[5，8]。而基于線粒體和核DNA(Cytb和RAG-1基因)的系統(tǒng)發(fā)育研究也支持將它并入雕鸮屬[9]。

四川林鸮(Strixdavidi)是我國唯一特有的鸮類，分布區(qū)狹窄，包括青海省的班瑪，四川省的寶興、松潘和巴塘，甘肅省的蓮花山[10-11]。四川林鸮形態(tài)上與長尾林鸮(Strixuralensis)相似，曾長期被認(rèn)為是它的一個(gè)亞種(Strixuralensisdavidi)。20 世紀(jì) 90 年代后，學(xué)者們認(rèn)為青藏高原的抬升使得四川林鸮與長尾林鸮實(shí)現(xiàn)了完全的地理隔離，建議將四川林鸮列為一個(gè)獨(dú)立種[6-7，9，12-16]。國際鳥類聯(lián)盟(Bird Life International)還將四川林鸮列為易危種(vulnerable)。目前對(duì)于該物種的分類學(xué)的研究還甚少，僅見零星報(bào)道[11，16-19]。缺乏利用分子標(biāo)記將其與長尾林鸮及林鸮屬其他鳥類進(jìn)行綜合比較的研究。

DNA 條形碼是用于物種鑒別和進(jìn)化研究的線粒體 DNA部分序列，目前通用的是細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(cytochrome oxidase subunit I，CO I)基因648 bp片段[20-21]。CO I基因具有在保證物種間足夠變異的同時(shí)，種內(nèi)變異又相對(duì)保守，且很容易被通用引物擴(kuò)增等特點(diǎn)。已經(jīng)廣泛應(yīng)用于有爭議物種分類地位的重新認(rèn)定、發(fā)現(xiàn)新種和隱存種、重建物種和高級(jí)階元的演化關(guān)系、種群遺傳分析等領(lǐng)域[22]。目前也被廣泛應(yīng)用在許多鳥類，包括鸮形目鳥類的分子系統(tǒng)學(xué)研究中[19，23-30]。

通過測定中國產(chǎn)的紅角鸮(Otussunia)、雕鸮(Bubobubo)和長尾林鸮的CO I基因部分序列，結(jié)合 GenBank 中查詢整理的四川林鸮以及鴟鸮科其他鳥類的CO I基因序列，研究鴟鸮科10個(gè)屬27種鳥類CO I基因的變異及系統(tǒng)發(fā)育情況，為鴟鸮科鳥類的系統(tǒng)發(fā)育和分類提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所選19只中國產(chǎn)的鴟鸮科鳥類(紅角鸮4只、雕鸮2只、長尾林鸮13只)肌肉樣本均來自國家林業(yè)局野生動(dòng)植物檢測中心。同時(shí)從 GenBank 中下載鴟鸮科其他鳥類的CO I基因同源序列，去除同一產(chǎn)地相同序列，得到47條有效序列(表1)。為給系統(tǒng)發(fā)育分析提供外群，選擇中國產(chǎn)的金雕(Aquilachrysaetos)、松雀鷹(Accipitervirgatus)、灰背隼(Falcocolumbarius)肌肉樣本檢測CO I基因部分序列。

1.2 PCR擴(kuò)增與測序

肌肉樣本經(jīng)過初步處理后利用蛋白酶K消化，后用基因組DNA提取試劑盒(AxyPrep Biosciences，杭州)提取純化總DNA。PCR引物選擇BirdF1/BirdR1[28]擴(kuò)增CO I基因部分序列。PCR反應(yīng)在50 μL體系中進(jìn)行，包括10×PCR Buffer(Mg2+plus)、dNTP Mixture 2.5 mM、r Taq酶5 U(Takara，大連)、上下游引物各200 mmol/L和DNA模板50～100 ng。擴(kuò)增采用PE-9700型和2400型DNA擴(kuò)增儀(PE，美國)，反應(yīng)程序?yàn)?4℃/60 s，(94℃/60 s，47℃/45 s，72℃/1.5 min)×30 cycle，72℃/5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物置于1.5%的瓊脂糖凝膠上100 V穩(wěn)壓電泳45 min。紫外燈下切下目的條帶，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒純化回收后，將樣品送至哈爾濱博仕生物有限公司，采用原擴(kuò)增引物進(jìn)行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測序完成后，所得的每條序列利用DNAstar 軟件包中的 SeqMen 軟件進(jìn)行校對(duì)，結(jié)合測序峰圖，舍棄兩端低信號(hào)序列，對(duì)序列內(nèi)部位點(diǎn)進(jìn)行人工校對(duì)。將所得序列用軟件Clustal W進(jìn)行分析比對(duì)，確定變異位點(diǎn)及單倍型。利用MEGA 5.02基于Gamma分布的K2P模型(Kimura 2 parameter)計(jì)算序列間遺傳距離(自引導(dǎo)的重復(fù)數(shù)為1 000)[31]，統(tǒng)計(jì)鴟鸮科鳥類種內(nèi)變異最大值、種間變異最小值。

