白芨的離體培養(yǎng)

張豆豆, 彭曉英， 朱永州， 楊亞博， 敖東陽

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 湖南 長沙 410128； 2.慈利縣龍?zhí)逗渔?zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站， 湖南 慈利 427228)

白芨的離體培養(yǎng)

張豆豆1, 彭曉英1， 朱永州2， 楊亞博1， 敖東陽1

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 湖南 長沙 410128； 2.慈利縣龍?zhí)逗渔?zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站， 湖南 慈利 427228)

為快速生產(chǎn)大量優(yōu)質(zhì)白芨種苗，以白芨種子為外植體進(jìn)行離體快繁研究。結(jié)果表明： MS基本培養(yǎng)基可促進(jìn)白芨種子的快速無菌萌發(fā)，當(dāng)6-BA的濃度為1.0 mg/L時(shí)可以促進(jìn)幼苗的快速分裂生長，添加了2 mg/L的2,4-D的培養(yǎng)基可有效促進(jìn)愈傷組織的形成。種子苗原球莖經(jīng)切割后在MS+2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率為85%，1.0 mg/L的6-BA和0.15 mg/L的NAA配比可以誘導(dǎo)叢生芽的生長和增殖， 添加了70 g/L香蕉泥和0.5 mg/L NAA的1/2MS培養(yǎng)基可有效促進(jìn)根的生長。無菌發(fā)芽的種子苗移栽率可以達(dá)90%, 而試管苗移栽的成活率較低，但隨離體培養(yǎng)時(shí)間的延長有所提高。

白芨； 愈傷組織； 快速繁殖； 增殖系數(shù)

白芨 (Bletillastriata)又名甘根、紫蘭[1]等，為蘭科( Orchidaceae)白芨屬多年生草本植物[2]。白芨花色鮮艷，具有極高的觀賞價(jià)值[3]；其地下假鱗莖作為一味價(jià)值極高的中藥材，具有補(bǔ)肺、止血、消腫、生肌、斂瘡的作用[4]。近年來，野生白芨的數(shù)量在隨著不斷地過度采挖而急劇減少[5]，已被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生藥用植物之一[6]。隨著我國中藥事業(yè)的發(fā)展，白芨在臨床上的應(yīng)用不斷擴(kuò)大，用藥需求也急劇增加[7]，且白芨中含量較高的白芨膠可作為乳化劑廣泛應(yīng)用于食品、美容及化工領(lǐng)域[8]。白芨雖有數(shù)以萬計(jì)的種子，卻大都無胚乳，在自然界很難萌發(fā)和生長[9]，且其分株繁殖周期長，繁殖率低[10]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足商品化生產(chǎn)的需求。因此，保護(hù)野生白芨，解決白芨的資源問題已成為當(dāng)務(wù)之急。為了解決白芨的資源供求問題，縮短其育種周期，滿足對市場的需求，前人利用組織培養(yǎng)技術(shù)，分別從外植體的選取、消毒的方法以及生長調(diào)節(jié)劑和營養(yǎng)物質(zhì)的添加方面對白芨的快速繁殖進(jìn)行了探討。為快速地大量繁殖種苗，本試驗(yàn)擬以白芨種子為外植體來進(jìn)行離體培養(yǎng)，建立一套較為完整的白芨快繁體系，擺脫季節(jié)和時(shí)間的限制，短時(shí)期內(nèi)獲得大量適于野外生長的白芨幼苗，為實(shí)現(xiàn)白芨的快速繁殖和工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為成熟未開裂的野生白芨蒴果，采自慈利縣金坪鎮(zhèn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 白芨蒴果的消毒及種子接種 用75%的酒精棉球擦拭蒴果表面，用解剖刀剖開果實(shí)中部，用鑷子夾取種子接種至分別添加了不同2，4-D和6-BA配比的培養(yǎng)基中(見表1)，培養(yǎng)基pH值為5.8，蔗糖含量為3%，瓊脂為0.6%，置于組培室中光照2000 lx，16 h/d,溫度25 ℃條件下培養(yǎng)，記錄種子和愈傷組織啟動的情況。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖 將部分長成的原球莖及幼苗的葉片經(jīng)切割之后分別接種到不同2，4-D和6-BA配比的培養(yǎng)基中(見表2)，觀察記錄愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖情況。

1.2.3 叢生芽的分化及增殖 將愈傷組織接到以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA和NAA激素配比的培養(yǎng)基中(見表3)，置于組培室中培養(yