色譜柱選擇對六味安消膠囊中大黃素和大黃酚含量測定的影響

王明娟, 劉雅丹, 胡曉茹, 何風(fēng)艷, 項新華, 戴 忠, 于健東, 馬雙成

(中國食品藥品檢定研究院, 北京 100050)

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研究論文

色譜柱選擇對六味安消膠囊中大黃素和大黃酚含量測定的影響

王明娟, 劉雅丹, 胡曉茹, 何風(fēng)艷, 項新華, 戴 忠*, 于健東, 馬雙成*

(中國食品藥品檢定研究院, 北京 100050)

以中國藥典收載的六味安消膠囊中大黃素與大黃酚的含量測定方法為典型案例,揭示了色譜柱是影響HPLC質(zhì)量控制方法測定結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵風(fēng)險因素。參加能力驗證的155家實驗室均采用方法規(guī)定的C18柱,但由于不同品牌C18柱間的選擇性差異,有20家實驗室的分析結(jié)果中大黃素峰與樣品水解產(chǎn)物的色譜峰共流出,導(dǎo)致測定結(jié)果明顯偏離正常值。統(tǒng)計結(jié)果表明,A型(早期開發(fā)、硅羥基殘留較多)和E型(內(nèi)嵌極性基團或以極性基團封尾)C18柱更適于六味安消膠囊中大黃素與大黃酚的含量測定,這可能是因為大黃素和大黃酚結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，能與A型柱的殘留硅羥基或E型柱內(nèi)嵌/封尾的極性基團相互作用，從而增強其保留行為有關(guān)。建議相關(guān)實驗室在制訂HPLC質(zhì)量控制方法時應(yīng)特別注重色譜柱的耐用性考察,并嘗試采用國外色譜柱分類數(shù)據(jù)庫科學(xué)地指導(dǎo)色譜柱的選擇,盡量采用難分離物質(zhì)對作為系統(tǒng)適用性指標(biāo),完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),減少由于色譜柱選擇不適宜導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確的風(fēng)險。

高效液相色譜;色譜柱選擇;關(guān)鍵風(fēng)險因素;大黃素;大黃酚;六味安消膠囊

高效液相色譜(HPLC)以其高效、靈敏、專屬性強、重現(xiàn)性好等優(yōu)點成為藥品質(zhì)量控制中常用的技術(shù)手段。但在實際工作中,經(jīng)常因色譜柱選擇不適宜而影響HPLC方法定性或定量的準(zhǔn)確性,如當(dāng)目標(biāo)峰與干擾峰共流出時,會導(dǎo)致定量結(jié)果的不準(zhǔn)確;當(dāng)采用相對保留時間(RRT)定義目標(biāo)峰時,如目標(biāo)峰的出峰順序相反,會導(dǎo)致色譜峰識別錯誤。因為在藥典及其他法規(guī)HPLC方法中關(guān)于色譜柱的描述通常較籠統(tǒng),如簡單描述為C18柱,而不給出色譜柱的品牌信息。目前市場上有800多種品牌的C18柱,由于硅膠純度、鍵合工藝、封尾等生產(chǎn)工藝的差異,不同品牌C18柱間的選擇性差異較大,而雜化顆粒、聚合物包被、C18鏈中內(nèi)嵌極性基團等新技術(shù)的出現(xiàn)使上述差異更為顯著,更易出現(xiàn)因色譜柱選擇不適宜而導(dǎo)致HPLC方法定性或定量結(jié)果不準(zhǔn)確的風(fēng)險,特別是當(dāng)樣品基質(zhì)中含堿性或弱酸性(pKa3～6)化合物時這種差異更為顯著[1-5]。

