高效液相測(cè)定雞肉中糖皮質(zhì)激素的方法

李曉丹+張學(xué)青+馮靜+王娜+閆師杰

摘 要：優(yōu)化了雞肉中糖皮質(zhì)激素殘留的液相色譜分析方法。采用甲醇、二氧六環(huán)、乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）、乙酸乙酯做提取劑，提取樣品中的地塞米松與潑尼松龍，使用了10%乙腈/水和乙腈飽和的正己烷作為凈化劑，采用超聲分離法提取激素，通過(guò)液相色譜進(jìn)行分析。本試驗(yàn)研究了流動(dòng)相條件、體積流量、提取溶劑、凈化溶劑等條件對(duì)地塞米松和潑尼松龍這兩種目標(biāo)物檢測(cè)狀況的影響，確定最佳流動(dòng)相比例為30∶70，最佳體積流量為1 mL·min-1，最佳提取劑為乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）混合液，其加標(biāo)回收率達(dá)到98.3%。在雞肉樣品中，潑尼松龍的線(xiàn)性范圍為0.1～10 μg·L -1，RSD為0.1%，檢出限約為10 ng；地塞米松的線(xiàn)性范圍為0.5～10 μg·L -1，RSD為0.2%，檢出限約為10 ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均為0.99左右。

關(guān)鍵詞：液相色譜法；雞肉；地塞米松；潑尼松龍

中圖分類(lèi)號(hào)：Q95-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.013

Abstract ：The analysis method of chicken glucocorticoid residues by liquid chromatography was established in this paper. Methanol， dioxane， acetonitrile∶ water∶ formic acid （30∶70∶0.1） and ethyl acetate were used to extract the dexamethasone and prednisolone in samples. 10% acetonitrile/water and acetonitrile saturated n-hexane were used as purifying agent. Hormone has been extracted by ultrasonic separation method. The test solution has been analyzed by liquid chromatograph， using C18 chromatographic column separation and external standard method to quantify. This experiment focused on the effect of targets detection status of dexamethasone and prednisolone in terms of the mobile phase conditions， the volumetric flow， the extraction solvent， the purification solvents and other factors. So it was confirmed that the optimum mobile phase ratio was 30∶70， the optimal volumetric flow was 1 mL·min-1 and the best extraction agent is mixed liquor， acetonitrile∶ water∶ formic acid （30∶70∶0.1）， where the recovery rate has reached 98.3%. In the chicken samples， the linear range of prednisolone was 0.1～10 μg·L-1 and the RSD was 0.1% where the detection limit was about 10 ng； the linear range of dexamethasone was 0.5～10 μg·L-1and the RSD was 0.2% where the detection limit was about 10 ng， the relative standard deviation was about 0.99.

Key words： liquid chromatography； dexamethasone ； prednisolone； chicken

現(xiàn)代社會(huì)中畜牧業(yè)可以為人類(lèi)提供極其豐富的肉、禽、奶、蛋等畜產(chǎn)品，但隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)，畜產(chǎn)品中的藥物殘留污染已經(jīng)成為一大社會(huì)問(wèn)題，對(duì)人類(lèi)身體健康的公共衛(wèi)生造成了較大的危害[1]。有研究表明，人類(lèi)常見(jiàn)的癌癥、畸形、抗藥性、青少年早熟、中老年心血管疾病等問(wèn)題均與畜禽產(chǎn)品中的抗生素、激素等藥物的殘留有關(guān)[2]。其中，糖皮質(zhì)激素在醫(yī)學(xué)上可用于治療過(guò)敏、哮喘等疾病，合成糖皮質(zhì)激素如倍他米松、地塞米松等，具有很強(qiáng)的抗炎作用，在獸醫(yī)中被廣泛用于治療呼吸道、胃腸疾病等[3]。然而，很多不法分子在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下超量使用這些藥物以便縮短育肥期、降低飼料成本，或者給畜禽注射激素藥物，讓其增肥增重從而達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和提高瘦肉率的效果[4]。因此，各國(guó)對(duì)動(dòng)物源性食品中糖皮質(zhì)激素殘留量的檢測(cè)都十分重視。目前，測(cè)定食品中糖皮質(zhì)激素殘留的方法主要有氣相色譜法（GC）[5]、高效液相色譜法 （HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）等[2]。本試驗(yàn)利用高效液相色譜法對(duì)樣品前處理過(guò)程中雞肉中糖皮質(zhì)激素提取劑進(jìn)行了篩選，并優(yōu)化了高效液相色譜儀檢測(cè)條件，從而確定一種效率較高、準(zhǔn)確度較好的方法對(duì)糖皮質(zhì)激素進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 材 料