利用Mrmodeltest 2.3[32]依據(jù)AIC(Akaike Information Criterion)標(biāo)準(zhǔn)選擇最佳的核苷酸替換模型GTR+I+G，用MrBayes 3.1.2[33]基于該模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(BI)。主要參數(shù)包括：將Mcmc分析運(yùn)行2 000 000代，記錄每100代生成的樹，舍棄最先生成的25%的樹，并用剩余的樹根據(jù)50%多數(shù)原則統(tǒng)計(jì)各分支后驗(yàn)概率(posterior probabilities，PP)。為驗(yàn)證系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，利用PAUP 4.0b10[34]構(gòu)建MP(Maximum Parsimony)樹，且系統(tǒng)樹各分支的自舉檢驗(yàn)值(bootstrap)由1 000次重復(fù)檢驗(yàn)獲得。2種方法的系統(tǒng)發(fā)育分析都以金雕、松雀鷹、灰背隼CO I基因同源序列作為外群。

2 結(jié)果

2.1 鴟鸮科鳥類種內(nèi)和種間變異

實(shí)驗(yàn)測得19條長663 bp鴟鸮科鳥類(紅角鸮、雕鸮、長尾林鸮)CO I基因部分序列，經(jīng)分析為10個(gè)單倍型(表1)，以及3個(gè)外群的同源序列。結(jié)合GenBank中的鴟鸮科鳥類CO I基因序列，由于部分序列長度存在差異，取最大公約數(shù)后得到620 bp，數(shù)據(jù)處理最后得到鴟鸮科10個(gè)屬27種鳥類40個(gè)單倍型。經(jīng)計(jì)算，鴟鸮科鳥類種內(nèi)變異最大值和種間變異最小值如柱狀圖所示(圖1)。鴟鸮科鳥類種內(nèi)變異最大的是烏林鸮(Strixnebulosa)(2.47%)，顯著小于林鸮屬種間變異的最小值(不將四川林鸮視為獨(dú)立種時(shí)，灰林鸮(Strixaluco)與長尾林鸮間8.50%)。其中，例外的是四川林鸮，它與長尾林鸮的種間變異為1.10%～2.10%，其最小值小于長尾林鸮的種內(nèi)變異最大值(1.18%，如將四川林鸮視為長尾林鸮亞種，該值為1.28%)。雕鸮種內(nèi)變異最大值(0.79%)也顯著小于雕鸮屬種間變異的最小值(雪鸮與美洲雕鸮間7.99%)。角鸮屬種間變異最小的是日本領(lǐng)角鸮(Otussemitorques)與領(lǐng)角鸮(Otuslettia)間(0.80%)，雖顯著大于紅角鸮種內(nèi)變異的最大值(0.22%)，但小于林鸮屬和耳鸮屬內(nèi)部分種內(nèi)變異的最大值。

圖1 鴟鸮科鳥類種內(nèi)變異最大值和種間變異最小值Fig.1 Max.intraspecific variations and Min.interspecific variations in StrigidaeSa：灰林鸮Strix aluco；Su：長尾林鸮Strix uralensis；Sn：烏林鸮Strix nebulosa；Sd：四川林鸮Strix davidi；Osu：紅角鸮Otus sunia；Ose：日本領(lǐng)角鸮Otus semitorques；Ol：領(lǐng)角鸮Otus lettia；Bb：雕鸮Bubo bubo；Bs：雪鸮Bubo scandiaca；Bv：美洲雕鸮Bubo virginianus；Af：短耳鸮Asio flammeus；Ao：長耳鸮Asio otus