國外已有不少研究團隊自20世紀(jì)90年代開始研究影響反相色譜柱選擇性的參數(shù),并嘗試采用重現(xiàn)性好的色譜系統(tǒng)對這些參數(shù)進(jìn)行量化,用于比較不同品牌色譜柱之間的選擇性差異。目前比較有國際影響力的研究團隊包括Dolan/Snyder等[6-10], Hoogmartens等[11-14]和Euerby等[15-17],所建的色譜柱數(shù)據(jù)庫分別為PQRI(product quality research institute, http://www.usp.org/app/USPNF/columnsDB.html)、KUL(katholieke universiteit leuven, http://pharm.kuleuven.be/farmanalyse/ccs/ccs-app)和ACD(advanced chemistry development, http://www.acdlabs.com/resources/freeware/colsel)數(shù)據(jù)庫。USP(United States pharmacopeia)網(wǎng)站中除PQRI數(shù)據(jù)庫外,還包括依據(jù)USP法所建的數(shù)據(jù)庫(以下簡稱USP數(shù)據(jù)庫,http://www.usp.org/app/USPNF/columnsDB.html)。但PQRI、USP、KUL和ACD數(shù)據(jù)庫均未收載國產(chǎn)色譜柱的信息。 本研究小組成功采用KUL數(shù)據(jù)庫指導(dǎo)了乙酰螺旋霉素組分控制中色譜柱的合理選擇[3]。葉六平等[1]采用USP、PQRI數(shù)據(jù)庫指導(dǎo)大黃和補骨脂多組分分析中等效色譜柱的選擇,結(jié)果表明,對于大黃多組分的分析,PQRI數(shù)據(jù)庫的指導(dǎo)成功率明顯高于USP數(shù)據(jù)庫;但在補骨脂的分析中,由于中藥樣品基質(zhì)的復(fù)雜性,2個數(shù)據(jù)庫的參考價值均較小。

Dolan/Snyder研究團隊還曾根據(jù)色譜柱的發(fā)展史對C18柱進(jìn)行了分類:A型柱為早期開發(fā)的、硅膠純度較低、金屬和硅羥基殘留量均較高的色譜柱[6]; B型柱為硅膠純度較高、金屬殘留量較低,目前市場占有率最高的色譜柱[7]; E型柱為C18鏈中內(nèi)嵌極性基團或以極性基團封尾的色譜柱[8]。

本研究小組在2015年中國食品藥品檢定研究院組織的“中藥六味安消膠囊中大黃素與大黃酚的含量測定”能力驗證(PT)項目中發(fā)現(xiàn)色譜柱是影響測定結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵風(fēng)險因素,因色譜柱選擇不適宜導(dǎo)致測定結(jié)果“不滿意”的比例高達(dá)13%。本文以上述項目中涉及的HPLC方法為典型實例,結(jié)合國內(nèi)外色譜柱的發(fā)展史及研究成果,探討與完善該類質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可能的途徑,以期為該類共性難題的解決提供有價值的思路。

1 數(shù)據(jù)庫介紹

1.1 PQRI數(shù)據(jù)庫

PQRI數(shù)據(jù)庫中有664種色譜柱信息,包括C4、C8、氨基和苯基柱等。依據(jù)色譜柱的疏水性(H)、空間位阻(S)、氫鍵結(jié)合作用的酸性(A)、氫鍵結(jié)合作用的堿性(B)和離子交換作用(C)進(jìn)行色譜柱分類,用FS(selectivity function)值比較不同色譜柱間的選擇性差異,計算公式為[7]

FS=[12.5×(H2-H1)2+100×(S2-S1)2+

30×(A2-A1)2+143×(B2-B1)2+83×(C2-C1)2]1/2

當(dāng)FS≤3時,認(rèn)為2根色譜柱的選擇性相似;當(dāng)FS≥6時,認(rèn)為2根色譜柱的選擇性差異顯著。

1.2 KUL數(shù)據(jù)庫

KUL數(shù)據(jù)庫中已有100多種品牌色譜柱(主要為C18柱)的信息。依據(jù)戊基苯的保留因子(kamb)、芐胺與苯酚在pH 2.7時保留因子的比值(rkba/pH 2.7)、2,2′-聯(lián)吡啶的保留因子(k2,2′-d)和三亞苯與鄰三聯(lián)苯保留因子的比值(rktri/ter)對色譜柱的選擇性進(jìn)行分類,用F值評價目標(biāo)色譜柱(i)與參比柱(ref)間的選擇性差異,計算公式為[11]

