基于微流控芯片的乳腺癌細(xì)胞微環(huán)境酸化檢測(cè)

嚴(yán) 偉, 徐德順, 查赟峰, 吳曉芳

(湖州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 湖州 313000)

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研究論文

基于微流控芯片的乳腺癌細(xì)胞微環(huán)境酸化檢測(cè)

嚴(yán) 偉, 徐德順, 查赟峰, 吳曉芳*

(湖州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 湖州 313000)

建立了基于微流控芯片的乳腺癌微環(huán)境酸化模型和動(dòng)態(tài)檢測(cè)微環(huán)境酸化情況的分析方法。設(shè)計(jì)了一種多層復(fù)合式微流控芯片,將乳腺癌細(xì)胞懸液引入含有水凝膠前體的芯片培養(yǎng)室后,在硝酸纖維素薄膜上固化形成3D培養(yǎng)支架。芯片通道連續(xù)灌流模擬血流供應(yīng),并將非電化學(xué)的pH檢測(cè)器引入芯片,通過(guò)圖像分析得到實(shí)時(shí)的pH變化。通過(guò)觀察癌細(xì)胞的存活率、增殖率、乳酸水平及pH值,分析微環(huán)境的酸化情況,同時(shí)與正常細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果表明，連續(xù)灌流培養(yǎng)7 d,乳腺癌細(xì)胞的存活率保持在90%以上;隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,芯片上癌細(xì)胞微環(huán)境的pH值逐漸降低,且灌流速度越低,pH值下降越明顯,而正常細(xì)胞微環(huán)境的pH值無(wú)明顯變化?；谖⒘骺匦酒奈h(huán)境酸化檢測(cè)平臺(tái)可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)微環(huán)境的pH值,有望成為相關(guān)腫瘤研究的有力工具。

微流控芯片;細(xì)胞微環(huán)境;酸化;乳腺癌

細(xì)胞微環(huán)境酸化是惡性腫瘤的特征之一,與正常細(xì)胞的氧化磷酸化代謝途徑不同,腫瘤細(xì)胞的代謝方式主要為糖酵解[1],其代謝終產(chǎn)物以乳酸為主。乳酸的大量產(chǎn)生及排泄障礙使腫瘤細(xì)胞處于較低的pH微環(huán)境中[2]。腫瘤微環(huán)境的酸化不僅影響癌細(xì)胞的代謝和遷移[3,4]，而且影響化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[5,6]。因此,建立腫瘤微環(huán)境酸化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)模型對(duì)腫瘤的代謝和治療具有重要意義。

腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境空間狹小、液體量少,其pH值難以用傳統(tǒng)的電化學(xué)pH計(jì)測(cè)出。目前,微量pH檢測(cè)方法主要包括pH敏感微電極法、pH敏感熒光染料法和核磁共振法等[7-9]方法,這些方法需要特殊的設(shè)備,且操作復(fù)雜、成本昂貴,很難在一般實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)展。現(xiàn)有的腫瘤微環(huán)境酸化檢測(cè)方法缺少仿真3D結(jié)構(gòu),不能模擬細(xì)胞的擴(kuò)散屏障所導(dǎo)致的酸性代謝產(chǎn)物蓄積,且難以實(shí)時(shí)檢測(cè),結(jié)果偏差較大。

微流控芯片技術(shù)因具有結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)靈活和規(guī)模集成的特點(diǎn)逐漸成為細(xì)胞研究的重要手段[10]。本研究以微流控芯片為平臺(tái)、海藻酸鈉水凝膠為載體,乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象,成功構(gòu)建了細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境。同時(shí)利用芯片通道的連續(xù)灌流模擬體內(nèi)的微血管系統(tǒng),以及時(shí)提供營(yíng)養(yǎng)、排除廢物。同時(shí)將造價(jià)低廉的非電化學(xué)pH指示器引入微流控芯片中,通過(guò)固定光源拍照,將顏色信號(hào)轉(zhuǎn)化為pH值,實(shí)現(xiàn)對(duì)微環(huán)境pH值的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

IX81激光共聚焦顯微鏡、AU2700全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司);聚二甲基硅氧烷(PDMS)前體及引發(fā)劑(美國(guó)Dow Corning公司);硝酸纖維素(nitrocellulose, NC)薄膜(英國(guó)Whatman公司); FE20酸度計(jì)(瑞士梅特勒-托利多公司); TS-2A微量注射泵(中國(guó)保定蘭格公司)。