2.2 鴟鸮科鳥類系統(tǒng)發(fā)育樹

運(yùn)用2種方法構(gòu)建鴟鸮科27種鳥類系統(tǒng)發(fā)育樹，不同方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹除置信度不同外，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大致相同(圖2)。鴟鸮科27種鳥類各自的CO I基因單倍型都聚在一起。除美洲角鸮(Otusflammeolus)外(它與鷹鸮Ninoxscutulata聚為1支，BI樹置信度為91%，MP樹不存在該分支，遺傳距離分析也不支持該分支的存在)，26種鳥類的CO I基因單倍型都是同屬的優(yōu)先聚類。在林鸮屬中，四川林鸮與歐亞大陸分布(包括來自俄羅斯、挪威、瑞典、中國吉林)的長尾林鸮先聚為一支(BI樹和MP樹置信度分別為100%和93%)，然后是日本分布的長尾林鸮(BI樹和MP樹置信度均為100%)。與長尾林鸮親緣關(guān)系最近的是灰林鸮(BI樹和MP樹置信度分別為100%和84%)，然后是烏林鸮與褐林鸮(Strixleptogrammica)組成的小支(BI樹置信度為93%)，最后是橫斑林鸮(Strixvaria)和斑林鸮(Strixoccidentalis)組成的小支(BI樹置信度為96%)。在雕鸮屬4種鳥類中，最先分化出來的是毛腿漁鸮(Ketupablakistoni)(BI樹和MP樹置信度分別為97%和72%)，然后是雕鸮(BI樹和MP樹置信度分別為99%和55%)，最后是親緣關(guān)系較近的雪鸮與美洲雕鸮(Bubovirginianus)(BI樹和MP樹置信度分別為49%和55%)。

圖2 基于CO I基因單倍型構(gòu)建的鴟鸮科鳥類系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Bayesian phylogenetic tree of CO I gene sequences in Strigidae分支上的數(shù)字分別表示MP樹的自舉值和BI樹的后驗(yàn)概率(低于60%的數(shù)值沒有顯示)，*表示來自歐亞大陸的長尾林鸮、**表示來自日本的長尾林鸮，金雕(Ac H1)、松雀鷹(Av H1)、灰背隼(Fc H1)CO I基因同源序列作為外群

3 討論

通過對(duì)超過640種鳥類的研究，Hebert等提出鳥類DNA條形碼的閾值為 2.7%，即種內(nèi)個(gè)體間K2P遺傳距離應(yīng)小于 2.7%[27，30，35-36]。研究涉及的鴟鸮科27種鳥類種內(nèi)個(gè)體間K2P遺傳距離都符合該閾值。計(jì)算還得出日本領(lǐng)角鸮和領(lǐng)角鸮種間變異比較小，甚至小于林鸮屬和耳鸮屬內(nèi)部分種內(nèi)變異的最大值。盡管同屬的紅角鸮種內(nèi)最大變異也相對(duì)較小，但還是不能排除因單倍型數(shù)據(jù)太少而低估種間變異的可能性。另外，根據(jù)“10×規(guī)則”，即一個(gè)群體的差異超過平均種內(nèi)差異10倍[22，37]，雕鸮屬是符合該規(guī)則，而林鸮屬、角鸮屬、耳鸮屬均低于該規(guī)則(分別是3.4、3.6、5.2倍)。這可能與該規(guī)則的適應(yīng)性相關(guān)，且已有學(xué)者認(rèn)為在鳥綱中僅用單一的標(biāo)準(zhǔn)是不可行的[24，36]。

K?nig等[6-7]基于形態(tài)相近和利用線粒體Cytb基因重建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，認(rèn)為應(yīng)將漁鸮屬作為亞屬并入雕鸮屬?；贑O I基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，在雕鸮屬中4種鳥類的分化關(guān)系是：(毛腿漁鸮，(雕鸮，(雪鸮，美洲雕鸮)))，進(jìn)一步從遺傳學(xué)角度支持了上述觀點(diǎn)。此外，雪鸮全身羽毛白色，環(huán)北極地區(qū)分布，曾被認(rèn)為是單型屬[5，8]。而基于線粒體和核DNA重建的鸮形目鳥類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，認(rèn)為雪鸮與美洲雕鸮關(guān)系相近，二者的分歧時(shí)間發(fā)生在距今約四百萬年前，因此雪鸮屬也應(yīng)歸于雕鸮屬下的一個(gè)亞屬[9]。研究基于CO I基因的系統(tǒng)發(fā)育分析也得出了類似的結(jié)果。