F=(kamb, ref-kamb, i)2+(rkba/pH 2.7, ref-

rkba/pH 2.7, i)2+(k2,2′-d, ref-k2,2′d, i)2+

(rktri/ter, ref-rktri/ter, i)2

當(dāng)F≤2時,表示目標(biāo)色譜柱與參比柱間選擇性相似;當(dāng)F≥6時,表示差異顯著。

1.3 ACD數(shù)據(jù)庫

ACD數(shù)據(jù)庫中已有321種色譜柱信息,包括C8、氨基柱、苯基柱等。依據(jù)芐胺與苯酚在pH 2.7和pH 7.6時保留因子的比值(αB/P, pH 2.7、αB/P, pH 7.6)、咖啡因與苯酚保留因子的比值(αC/P)、戊基苯與丁基苯保留因子的比值(αCH2)、戊基苯的保留因子(kPB)與三亞苯與鄰三聯(lián)苯保留因子的比值(αT/O),用CDF(column difference factor)值比較不同色譜柱間的選擇性差異,計算公式為[15]

CDF=[(xnt1-xn1)2+(xnt2-xn2)2+(xnt3-xn3)2+

(xnt4-xn4)2+(xnt5-xn5)2+(xnt6-xn6)2]1/2

其中,上式中的xnt1/xn1、xnt2/xn2、xnt3/xn3、xnt4/xn4、xnt5/xn5和xnt6/xn6分別為目標(biāo)色譜柱/參比柱關(guān)于上述6個參數(shù)(αB/P, pH 2.7,αB/P, pH 7.6,αC/P,αCH2,kPB和αT/O)的標(biāo)準(zhǔn)化比值(xnx=(xx-μx)/SD),其中μx和SD分別為該參數(shù)的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)偏差。CDF越小,表明目標(biāo)色譜柱與參比柱之間的選擇性差異越小。

1.4 USP數(shù)據(jù)庫

采用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所(national institute of standards and technology, NIST)提供的含尿嘧啶、甲苯、乙苯、醌茜和阿米替林的SRM 870(標(biāo)準(zhǔn)參照物)評價色譜柱的乙苯保留因子(Hy)、醌茜的拖尾因子(CTF)、阿米替林的保留因子(CFA)、阿米替林的拖尾因子(TFA)和結(jié)合密度(BD)值,用以反映色譜柱的疏水性、螯合性、硅羥基活性和空間選擇性。該數(shù)據(jù)庫中有117種色譜柱信息,通過相似度(F)評價目標(biāo)色譜柱與參比柱間的選擇性差異。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

HPLC儀配有單波長UV檢測器或二極管陣列檢測器(美國Waters、Agilent、日本Shimadzu公司等)。

甲醇為HPLC級,磷酸為分析級。實驗用水采用Millipore純化水系統(tǒng)制備。

六味安消膠囊購于北京某藥店,將包裝拆除后用白色塑料瓶套裝密封,按20粒/瓶的規(guī)格進(jìn)行分裝,共210瓶,隨機編號。樣品發(fā)放前按中國合格評定國家認(rèn)可委員會(CNAS)相關(guān)規(guī)定[18,19]進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性考察,均符合規(guī)定。各實驗室按隨機表進(jìn)行樣品分配。

2.2 參加實驗室情況

參加能力驗證項目的實驗室共有156家,來自全國31個省、直轄市、自治區(qū)(香港、澳門、臺灣地區(qū)除外),上述實驗室中95%為各級藥品檢驗機構(gòu),屬于藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的執(zhí)行主體,另有6家企業(yè)實驗室和2家第三方檢驗實驗室,能夠全面反映本次能力驗證所考核質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的真實執(zhí)行水平。最終上報結(jié)果的有155家實驗室,有1家由于自身原因選擇退出。2.3 色譜條件

