大豆葉片黃酮類(lèi)及多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)臭氧濃度升高的響應(yīng)

田榮榮，王巖，王偉，毛兵，趙天宏

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161

大豆葉片黃酮類(lèi)及多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)臭氧濃度升高的響應(yīng)

田榮榮，王巖，王偉，毛兵，趙天宏*

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161

利用開(kāi)頂式氣室（Open Top Chamber，OTC），通過(guò)測(cè)定大豆葉片中黃酮類(lèi)物質(zhì)（總黃酮、蘆丁、槲皮素和桑色素）和酚類(lèi)物質(zhì)（總多酚、阿魏酸和P-香豆酰）含量變化，以及苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）及脂肪氧化酶（LOX）3種酶活性變化，研究O3濃度升高對(duì)大豆葉片黃酮類(lèi)和多酚類(lèi)物質(zhì)及其氧化酶的影響。以大氣臭氧濃度為對(duì)照，設(shè)置110 nL·L-1O3濃度為一個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)OTCs重復(fù)。結(jié)果表明，隨著大豆生育期的延長(zhǎng)，與對(duì)照相比，總黃酮、蘆丁、槲皮素和桑色素都表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在開(kāi)花期達(dá)到峰值，且顯著（P＜0.05）高于對(duì)照；P-香豆酰含量表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在開(kāi)花期達(dá)到峰值，總多酚和阿魏酸都顯著（P＜0.05）上升；PAL、PPO、LOX 3種酶的活性與對(duì)照相比都顯著（P＜0.05）升高。O3濃度升高會(huì)誘導(dǎo)大豆葉片內(nèi)PAL和PPO活性增強(qiáng)，進(jìn)而增加葉片內(nèi)黃酮類(lèi)和多酚類(lèi)物質(zhì)的含量，提高大豆葉片抗氧化性，抵抗O3的傷害。但隨著O3熏蒸時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆抗氧化性下降，導(dǎo)致籽粒產(chǎn)量下降。

大豆葉片；臭氧；多酚；黃酮；抗氧化性

TIAN Rongrong， WANG Yan， WANG Wei， MAO Bing， ZHAO Tianhong. Response of soybean leaves flavonoids and polyphenols to elevated ozone ［J］. Ecology and Environmental Sciences， 2016， 25（8）: 1277-1282.

對(duì)流層臭氧（O3）是由大氣氮氧化物（NOx）、揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs）和一氧化碳（CO）等經(jīng)光化學(xué)反應(yīng)生成的二次性污染物。有研究表明，在我國(guó)工業(yè)化發(fā)達(dá)地區(qū)，也就是京津冀地區(qū)和長(zhǎng)江三角洲地區(qū)，超過(guò)10%的時(shí)間O3的平均小時(shí)濃度達(dá)到60 nL·L-1以上，京津地區(qū)、上海、福州最大O3濃度分別達(dá)到170、190、105 nL·L-1，沈陽(yáng)8小時(shí)臭氧濃度超過(guò)75 nL·L-1（Yi et al.，2016；Wang et al.，2007；王宏等，2011；李夏等，2015）。O3的負(fù)效應(yīng)與它的氧化性本質(zhì)有關(guān)，O3通過(guò)氣孔進(jìn)入植物葉片，與細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)成分快速反應(yīng)生成活性氧物質(zhì)，如H2O2、、·OH等，從而損傷植物細(xì)胞，導(dǎo)致光合速率下降、葉片早衰、葉片可見(jiàn)傷害、生產(chǎn)力下降以及生長(zhǎng)減慢等（Heath，2009）。