雞肉購(gòu)于天津市西青區(qū)紅旗農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品（Dexamethasone）和潑尼松龍標(biāo)準(zhǔn)品（Prednisolone）購(gòu)于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。endprint

1.2 方 法

1.2.1 雞肉中糖皮質(zhì)激素提取劑的選取 本試驗(yàn)分別選用了甲醇[4]、二氧六環(huán)[6]、乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）[7]和乙酸乙酯4種提取劑。分別稱(chēng)取地塞米松和潑尼松龍兩種糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并稀釋至每1 mL各含10 μg的溶液，制為混合標(biāo)液。

稱(chēng)量（2±0.05） g 樣品，加入分別含有10 μg·mL-1的地塞米松和潑尼松龍混合標(biāo)液，放置1 h使其充分滲透到雞肉中后進(jìn)行研磨[8]，并分別加入甲醇/二氧六環(huán)/乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）50 mL或乙酸乙酯20 mL，并轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，放入超聲震蕩儀中震蕩20 min，隨后進(jìn)行過(guò)濾，于40 ℃水浴鍋中水浴至干[9]。取出后，加5 mL提取劑溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至離心管，加入2 mL10%乙腈/水和2 mL經(jīng)乙腈飽和的正己烷，漩渦混合，靜置，待分層后取下層溶液15 000 r·min-1離心5 min[10]，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率最高的提取劑為試驗(yàn)選用的最優(yōu)提取劑。

1.2.2 液相色譜檢測(cè)條件的確定 （1）流動(dòng)相比例的確定。本試驗(yàn)所用液相色譜為Agilent 6300，色譜條件采用Thermo BDS Hypersil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 0.1%甲酸的水溶液作為流動(dòng)相A，以乙腈作為流動(dòng)相B，柱溫箱溫度35.0 ℃[11]，檢測(cè)器波長(zhǎng)范圍200 ～ 240 nm[9]，帶寬4 nm，進(jìn)樣量20.0 μL，分別對(duì)流動(dòng)相比例A∶B為80∶20、A∶B為70∶30以及A∶B為60∶40進(jìn)行研究和探討，此時(shí)體積流量設(shè)定為1 mL·min-1。

（2）體積流量的確定。本試驗(yàn)探究了當(dāng)體積流量分別為0.8 mL·min-1或1 mL·min-1時(shí)對(duì)試驗(yàn)的影響，從而調(diào)整液相色譜條件，使試驗(yàn)結(jié)果更佳。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定。分別精密稱(chēng)取適量地塞米松和潑尼松龍兩種糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇制成每1 mL各含0，2，4，6，8，10 μg的混合標(biāo)液[11]，取混合標(biāo)液20 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件分析

2.1.1 洗脫條件的確定 為探究本試驗(yàn)中液相色譜的最佳運(yùn)行條件，試驗(yàn)時(shí)使用地塞米松與潑尼松龍的混合標(biāo)液對(duì)洗脫條件進(jìn)行分析，每次進(jìn)樣量為20 μL，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

當(dāng)洗脫條件為80%A+20%B時(shí)，液相色譜圖沒(méi)有明顯的激素峰出現(xiàn)，且基線(xiàn)偏離嚴(yán)重，此濃度無(wú)法洗脫出地塞米松和潑尼松龍；當(dāng)洗脫條件變換為70%A+30%B時(shí)，出峰清晰且分離時(shí)間適宜；當(dāng)洗脫條件設(shè)置為60%A+40%B時(shí)，色譜圖中的峰無(wú)法分離，看不出有明顯的峰出現(xiàn)，無(wú)法確認(rèn)計(jì)算。因而，只有當(dāng)B和A的比例為3∶7時(shí)，出峰清晰且分離時(shí)間適宜，選為最適合的洗脫條件（圖4）。