吖啶橙(acridine orange, AO)、溴化乙錠(ethidium bromide, EB)(純度99%,美國(guó)Amresco公司);乳腺癌MCF-7細(xì)胞、乳房BHL-100細(xì)胞(中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供);海藻酸鈉、明膠、胰蛋白酶、氯化鈣(CaCl2)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、百里酚藍(lán)、酚酞、溴百里酚藍(lán)、甲基紅、氫氧化鈉(NaOH)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、臺(tái)盼藍(lán)染液(分析純,上海生工公司);DMEM培養(yǎng)基、McCoy’A培養(yǎng)基(美國(guó)ThermoFisher公司);所有溶液用二次滅菌的蒸餾水配制。

1.2 芯片制作

芯片采用標(biāo)準(zhǔn)軟蝕刻加工技術(shù),即在玻璃板上旋涂SU8光膠,然后遮蔽含有微通道圖形的掩膜,曝光及顯影處理后得到SU8模具。在含有SU8結(jié)構(gòu)的基板上澆注PDMS,獲得微結(jié)構(gòu)。芯片包含3層結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1a),頂層灌流通道的長(zhǎng)、寬、高分別為4 cm、140 μm、180 μm,中央厚度為220 μm,底部有一個(gè)6 mm×6 mm的方形凹槽,通道末端為直徑2.5 mm的圓形通孔,作為pH檢測(cè)口;中間層有一個(gè)5 mm×5 mm的方形通孔,作為細(xì)胞培養(yǎng)池;底層是玻璃平板。中間層與底層結(jié)合將直徑5 mm的紙片分裝于中間層底面的凹槽內(nèi)。中間層和底層等離子處理后封接,中間層NC膜分別用0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))明膠和2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))海藻酸鈉溶液處理并烘干,與頂層封接后得到芯片。

圖 1 (a)微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖及(b)拍照裝置Fig. 1 (a) Schematic representation of a microfluidic chip and (b) a photo device

1.3 芯片實(shí)驗(yàn)操作

先將微量注射器、毛細(xì)管和制備好的芯片于90 ℃烘烤1 h后,置于紫外燈下照射過(guò)夜。乳腺癌MCF-7細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),待細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)成長(zhǎng)期后制成密度為1×107cell/mL的細(xì)胞懸液。將200 μL細(xì)胞懸液緩慢注入芯片中,排除多余液體后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h,向芯片通道緩慢引入40 mmol/L CaCl2,引發(fā)海藻酸鈉聚合,以30 μL/h的速度進(jìn)行連續(xù)灌注培養(yǎng)(見(jiàn)圖2)。

圖 2 芯片灌流示意圖Fig. 2 Schematic representation of perfusion in a chip a. perfusion of cell suspension; b. cell suspension in cell culture pools; c. perfusion of culture solutions; PDMS: polydimethylsiloxane.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)分析

細(xì)胞連續(xù)灌流培養(yǎng)5 d后,將熒光染液AO-EB(1∶1, v/v)注入芯片通道染色10 min后,將芯片置于激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè),觀察芯片培養(yǎng)池內(nèi)部細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)。同時(shí)為考察芯片灌流與普通靜態(tài)培養(yǎng)的差異,將相同數(shù)量的細(xì)胞放入培養(yǎng)皿中靜態(tài)培養(yǎng),定期更換培養(yǎng)液,于5 d后將其熒光染色，同芯片培養(yǎng)情況進(jìn)行對(duì)比。

圖 3 細(xì)胞熒光染色圖(放大倍數(shù)10×10)Fig. 3 Fluorescent staining photos of cells (magnification times for 10×10) a. perfusion culture for 1 d; b. perfusion culture for 5 d; c. static culture for 1 d; d. static culture for 5 d.

將細(xì)胞分別培養(yǎng)1～7 d后,拆開(kāi)芯片,從細(xì)胞培養(yǎng)池中取出水凝膠微球于干凈的離心管中,加入生理鹽水使水凝膠微球溶解,再加入適量胰酶消化細(xì)胞團(tuán)塊,以2 000 r/min離心1 min后,沉淀重懸于200 μL PBS溶液,混勻,滴加臺(tái)盼藍(lán)染液染色,加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)及存活細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞存活率為存活細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的百分比。細(xì)胞增殖率(p)是培養(yǎng)不同天數(shù)的細(xì)胞數(shù)(nd)相對(duì)于前一天的細(xì)胞數(shù)(nd-1)增加的比率,即p=(nd-nd-1)/nd-1×100%。