O3脅迫下，植物形成一定的生物化學(xué)機(jī)制（例如改變抗氧化性、酶活性、代謝物濃度）以減弱活性氧對(duì)細(xì)胞的損害（Singh et al.，2010）。次生代謝物（酚類(lèi)、萜類(lèi)和含氮化合物）是生理代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，在植物對(duì)物理、化學(xué)環(huán)境的響應(yīng)和反饋過(guò)程中有重要的生態(tài)學(xué)意義（陳曉亞等，1996）。多酚和黃酮類(lèi)化合物是植物體內(nèi)重要的酚類(lèi)次生代謝物。Saviranta et al.（2010）研究表明，臭氧條件下紅三葉草葉片內(nèi)總酚類(lèi)物質(zhì)上升5%～12%。李麗等（2016）研究表明，O3處理下元寶楓的早生葉和晚生葉中總黃酮含量顯著升高。黃酮類(lèi)化合物槲皮素、蘆丁、桑色素均可很好地清除超氧陰離子（）、羥自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2），且有一定的量效關(guān)系。劉瑞等（2007）研究表明，槲皮素、蘆丁可抑制Cu2+誘導(dǎo)的LDL的氧化修飾。阿魏酸和P-香豆酰是多酚類(lèi)化合物，阿魏酸可以抑制誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，對(duì)質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能具有保護(hù)作用。梁紅冬（2012）對(duì)阿魏酸的抗氧化性所進(jìn)行的研究表明，阿魏酸對(duì)實(shí)用油脂有一定的抗氧化能力。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、脂肪氧化酶（LOX）是植物次生代謝過(guò)程中重要的酶，有利于提高植物抗氧化性。O3處理下的葡萄葉片細(xì)胞系的PAL活性增加（Sgarbi et al.，2003）。趙天宏等（2011）研究表明在80 nL·L-1O3濃度下，大豆PAL、PPO、LOX活性顯著（P＜0.05）升高。目前國(guó)內(nèi)，對(duì)槲皮素、蘆丁等上述幾種酚類(lèi)物質(zhì)在O3濃度升高下的響應(yīng)機(jī)制，以及總黃酮和多酚類(lèi)物質(zhì)與PAL、PPO、LOX這3種氧化酶活性之間的關(guān)系研究較少，有待進(jìn)一步深入研究。

O3脅迫下會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量下降。大豆是世界重要經(jīng)濟(jì)作物之一，也是高O3敏感性作物之一，在O3濃度低于40 nL·L-1時(shí)就會(huì)導(dǎo)致大豆產(chǎn)量下降（Ashmore et al.，2006）。本試驗(yàn)以大豆（Glycine max）葉片為主要研究對(duì)象，以植物次生代謝物質(zhì)為出發(fā)點(diǎn)，利用開(kāi)頂式氣室探討近地層O3濃度升高對(duì)大豆葉片黃酮類(lèi)和多酚類(lèi)物質(zhì)及其抗氧化性的影響，以揭示大豆葉片中次生代謝物質(zhì)對(duì)O3濃度升高的適應(yīng)機(jī)制與響應(yīng)方式。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以大豆栽培品種“鐵豐29”為試驗(yàn)材料，該品種生育期為130～133 d，適合在中等或中等以上肥力的土壤種植。在沈陽(yáng)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站內(nèi)進(jìn)行，利用開(kāi)頂式氣室（Open Top Chamber，簡(jiǎn)稱(chēng)OTC）對(duì)大豆進(jìn)行熏蒸試驗(yàn)。主要設(shè)備包括6個(gè)結(jié)構(gòu)完全相同的OTCs氣室（橫截面為正八邊形，邊長(zhǎng)為1.15 m，高為2.4 m，玻璃室壁）以及與OTCs氣室相配套的通氣、通風(fēng)控制設(shè)備。其中又包括用于產(chǎn)生O3的O3發(fā)生器（BGY-Q8，北理國(guó)科，中國(guó)）、監(jiān)控開(kāi)頂箱內(nèi)O3濃度的O3傳感器（S-900，艾爾科，新西蘭）、采集開(kāi)頂箱內(nèi)溫濕度數(shù)據(jù)的溫濕度傳感器以及數(shù)據(jù)分析與自動(dòng)控制充氣系統(tǒng)。在整個(gè)試驗(yàn)期間，氣室內(nèi)實(shí)際氣體濃度控制穩(wěn)定。