2.1.2 體積流量的確定 體積流量設(shè)定為0.8 mL·min-1時(shí)，基線(xiàn)偏離較大，且混標(biāo)分離效果較差；體積流量設(shè)定為1 mL·min-1時(shí)，雖有少數(shù)微小的雜峰波動(dòng)，但要測(cè)定的激素峰分離效果好，基線(xiàn)較平，出峰時(shí)間合適，因此，選定1 mL·min-1為最適體積流量。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定 以地塞米松與潑尼松龍混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣量（μg·min-1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)表1。由表1可得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍以及定量限。地塞米松與潑尼松龍的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明是高度相關(guān)，定量限較小說(shuō)明此檢測(cè)方法具有較靈敏的定量檢測(cè)能力，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取10 μg·min-1的地塞米松與潑尼松龍混合標(biāo)液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，測(cè)定各峰面積，得出檢出量，見(jiàn)表2。根據(jù)公式計(jì)算得地塞米松、潑尼松龍的RSD分別為0.1%，0.2%，均小于1.0%，表示此試驗(yàn)精密度較高，滿(mǎn)足試驗(yàn)需求。

2.1.5 檢出限確定 取地塞米松、潑尼松龍對(duì)照品貯備溶液，用流動(dòng)相多次稀釋后，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)公式計(jì)算得到這兩種糖皮質(zhì)激素的檢出限約為10 ng，即相當(dāng)于添加量為每克劑量0.005 mg。

2.2 雞肉中糖皮質(zhì)激素最佳提取劑的確定

根據(jù)2.1.1和2.1.2中所確立的分離效果較好的洗脫條件和體積流量設(shè)置液相色譜條件，檢測(cè) 1.2.1中使用不同提取劑分別對(duì)雞肉中的地塞米松和潑尼松龍進(jìn)行提取后的提取液，通過(guò)計(jì)算得出加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

根據(jù)對(duì)加標(biāo)回收率的比較可以看出，使用乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）做提取劑對(duì)地塞米松和潑尼松龍兩種糖皮質(zhì)激素的提取效率是最高的，在液相色譜條件確定的情況下加標(biāo)回收率最高，表明損失量最少。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)HPLC對(duì)雞肉中糖皮質(zhì)激素提取劑進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)甲醇在做提取劑時(shí)，由于甲醇極性較強(qiáng)，提取雜質(zhì)較多，在凈化分層后雖然能有效分離油脂蛋白質(zhì)，但上層較容易出現(xiàn)掛壁等問(wèn)題，使得在吸取下層時(shí)仍有可能混入少量蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，因而，在高效液相色譜中易出現(xiàn)雜峰影響判斷。同時(shí)二氧六環(huán)做提取劑時(shí)，有一定的刺激性，操作較為繁瑣，提取、過(guò)濾、水浴蒸干等過(guò)程盡量要在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，且其在水浴蒸干過(guò)程中耗時(shí)較久，較難蒸干。而使用乙酸乙酯做提取劑，雞肉不容易散開(kāi)而會(huì)凝結(jié)成團(tuán)狀，會(huì)導(dǎo)致提取效率不夠高，且乙酸乙酯有較強(qiáng)的刺激性氣味，需要在通風(fēng)櫥中進(jìn)行操作，增加了試驗(yàn)的繁瑣性。使用乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）混合液做提取劑時(shí)，甲酸有較強(qiáng)腐蝕性和刺激性，要注意穿戴防護(hù)服和防護(hù)手套，在過(guò)程中，由于甲酸的加入會(huì)分解肉品中的纖維，使雞肉成粉末狀，使得過(guò)濾過(guò)程較為艱難，非常容易堵塞濾紙孔，但優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)糖皮質(zhì)激素的提取效率會(huì)更高，因而檢測(cè)性比較好。

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