依據(jù)2015版《中國藥典》[20],采用的色譜柱為C18柱,流動相為甲醇-0.1%(v/v)磷酸水溶液(80∶20, v/v),檢測波長為254 nm,系統(tǒng)適用性為理論塔板數(shù)(以大黃素計)不低于3 000。

參加能力驗證的155家實驗室采用的C18柱包括Waters、Agilent、Shimadzu、Shiseido等公司常見的55種品牌,其中有11家實驗室采用的是A型柱,6家為E型柱,138家為B型柱,與C18柱的市場供應(yīng)情況吻合,能真實反映HPLC質(zhì)量控制方法在實際執(zhí)行過程中的狀態(tài)。

2.4 樣品前處理

稱取0.6 g樣品,加入25 mL鹽酸-甲醇(1∶10, v/v)溶液后,加熱回流30 min,得到水解樣品,以測定總大黃素和總大黃酚的含量;稱取0.7 g樣品,加入25 mL甲醇,加熱回流30 min,測定游離大黃素和游離大黃酚的含量。總大黃素和總大黃酚含量與游離大黃素和游離大黃酚含量的差值即為結(jié)合蒽醌中大黃素和大黃酚的含量。

2.5 結(jié)果判定

采用穩(wěn)健統(tǒng)計方法,以總大黃素和總大黃酚的含量、結(jié)合蒽醌中大黃素和大黃酚的含量2個指標(biāo)的Z分比值進(jìn)行結(jié)果評定,計算公式為[18]

Z=(x-X)/(0.741 3×IQR)

上式中的x為各參加實驗室的結(jié)果,X為穩(wěn)健統(tǒng)計的中位值,IQR(inter quartile range)為四分位距。

取Z分比值的絕對值(|Z|)進(jìn)行結(jié)果判定,當(dāng)上述2個指標(biāo)的|Z|≤2時,結(jié)果為“滿意”;當(dāng)2個指標(biāo)的2<|Z|<3或者其中一個2<|Z|<3而另一個|Z|≤2,結(jié)果為“可疑”;當(dāng)1個或2個指標(biāo)的|Z|≥3時,結(jié)果為“不滿意”。

圖 1 六味安消膠囊酸水解溶液在不同品牌C18柱下的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of acid hydrolysis solution of Liuwei Anxiao capsules by different brands C18 columns C18 column: 250 mm×4.6 mm, 5 μm. 1. aloe emodin; 2. emodin; 3. acid hydrolysis product of Liuwei Anxiao capsules; 4. chrysophanol; 5. physcion.

3 結(jié)果與討論

3.1 不同品牌C18柱的分離情況

不同品牌C18柱的分離效果存在顯著性差異,僅控制柱效并不能保證色譜柱的分離效果。如圖1所示,在相同的色譜條件下,所用的4根色譜柱均為C18柱,均符合系統(tǒng)適用性規(guī)定,但其分離效果存在顯著性差異。大黃素與大黃酚在XTerra RP18和Spherisorb ODS1柱中的出峰順序相反;大黃素與樣品水解產(chǎn)物(難分離物質(zhì)對)在XTerra RP18與Spherisorb ODS1柱中能達(dá)到基線分離,在Discovery C18柱中僅能部分分離,而在Zorbax Eclipse XDB C18柱中二者共流出。

方法學(xué)復(fù)核實驗中使用的9種C18柱,有5種 C18柱無法將大黃素與樣品水解產(chǎn)物基線分離,選擇適宜色譜柱的成功率僅為55.6%(見表1)，且高柱效并不能保證上述難分離物質(zhì)對達(dá)到基線分離。這說明僅采用柱效作為系統(tǒng)適用性指標(biāo)并不適宜,建議改用大黃素與樣品水解產(chǎn)物的分離度作為系統(tǒng)適用性指標(biāo)。

表 1 不同品牌C18柱的分離結(jié)果

* based on the peak of emodin; # baseline separation (well separation): the resolutions of emodin and acid hydrolysis product of Liuwei Anxiao capsules (peak 2 and 3 in Fig. 1) was about 1.5 (not less than 1.5);R: resolution of the peak 2 and 3 in Fig. 1; C18column: 250 mm×4.6 mm, 5 μm.