本試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)處理，即CK處理：OTC中的對(duì)照，O3濃度為環(huán)境濃度；O3處理：O3濃度升高，為（110±10）nL·L-1。每個(gè)處理（OTC）設(shè)置3次重復(fù)。5月10日播種，出苗20 d后開(kāi)始進(jìn)行熏蒸試驗(yàn)，每天熏蒸9 h（8:00—17:00），試驗(yàn)期間水分、肥料均勻一致，無(wú)病蟲(chóng)害及雜草等限制因素。分別于大豆分枝期（6月30日）、開(kāi)花期（7月24日）和結(jié)莢期（8月12日）取樣，在9月7日停止熏蒸直至大豆成熟，在每個(gè)生育時(shí)期分別選擇大豆相同葉片部位測(cè)定相關(guān)的生理生化指標(biāo)，氣室內(nèi)3次重復(fù)。

1.2測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1黃酮類(lèi)物質(zhì)含量的測(cè)定

總黃酮采用NaNO2-A1（NO3）3分光光度法測(cè)定（魏循等，2003）；蘆丁、槲皮素、桑色素含量采用高效液相色譜法（高效液相色譜儀，1100LC，美國(guó)Agilent公司）測(cè)定，標(biāo)樣為Sigma（美國(guó)）公司產(chǎn)品。

1.2.2多酚類(lèi)物質(zhì)含量的測(cè)定

總多酚采用酒石酸鐵法（孔祥生等，2008）；以沒(méi)食子酸丙酯（Sigma，美國(guó)）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。阿魏酸和P-香豆酰含量采用高效液相色譜法（高效液相色譜儀，1100LC）測(cè)定，標(biāo)樣為Sigma（美國(guó)）公司產(chǎn)品。

1.2.3酶活性的測(cè)定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活性的測(cè)定采用巰基乙醇法（李曉輝等，2008）；脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性采用亞油酸鈉法測(cè)定（孔祥生等，2008）；多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性測(cè)定采用鄰苯二酚法測(cè)定（孔祥生等，2008）。

1.2.4大豆產(chǎn)量的測(cè)定

植株收獲后，每個(gè)處理分別選取大豆15株，籽粒自然風(fēng)干，測(cè)定籽粒的百粒重、單株粒重及單株粒數(shù)等大豆籽粒產(chǎn)量的相關(guān)指標(biāo)，用電子分析天平（感量0.001）稱(chēng)重。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，文中數(shù)據(jù)均為各處理的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-wayANOVA），用最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1臭氧濃度升高對(duì)大豆葉片黃酮類(lèi)化合物的影響

如圖1所示，O3脅迫下，大豆葉片內(nèi)的黃酮類(lèi)化合物都表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，且各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照相比都是先下降后上升。

2.1.1臭氧濃度升高對(duì)大豆葉片總黃酮含量的影響

如圖1（a）所示，隨著大豆生育時(shí)期的延長(zhǎng)，大豆葉片內(nèi)的總黃酮含量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，總黃酮的含量在開(kāi)花期達(dá)到最高值。與CK相比，O3處理下大豆葉片總黃酮含量在分枝期降低11.68%，在開(kāi)花期和結(jié)莢期分別升高16.85%和7.68%，并且在各個(gè)生育時(shí)期均達(dá)到顯著（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01）。

2.1.2臭氧濃度升高對(duì)大豆葉片蘆丁、槲皮素、桑色素含量的影響

如圖1（b）所示，隨著大豆生育時(shí)期的延長(zhǎng)，大豆葉片內(nèi)的蘆丁含量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，蘆丁的含量在開(kāi)花期達(dá)到最高值。與CK相比，O3處理下大豆葉片蘆丁含量在分枝期降低13.48%，在開(kāi)花期和結(jié)莢期分別升高4.03%和19.27%，并且在分枝期和結(jié)莢期達(dá)到極顯著差異（P＜0.01），但在開(kāi)花期差異不顯著（P＞0.05）。