1.5 pH檢測(cè)器構(gòu)建

稱(chēng)取0.5 mg百里酚藍(lán)、10 mg酚酞、6 mg溴百里酚藍(lán)、1.2 mg甲基紅，加入10 mL 95%(v/v)乙醇水溶液,用0.01 mol/L NaOH滴定,直至溶液變?yōu)榫G色,將此溶液作為指示劑。將指示劑定量滴入芯片通道出口的pH檢測(cè)器后,隨pH值的不同而呈現(xiàn)不同顏色。將芯片插入帶有固定光源的拍照裝置(見(jiàn)圖1b)進(jìn)行拍照后,通過(guò)Photoshop CS2軟件分析照片的紅綠藍(lán)色彩(RGB)模式值,作標(biāo)準(zhǔn)曲線,將光學(xué)數(shù)值轉(zhuǎn)變?yōu)閜H值,從而實(shí)現(xiàn)pH值的測(cè)定。

1.6 微環(huán)境酸化檢測(cè)

以30 μL/h的灌流速度持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,分別收集1、2、3、4、5、6、7 d時(shí)的灌流液,比較其乳酸水平和pH值的對(duì)應(yīng)關(guān)系,同時(shí)在相同的培養(yǎng)條件下比較乳腺癌MCF-7細(xì)胞和正常乳房BHL-100細(xì)胞在7 d內(nèi)的微環(huán)境pH值的變化情況。同時(shí)通過(guò)降低灌流速度，考察其對(duì)微環(huán)境酸化情況的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 3D腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的模擬

2.1.1 腫瘤間質(zhì)的模擬

明膠處理過(guò)的NC膜具有親水作用,在疏水性PDMS材料上形成親水區(qū),一定濃度的細(xì)胞懸液通過(guò)通道灌流進(jìn)入NC膜區(qū)域后,在重力和表面張力的作用下迅速鋪滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)池。細(xì)胞懸液進(jìn)入培養(yǎng)池后,與NC膜上的海藻酸鈉逐漸混合,當(dāng)接觸到Ca2+時(shí)海藻酸鈉固化為水凝膠微球,為3D細(xì)胞培養(yǎng)提供支撐。水凝膠微球中的明膠和海藻酸鈉含有選擇素和整合素成分,具有促進(jìn)細(xì)胞黏附的作用。水凝膠微球?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供了適宜的間質(zhì)硬度及支撐、連接和營(yíng)養(yǎng)作用,同時(shí)可避免流體剪切力對(duì)細(xì)胞的傷害,很好地模擬了體內(nèi)腫瘤間質(zhì)。

2.1.2 腫瘤實(shí)質(zhì)的模擬

體內(nèi)細(xì)胞均為3D立體式生長(zhǎng)而非平面生長(zhǎng)。將芯片進(jìn)行灌流培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)，均培養(yǎng)1 d和5 d,分別向各自細(xì)胞培養(yǎng)池中引入AO-EB(1∶1, v/v)染液染色,用激光共聚焦顯微鏡觀察,比較兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞培養(yǎng)池中細(xì)胞與間質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的變化和不同(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明,在灌流條件下,培養(yǎng)1 d時(shí),乳腺癌細(xì)胞由于生長(zhǎng)時(shí)間尚短并未聚集形成微球(圖3a);而培養(yǎng)5 d時(shí),細(xì)胞聚集生長(zhǎng),形成大小不等的微球(圖3b),提示細(xì)胞呈3D立體式生長(zhǎng),與體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)方式接近。而在靜態(tài)條件下，培養(yǎng)1 d時(shí)(圖3c)與灌流培養(yǎng)相比,二者無(wú)明顯差別;但隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,灌流培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)下的細(xì)胞雖然在成球速度上差別不大,但細(xì)胞存活率明顯提高(圖3d),說(shuō)明灌流培養(yǎng)比靜態(tài)培養(yǎng)更接近體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。

圖 6 乳腺癌和乳房細(xì)胞的微環(huán)境酸化情況(n=3)Fig. 6 Microenvironment acidification of breast cancer cells and breast cells (n=3) a. the breast cancer MCF-7 cell (30 μL/h); b. the normal BHL-100 cell (30 μL/h); c. the breast cancer MCF-7 cell (30 μL/h); d. the breast cancer MCF-7 cell (6 μL/h).

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)分析

在灌流速度為30 μL/h時(shí),分別連續(xù)培養(yǎng)1、3、5、7 d,計(jì)算細(xì)胞的存活率;在此條件下,連續(xù)灌流培養(yǎng)7 d,計(jì)算細(xì)胞的增殖率(見(jiàn)圖4)。結(jié)果表明,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,細(xì)胞存活率逐漸下降,但一直保持在90%以上;細(xì)胞在第1 d時(shí)的增殖率最高,達(dá)到45%，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,細(xì)胞增殖率逐漸下降,但仍保持在20%以上。細(xì)胞的密度隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而持續(xù)增加,說(shuō)明細(xì)胞在水凝膠微球中不斷增殖,與2D細(xì)胞培養(yǎng)相比,由于營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)空間的限制,倍增時(shí)間顯著緩慢。