A型和E型C18柱對大黃蒽醌類化合物的分離效果明顯優(yōu)于B型C18柱,這與大黃蒽醌類化合物結(jié)構(gòu)中含多個酚羥基(見圖2)可能會與A型柱的殘留硅羥基或E型柱的內(nèi)嵌極性基團(如酰胺基)相互作用,從而增強同系物之間的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。

圖 2 大黃蒽醌類化合物的結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structures of rhubarb anthraquinone compounds

3.2 不同品牌C18柱的測定結(jié)果

本次能力驗證直接采用大黃素和大黃酚對照品進(jìn)行色譜峰的定位,雖然E型C18柱中大黃素與大黃酚的出峰順序與A型和B型C18柱的出峰順序相反,但均未出現(xiàn)色譜峰定位的錯誤。各參加實驗室中總大黃素和大黃酚的含量與結(jié)合蒽醌中大黃素和大黃酚的含量的統(tǒng)計結(jié)果見表2。

不同品牌的C18柱的選擇性差異是影響測定結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵風(fēng)險因素。如選擇的C18柱不能有效分離大黃素與樣品水解產(chǎn)物,特別當(dāng)二者共流出時,總大黃素的測定結(jié)果明顯偏高。在最終上報的155家結(jié)果中,不滿意(|Z|≥3)的有36家,其中有21家(包括1家省級藥品檢驗所)選擇的C18柱出現(xiàn)了大黃素與樣品水解產(chǎn)物共流出的情況,這是導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確的最大風(fēng)險因素,占不滿意結(jié)果的58.3%。 A型和E型C18柱測定結(jié)果的整體滿意率明顯高于B型柱,更適于六味安消膠囊中大黃素和大黃酚的含量測定。在本次能力驗證中,A型(n=11)和E型(n=6)柱均能將大黃素和水解產(chǎn)物相互分離,整體滿意率分別為81.8%(部分實驗室由于操作失誤導(dǎo)致結(jié)果“可疑”)和100%;而B型柱的整體滿意率僅為65.9%(n=138),滿意率明顯偏低,與方法學(xué)復(fù)核的結(jié)果一致。

該方法中大黃素和大黃酚的測定適宜選用包括XBridge Shield RP18、XTerra RP18、Symmetry Shield RP18、Hypersil ODS2、Hypersil BDS C18、Spherisorb ODS1等A型和E型色譜柱以及InertSustain C18和SunFire C18等B型色譜柱。如同時考慮蘆薈大黃素、大黃素甲醚等其他特征成分,則Symmetry Shield RP18、XTerra RP18和Spherisorb ODS1色譜柱更適宜。

另外，有26家實驗室在能力驗證結(jié)果中僅注明采用C18柱,而未標(biāo)注色譜柱的品牌,說明有不少實驗室尚未意識到不同品牌C18柱存在選擇性差異的風(fēng)險。這是導(dǎo)致不同實驗室測定結(jié)果不一致或申請復(fù)驗糾紛的重要原因,應(yīng)引起重視。

表 2 不同品牌C18柱的統(tǒng)計結(jié)果

表 2 (續(xù))

|Z|≤2, 2<|Z|<3 and |Z|≥3: the results were satisfactory, suspicious or unsatisfactory, respectively, based on robust statistical method[18]; * refer to separation results among emodin, chrysophanol and possible interfering compounds, especially acid hydrolysis product of Liuwei Anxiao capsules; baseline separation (well separation): the resolutions were about 1.5 (not less than 1.5).