從圖1（c）可以看出，隨著大豆生育時(shí)期的延長(zhǎng)，大豆葉片內(nèi)的槲皮素含量呈先上升后下降趨勢(shì)，在開(kāi)花期含量達(dá)到最高值。與CK相比，O3處理下大豆葉片槲皮素含量在分枝期降低25.08%，在開(kāi)花期和結(jié)莢期分別升高16.85%和7.68%，并且在各個(gè)時(shí)期均達(dá)到顯著（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01）。

如圖1（d）所示，隨著大豆生育時(shí)期的延長(zhǎng)，大豆葉片內(nèi)的桑色素含量先上升后下降，在開(kāi)花期桑色素的含量達(dá)到最高值。與CK相比，O3處理下大豆葉片桑色素含量在分枝期降低23.63%，在開(kāi)花期和結(jié)莢期分別升高16.85%和17.81%，并且在各個(gè)時(shí)期均達(dá)到顯著（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01）。

圖1　O3脅迫下大豆葉片總黃酮（a）、蘆?。╞）、槲皮素（c）、桑色素（d）含量的變化Fig. 1　Change of flavonoids， rutin， quercetin， morin content in soybean leaves under O3stress

圖2　O3脅迫下大豆葉片總多酚（a）、阿魏酸（b）、P-香豆酰（c）含量的變化Fig. 2　Change of total polyphenols （a）， ferulic acid （b）， P-coumaric acid （c） content in soybean leaves under O3stress

2.2臭氧濃度升高對(duì)大豆葉片多酚類(lèi)化合物的影響

2.2.1臭氧濃度升高對(duì)大豆葉片總多酚含量的影響

由圖2（a）可知，隨著大豆生育時(shí)期的延長(zhǎng)，大豆葉片總多酚含量呈上升趨勢(shì)。與CK相比，O3處理下大豆葉片總多酚含量升高22.14%～39.41%，并且各個(gè)脅迫均使大豆葉片在各個(gè)生育時(shí)期均達(dá)到差異顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）水平，說(shuō)明在110 nL·L-1O3脅迫下大豆葉片多酚類(lèi)化合物含量增加。

2.2.2臭氧濃度升高對(duì)大豆葉片阿魏酸、P-香豆酰含量的影響

由圖2（b）可知，隨著大豆生育時(shí)期的延長(zhǎng)，大豆葉片阿魏酸含量呈上升趨勢(shì)。與CK相比，O3處理?xiàng)l件下阿魏酸含量升高17.22%～72.78%，并且在開(kāi)花期達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05），在分枝期和結(jié)莢期達(dá)到極顯著差異水平（P＜0.01）。說(shuō)明在110 nL·L-1O3脅迫下大豆葉片阿魏酸含量增加。

由2（c）可知，隨著大豆生育時(shí)期的延長(zhǎng)，對(duì)照處理下大豆葉片P-香豆酰呈上升趨勢(shì)，在O3脅迫下大豆葉片P-香豆酰含量呈先上升后下降趨勢(shì)，在開(kāi)花期含量達(dá)到最高值。O3處理?xiàng)l件下大豆葉片P-香豆酰含量升高9.72%～33.97%，并且在各個(gè)時(shí)期均達(dá)到顯著（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01）。

2.3臭氧濃度升高對(duì)大豆葉片PAL、PPO、LOX活性的影響

由圖3（a）可知，隨著大豆生育時(shí)期的延長(zhǎng)，大豆葉片中苯丙氨酸解氨酶的活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與CK相比，O3處理下大豆葉片苯丙氨酸解氨酶活性的增幅為0.13%～15.01%，并且在結(jié)莢期達(dá)到顯著（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01），但在分枝期和開(kāi)花期差異不顯著（P＞0.05）。