圖 4 灌流培養(yǎng)下細(xì)胞的(a)存活率和(b)增殖率(n=3)Fig. 4 (a) Viability and (b) proliferation rates in perfusion culture of the cells (n=3)

2.3 微環(huán)境的酸化檢測(cè)

將濃度為0.2 mol/L NaH2PO4和Na2HPO4按適當(dāng)比例混合,配制pH值為6.5～7.4的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。pH檢測(cè)器中加入定量的指示劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液后,因pH值的不同而顯示出不同顏色,通過(guò)軟件分析不同pH值對(duì)應(yīng)的RGB模式中的紅(R)、綠(G)、藍(lán)(B)值。研究表明,R值與pH值的關(guān)系最為密切,將R值取對(duì)數(shù)后與pH值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖5),可獲得不同顏色對(duì)應(yīng)的pH值。

圖 5 lg R與pH值的關(guān)系(n=3)Fig. 5 Relationship of lg R and pH (n=3) R: the value of red for RGB abbreviated for red, green and blue.

在灌流速度為30 μL/h時(shí),連續(xù)培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞7 d,每天測(cè)定癌細(xì)胞的pH值和乳酸水平(見(jiàn)圖6)。結(jié)果表明,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,乳腺癌MCF-7細(xì)胞微環(huán)境的pH值逐漸下降;在6 d時(shí)，逐漸形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的酸化微環(huán)境,腫瘤細(xì)胞在此酸化微環(huán)境下仍能正常增殖。在相同的條件下培養(yǎng)乳房BHL-100細(xì)胞,其微環(huán)境的pH值始終保持在中性范圍內(nèi)(圖6b),與腫瘤細(xì)胞形成鮮明對(duì)比。同時(shí)對(duì)比MCF-7細(xì)胞的pH值和乳酸水平,發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著關(guān)聯(lián)(圖6c),說(shuō)明乳酸是引起pH值變化的重要原因。

本實(shí)驗(yàn)考察了灌流速度對(duì)乳腺癌細(xì)胞微環(huán)境酸化情況的影響(見(jiàn)圖6d)。在不影響MCF-7細(xì)胞存活率的基礎(chǔ)上,將灌流速度降至6 μL/h,監(jiān)測(cè)其在7 d內(nèi)微環(huán)境的pH值,由于營(yíng)養(yǎng)物的供給和代謝物的排泄存在一定障礙,MCF-7細(xì)胞在3 d時(shí)就形成了相對(duì)穩(wěn)定的酸化微環(huán)境。

3 結(jié)論

利用微流控芯片的特性可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞微環(huán)境的有效模擬[11,12]和對(duì)微環(huán)境酸化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本實(shí)驗(yàn)借助海藻酸鈉與Ca2+固化為水凝膠的特性,為細(xì)胞生長(zhǎng)提供支架,構(gòu)建3D細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境,同時(shí)將價(jià)格低廉的非電化學(xué)pH檢測(cè)器集成到芯片上,實(shí)現(xiàn)對(duì)微環(huán)境pH值的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本實(shí)驗(yàn)建立的腫瘤細(xì)胞微環(huán)境酸化檢測(cè)平臺(tái)為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞周?chē)釅A度的變化、分析癌細(xì)胞耐藥和轉(zhuǎn)移提供了科學(xué)依據(jù)。

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Detection of microenvironment acidification in breast cancer cells by microfluidic chips

YAN Wei, XU Deshun, ZHA Yunfeng, WU Xiaofang*

(Huzhou Center for Disease Control and Prevention, Huzhou 313000, China)

An analytical method was established for dynamic detection of microenvironment acidification in a breast cancer cell model based on microfluidic chips. A multilayer hybrid microfluidic chip was designed. When the suspension of the breast cancer cells entered the chips the hydrogel grids would become skeleton for 3D cultures. Continuous perfusion in microfluidic chip channels was used to mimic blood flow in vivo. And the non-electrochemical pH sensor was introduced into the chips to give the real-time changes of pH by image analysis. Cell viabilities, cell proliferations, lactic acid levels and pH values of cancer cells were detected to analyze microenvironment acidification, while comparing with the normal cells. Continuous perfusion for 7 d, the cell viability remained above 90%. With the increase of culturing days, the pH of the tumor microenvironment decreased gradually. The lower perfusion rates, the lower pH values, but the pH of the normal cells microenvironment had no obvious change. The microenvironment acidification detection platform of the microfluidic chip could detect microenvironment pH in real time, and it is a useful tool for cancer research.

microfluidic chips; cellular microenvironment; acidification; breast cancer

10.3724/SP.J.1123.2016.07011

2016-07-09

O658

A

1000-8713(2016)11-1043-05

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:y1515038@163.com.