3.3 應(yīng)對措施探討

本實驗采用PQRI、USP、KUL和ACD數(shù)據(jù)庫指導(dǎo)色譜柱的篩選,以4個數(shù)據(jù)庫中均涵蓋且分離效果較好的XTerra RP 18色譜柱作為參比柱,將方法學(xué)復(fù)核和能力驗證中各實驗室所用典型色譜柱的實際分離效果與各數(shù)據(jù)庫選擇性差異的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行了比較(見表3)。結(jié)果表明,PQRI數(shù)據(jù)庫的分辨率最強,能成功預(yù)測出XBridge Shield RP18柱的分離效果較好,同時能預(yù)測出Symmetry C18、Zorbax Eclipse XDB C18、Discovery C18、Zorbax SB C18等色譜柱不適宜,預(yù)測成功率較高;而USP數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果與各色譜柱的實際情況差異最大,分辨能力最弱,分離效果好的Symmetry Shield RP18色譜柱與分離效果差的Zorbax SB C18色譜柱的F值差異不顯著,且與分離效果無明顯對應(yīng)關(guān)系;KUL和ACD數(shù)據(jù)庫對適宜色譜柱的預(yù)測有一定指導(dǎo)意義,但由于本方法適宜的色譜柱屬于A型和E型色譜柱,而這些類型不同品牌C18柱間的選擇性差異較大,很難在同一類型內(nèi)找到等效色譜柱,從B型柱中更難找到與A型或E型柱等效的色譜柱。

表 3 典型C18柱的實際分離效果與數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果的比較

PT: proficiency testing; Yes: emodin and chrysophanol could at least baseline separated from possible interfering ones; No: the above requirement couldn’t be met; -: the related columns were not used or unavailable in the corresponding databases; RSD: relative standard deviation of retention times of target compounds; * theFvalue was evaluated based on KUL column characterization system[11-14]; # the smaller theFvalue, more similar the selectivities of the columns.

4 結(jié)論

本文以《中國藥典》中收載的六味安消膠囊中大黃素與大黃酚的含量測定方法為例,通過能力驗證所得的詳實數(shù)據(jù)揭示了色譜柱是影響HPLC質(zhì)量控制方法測定結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵風(fēng)險因素。提示各相關(guān)實驗室在起草和執(zhí)行HPLC質(zhì)量控制方法時,應(yīng)考慮色譜柱間的選擇性差異,同時重視色譜柱的耐用性考察。建議國家藥典委員會等部門能夠組織開展難分離樣品適宜色譜柱的系統(tǒng)篩選工作并建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫,指導(dǎo)色譜柱的合理選擇,減少色譜柱間的選擇性差異所導(dǎo)致的測定結(jié)果不準(zhǔn)確。中藥樣品的基質(zhì)較復(fù)雜,如何在國外色譜柱研究成果的基礎(chǔ)上,結(jié)合中藥特征化合物的結(jié)構(gòu)特點,給出科學(xué)、可行的適宜色譜柱預(yù)測方案尚需進(jìn)一步探討。

致謝 感謝參加能力驗證項目NIFDC-PT-035的156家實驗室的積極參與和配合。

[1] Ye L P, Sun L, Wang M J, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2015, 35(6): 945

葉六平, 孫磊, 王明娟, 等. 藥物分析雜志, 2015, 35(6): 945

[2] Zhang W Q, Hu Q X, Zhang X, et al. J Chromatogr A, 2014, 1323: 87

[3] Wang M J, Zheng C, Hu C Q, et al. J Chin Pharm Sci, 2011, 20(11): 572

[4] Wang M J, Li Y P, Hu C Q. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2008, 28(11): 1940

王明娟, 李婭萍, 胡昌勤. 藥物分析雜志, 2008, 28(11): 1940

[5] Wang M J, Li Y P, Yang Y L, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2006, 26(1): 102

王明娟, 李婭萍, 楊亞莉, 等. 藥物分析雜志, 2006, 26(1): 102

[6] Gilroy J J, Dolan J W, Carr P W, et al. J Chromatogr A, 2004, 1026(1/2): 77

[7] Gilroy J J, Dolan J W, Snyder L R. J Chromatogr A, 2003, 1000(1/2): 757

[8] Wilson N S, Gilroy J J, Dolan J W, et al. J Chroamtogr A, 2004, 1026(1/2): 91