由圖3（b）可知，隨著大豆生育時(shí)期的延長(zhǎng)，大豆葉片內(nèi)的多酚氧化酶的活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與CK相比，O3處理?xiàng)l件下多酚氧化酶活性的增幅為2.78%～6.14%，并在結(jié)莢期達(dá)到顯著（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01），但在分枝期和開(kāi)花期差異不顯著（P＞0.05）。

由圖3（c）可知，隨著大豆生育時(shí)期的延長(zhǎng)，大豆葉片脂氧合酶活性呈上升趨勢(shì)。與CK相比，O3處理下大豆葉片脂氧合酶活性的增幅為20.10%～39.35%，并且在各個(gè)生育時(shí)期均達(dá)到顯著（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01）。說(shuō)明O3脅迫下大豆葉片LOX活性增加。

2.4臭氧濃度升高對(duì)大豆籽粒產(chǎn)量的影響

由表1可知，與CK相比，O3脅迫處理?xiàng)l件下大豆的單株粒數(shù)、單株粒重、百粒重和單株莢數(shù)分別減少38.28%、53.33%、40.63%和37.17%，并且單株粒數(shù)、單株粒重、百粒重和單株莢數(shù)與對(duì)照相比均達(dá)到極顯著差異（P＜0.01）。

圖3　O3脅迫下大豆葉片PAL（a）、PPO（b）、LOX（c）活性的變化Fig. 3　Change of PAL （a）， PPO （b）， LOX （c） activity in soybean leaves under O3stress

表1　O3脅迫對(duì)大豆籽粒產(chǎn)量的影響Table 1　Effects of O3stress on grain yield of soybean

3　討論

3.1臭氧濃度升高對(duì)大豆葉片次生代謝物的影響

多酚和黃酮類(lèi)化合物中的鄰位酚羥基易被氧化成醌類(lèi)結(jié)構(gòu)，另外對(duì)活性氧等自由基具有很強(qiáng)的捕捉能力，所以多酚和黃酮類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基能力，對(duì)O3脅迫有顯著的解毒作用，并且抗氧化活性的強(qiáng)弱與其含量的高低有較強(qiáng)的相關(guān)性（Fernandes et al.，2016；吳時(shí)敏等，2002；黃琴等，2014）。槲皮素、蘆丁和桑色素是植物體內(nèi)的幾類(lèi)黃酮類(lèi)化合物，具有一定的抗氧化性。O3脅迫下植物體內(nèi)會(huì)迅速產(chǎn)生大量自由基，自由基與植物體內(nèi)核蛋白、脂肪酸等物質(zhì)結(jié)合生成氧化物或過(guò)氧化物，使細(xì)胞功能衰退。黃酮類(lèi)化合物會(huì)阻止自由基在植物機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生，通過(guò)與反應(yīng)阻止自由基生成，并且與金屬離子（如Fe2+）螯合抑制·OH產(chǎn)生，還能作用于與自由基有關(guān)的酶，間接減少自由基的產(chǎn)生（延璽等，2008）。O3脅迫初期自由基大量產(chǎn)生會(huì)加速植物體內(nèi)黃酮類(lèi)化合物的消耗，故O3脅迫初期大豆葉片內(nèi)的黃酮類(lèi)化合物含量低于對(duì)照，這與趙天宏等（2011）的試驗(yàn)結(jié)果一致，但隨著O3熏蒸時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮類(lèi)物質(zhì)合成受阻，含量下降。

O3的強(qiáng)氧化能力會(huì)引起植物體內(nèi)酚類(lèi)化合物含量的變化（Moura et al.，2014）。由圖2可知隨著大豆生育期的延長(zhǎng)，O3脅迫下總多酚和阿魏酸含量顯著上升。近代生物化學(xué)認(rèn)為酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用是由于吲哚乙酸氧化酶的活化，而一元酚是活化該酶的輔基之一。一元酚活化植物體內(nèi)的吲哚乙酸氧化酶，從而將吲哚乙酸（植物生長(zhǎng)素）氧化成不活潑的3-亞甲氧基代吲哚，不利于植物生長(zhǎng)；但二元酚或多元酚會(huì)抑制這種酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)（何光訓(xùn)，1992）。阿魏酸屬于一元酚，隨著O3熏蒸時(shí)間的增加，阿魏酸的含量顯著增加，說(shuō)明O3熏蒸造成阿魏酸在大豆體內(nèi)積累，進(jìn)而影響植株生長(zhǎng)。與對(duì)照相比，臭氧處理下大豆總多酚含量顯著增加，大豆通過(guò)增加多酚類(lèi)物質(zhì)來(lái)提高抵抗能力，減弱O3傷害。