四川林鸮的分類地位存在爭議：是獨(dú)立種還是長尾林鸮的一個(gè)亞種。K2P遺傳距離分析表明，四川林鸮與長尾林鸮的分歧小于長尾林鸮種內(nèi)的最大變異，明顯違背了DNA條形碼關(guān)于種的認(rèn)定規(guī)則[22，35，38]。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，四川林鸮處于日本與歐亞大陸分布的長尾林鸮之間。或者說相對(duì)于歐亞大陸長尾林鸮種群，日本的長尾林鸮較四川林鸮分歧更大。這進(jìn)一步證實(shí)，現(xiàn)有的研究支持將四川林鸮作為長尾林鸮的一個(gè)地理亞種。由于線粒體DNA是母系遺傳，單一CO I基因的分析、缺乏核基因的聯(lián)合分析，某種程度上弱化了上述分子證據(jù)。在青藏高原抬升后，四川林鸮逐步與大陸分布的長尾林鸮種群發(fā)生分化，其分類地位的最終確定還需要相關(guān)生態(tài)生物學(xué)及遺傳學(xué)方面的深入研究證據(jù)[39]。

致謝：樣品采集中，得到國家林業(yè)局野生動(dòng)植物檢測中心白素英、王震、馬躍老師的大力協(xié)助，在此表示衷心感謝!

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表1 鴟鸮科27種鳥類COⅠ基因序列

Tab.1 COⅠgene sequences of 27 species of Strigidae birds

Strigidae；

COI Sequence Variations and Phylogenetic RelationshipsAmong 27 Species of Strigidae Birds

Kang Hui1Ding Peng1Li Bo1，2*

In the taxonomy of the avian family Strigidae，there remain several controversial issues.For instance，should the generaKetupaandNycteabe incorporated into the genusBubo? ShouldStrixdavidiremain a species or should it be classified as a subspecies ofS.uralensis? mtDNA cytochrome oxidase subunit I(CO I)is an important gene in DNA barcoding and has widely been used for species identification and phylogenetic studies of birds.In this study we sequenced the CO I genes ofOtussunia，B.buboandS.uralensis from China.We used these sequences in combination with homologous sequences from GenBank to analyze the COI sequence variations and phylogenetic relationships of 27 species of the Strigidae.Interspecific variation was greater than intraspecific variation for most strigid species.Congeneric species were always clustered in phylogenetic analyses.Sequence variations and phylogenetic relationships supported the position thatKetupaandNycteabelong toBubo.With respect toS.uralensisin Eurasia，S.uralensisin Japan divided more than didS.davidi.The results of phylogenetic analysis confirmed thatS.davidiis a subspecies ofS.uralensis.This study provided new molecular evidence for defining phylogenetic relationships and revising the taxonomy of the Strigidae.

稿件運(yùn)行過程

2016-05-19

修回日期：2016-06-21

發(fā)表日期：2016-11-10

四川林鸮；

CO I基因；

遺傳距離；

系統(tǒng)發(fā)育

Strixdavidi；

COⅠgene；

Genetic distance；

Phylogeny

Q953

A

2310-1490(2016)04-351-06

鴟鸮科鳥類的種屬分類仍存在一些爭議。例如：漁鸮屬和雪鸮屬是否應(yīng)并入雕鸮屬，四川林鸮是一獨(dú)立種還是長尾林鸮的一個(gè)亞種？線粒體 DNA 中細(xì)胞色素 C 氧化酶亞基I(CO I)基因是 DNA 條形編碼的主要基因，被廣泛應(yīng)用于鳥類的物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究。通過測定中國產(chǎn)紅角鸮、雕鸮和長尾林鸮COⅠ基因的序列，并結(jié)合 GenBank中鴟鸮科鳥類的同源序列，本文對(duì)27 種鳥類進(jìn)行了序列變異和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示，鴟鸮科鳥類多數(shù)是種間變異大于種內(nèi)變異，該科鳥類幾乎都是同屬的優(yōu)先聚類。序列分歧和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果支持將漁鸮屬和雪鸮屬置于雕鸮屬下。同時(shí)，相對(duì)于歐亞大陸長尾林鸮種群，日本的長尾林鸮較四川林鸮分歧更大。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果也支持四川林鸮是長尾林鸮的一個(gè)亞種的觀點(diǎn)。研究為進(jìn)一步明晰鴟鸮科鳥類的系統(tǒng)發(fā)育和分類提供了新的分子證據(jù)。

東北林業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目資助(201410225071)

康慧，女，23歲，碩士研究生；主要從事野生動(dòng)物遺傳育種與繁殖技術(shù)研究。E-mail：1715636570@qq.com

*通訊作者：李波，E-mail：libo_770206@126.com