[9] Snyder L R, Maule A, Heebsh A, et al. J Chromatogr A, 2004, 1057(1/2): 49

[10] Snyder L R, Dolan J W, Carr P W. Anal Chem, 2007, 79(9): 3255

[11] Ivanyi T, HeudenY V, Visky D, et al. J Chromatogr A, 2002, 954(1/2): 99

[12] Visky D, Heyden Y V, Ivanyi T, et al. J Chromatogr A, 2003, 1012(1): 11

[13] Dehouck P, Visky D, Heyden Y V, et al. J Chromatogr A, 2004, 1025(2): 189

[14] Visky D, Haghedooren E, Dehouck P, et al. J Chromatogr A, 2006, 1101(1/2): 103

[15] Euerby M R, Petersson P. LC-GC Europe, 2000, 13: 665

[16] Petersson P, Euerby M R. J Sep Sci, 2005, 28(15): 2120

[17] Euerby M R, Petersson P. J Chromatogr A, 2005, 1088(1/2): 1

[18] China National Accreditation Service for Conformity Assessment. CNAS/GL02 Guidance on Statistic Treatment of Proficiency Testing Results and Performance Evaluation. (2014-09-15) [2016-04-12]. http://www.cnas.org.cn/fwzl/nlyzzl/index.shtml

中國合格評定國家認(rèn)可委員會. CNAS/GL02能力驗證結(jié)果的統(tǒng)計處理和能力評價指南. (2014-09-15) [2016-04-12]. http://www.cnas.org.cn/fwzl/nlyzzl/index.shtml

[19] China National Accreditation Service for Conformity Assessment. CNAS/GL03 Guidance on Evaluating the Homogeneity and Stability of Samples Used for Proficiency Testing. (2006-06-01) [2016-04-12]. http://www.cnas.org.cn/fwzl/nlyzzl/index.shtml

中國合格評定國家認(rèn)可委員會. CNAS/GL03能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南. (2006-06-01) [2016-04-12]. http://www.cnas.org.cn/fwzl/nlyzzl/index.shtml[20] Pharmacopoeia Commission of the People’s Republic of China. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, Part 1. Beijing: China Medical Science Press, 2015: 710

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典, 一部. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 710

National “12th Five-Year” Projects (No. 2014ZX09304307-002).

Influence of column selection in assay of emodin and chrysophanol in Liuwei Anxiao capsules

WANG Mingjuan, LIU Yadan, HU Xiaoru, HE Fengyan, XIANG Xinhua, DAI Zhong*, YU Jiandong, MA Shuangcheng*

(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Column selection is a factor of critical risk that may influence the accuracy of high performance liquid chromatography (HPLC) method. Assay of emodin and chrysophanol in Liuwei Anxiao capsules described in Chinese Pharmacopeia was taken as a typical example. Though 155 laboratories in the proficiency testing program all used C18columns, the 20 ones obtained incorrect results due to the co-elution of emodin and acid hydrolysis product of Liuwei Anxiao capsules in the selected C18columns. Statistical results showed that A-type (early developed columns with higher silicon hydroxyls residues) and E-type (with embedded or end-capping polar group) C18columns were more suitable for the assay of emodin and chrysophanol in Liuwei Anxiao capsules. It might attribute to the presence of phenolic hydroxyl groups in emodin and chrysophanol and interact with residual silicon hydroxyls in A-type columns or polar groups in E-type ones. To reduce the risk of unsuitable column selection, related laboratories should pay more attention to the robustness of columns when HPLC methods are established. The column selection for robustness could be based on peer-reviewed column classification databases, and the resolution of critical pair should be recommended to use as system suitability parameter.

high performance liquid chromatography (HPLC); column selection; critical risk factor; emodin; chrysophanol; Liuwei Anxiao capsules

10.3724/SP.J.1123.2016.08008

2016-08-07

國家“十二五”專項(2014ZX09304307-002).

O658

A

1000-8713(2016)11-1077-07

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(010)67095150,E-mail:daizhong@nifdc.org.cn(戴忠);Tel:(010)67095272,E-mail:masch@nifdc.org.cn(馬雙成).