O3脅迫下，黃酮類(lèi)化合物含量在開(kāi)花期達(dá)到峰值，而多酚類(lèi)化合物含量一直呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明在O3脅迫前期黃酮類(lèi)化合物和多酚類(lèi)物質(zhì)共同起作用，而脅迫后期多酚類(lèi)化合物起主要作用。

3.2臭氧濃度升高下大豆葉片酚類(lèi)物質(zhì)和氧化酶的關(guān)系

酚類(lèi)化合物合成于苯丙烷次生代謝途徑，PAL是苯丙氨酸代謝途徑中的限速酶和中心酶，L-苯丙氨酸經(jīng)PAL作用生成反式肉桂酸，進(jìn)入苯丙烷類(lèi)代謝途徑，生成香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中間產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為香豆素、綠原酸，也可形成CoA酯，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為類(lèi)黃酮、木質(zhì)素、生物堿等（張寬朝等，2008）。因此，PAL活性可以間接反應(yīng)多酚類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物的含量變化。大豆葉片中PAL活性與總多酚和總黃酮含量呈正相關(guān)（趙天宏，2011）。同時(shí)PAL是一種誘導(dǎo)酶，O3脅迫會(huì)誘導(dǎo)PAL基因表達(dá)，PAL活性增加，促進(jìn)多酚類(lèi)和黃酮類(lèi)物質(zhì)的合成，從而增加大豆葉片對(duì)O3脅迫的抗氧化能力。在本試驗(yàn)中，隨著O3熏蒸的時(shí)間延長(zhǎng)，即使PAL活性增加，但由于O3的傷害作用太大，結(jié)莢期黃酮類(lèi)化合物含量表現(xiàn)出下降趨勢(shì)；多酚類(lèi)化合物含量與PAL活性都呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)?？梢?jiàn)，PAL對(duì)植物抗逆性的增加有顯著作用。

PPO活性大小與植物的代謝強(qiáng)度及環(huán)境脅迫密切相關(guān)，已有大量的研究表明，當(dāng)植物受到傷害、病害和蟲(chóng)害時(shí)PPO活性增加（雷東鋒等，2004），本試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，隨著O3脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)PPO活性明顯上升。PPO是以多酚類(lèi)物質(zhì)為底物的酶，將多酚類(lèi)物質(zhì)氧化成醌類(lèi)物質(zhì)，形成咖啡酸、綠原酸等抗病物質(zhì)，其速率受酶促反應(yīng)的限制，如果酚類(lèi)物質(zhì)增加，則反應(yīng)底物濃度增加，從而PPO活性增加（何光訓(xùn)，1992）。本試驗(yàn)中，O3濃度升高條件下PPO與多酚類(lèi)物質(zhì)的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明PPO與多酚類(lèi)物質(zhì)可能存在正相關(guān)關(guān)系。

大豆葉片中，脂肪氧化酶（LOX）與反應(yīng)底物是分開(kāi)的，當(dāng)植株受到傷害或產(chǎn)生組織損傷，LOX才會(huì)與底物產(chǎn)生接觸（左進(jìn)華等，2007）。O3脅迫下脂肪氧化酶通過(guò)脂肪氧化酶途徑（LOX途徑）加快植物脂肪酸氧化，生成大量過(guò)氧化物，使葉綠體光化學(xué)反應(yīng)失活并破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增加膜透性，促進(jìn)植物衰老（扎桑等，2015）。另外，LOX途徑經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成植物內(nèi)源激素茉莉酸，茉莉酸會(huì)促進(jìn)乙烯合成、葉片衰老、葉片脫落、氣孔關(guān)閉、呼吸作用（扎桑等，2015；Gigot et al.，2010）。本試驗(yàn)中，LOX活性受O3誘導(dǎo)顯著增加，表明O3脅迫導(dǎo)致大豆葉片內(nèi)氧化作用加劇。

3.3臭氧濃度升高對(duì)大豆籽粒產(chǎn)量的影響

本試驗(yàn)中，O3濃度升高條件下大豆籽粒產(chǎn)量顯著下降。O3對(duì)大豆的開(kāi)花期有顯著影響，O3脅迫下大豆的開(kāi)花數(shù)量減少，且影響花期的受精過(guò)程，導(dǎo)致結(jié)莢期大豆莢數(shù)明顯低于CK，大豆籽粒減少，使得籽粒產(chǎn)量降低（Sun et al.，2014；金東艷等，2009）。

4　結(jié)論

O3濃度升高增強(qiáng)了大豆葉片內(nèi)PAL和PPO活性，增加了葉片內(nèi)黃酮類(lèi)和多酚類(lèi)物質(zhì)的含量，提高了大豆葉片抗氧化性，從而達(dá)到抵抗O3傷害的目的。同時(shí)，LOX活性升高，增加了膜透性，加劇了對(duì)大豆葉片所產(chǎn)生的傷害作用。隨著O3熏蒸時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆抗氧化性下降，植株受到損傷，籽粒產(chǎn)量下降。

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Response of Soybean Leaves Flavonoids and Polyphenols to Elevated Ozone

TIAN Rongrong， WANG Yan， WANG Wei， MAO Bing， ZHAO Tianhong*
College of Agronomy， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110161， China

This paper mainly studies the effects of ozone on secondary metabolites and enzymes in soybean （Glycine max） leaves. Utilizing the open top chamber （OTC）， we have investigated variations of soybean leaves under O3fumigation in the following aspects: flavonoids （rutin， quercetin， morin） and polyphenols（ ferulic acid， p-coumaric acid）， and the activities of phenylalanine ammonia-lyase （PAL）， polyphenol oxidase （PPO） and lipoxygenase （LOX）. Meanwhile with the atmospheric ozone concentration as the control， the 110 nL·L-1O3concentration was set as treatment， each of which was provided with three OTCs repeats， and each OTC with three repeats. The results demonstrated that in the whole growth period of treated soybean， compared with CK， the contents of total flavonoids， rutin， quercetin， morin first increased and then decreased， in the flowering period reaching the peaks，which showed significantly （P＜0.05） higher than those of the control； p-coumaric acid content alsofirst increased and then decreased， during the flowering period reaching its peak； total polyphenols and ferulic acid experienced significant increase （P＜0.05）；and compared with the CK， the activities of three enzymes of PAL， PPO and LOX increased significantly （P＜0.05）， too. Elevated O3induced enhancement of soybean leaf PAL and PPO activities， increasing leaf flavonoids and polyphenols contents ，which further improved the antioxidant of soybean leaves and resistance to O3damage. However， with the extension of O3fumigation， the decline of soybean antioxidant activity would result in the decrease of grain yield.

soybean leaves； ozone； polyphenols； flavonoids； oxidation resistance

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.08.004

Q945.79； X17

A

1674-5906（2016）08-1277-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31570404；30970448）

田榮榮（1992年生），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锷砩鷳B(tài)學(xué)。E-mail: 224046075@qq.com

?趙天宏（1972年生），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿驓夂蜃兓椭参锷砩鷳B(tài)。E-mail: zth1999@163.com

2016-05-26

引用格式：田榮榮， 王巖， 王偉， 毛兵， 趙天宏. 大豆葉片黃酮類(lèi)及多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)臭氧濃度升高的響應(yīng)［J］. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2016， 25（8）: 1277-1282.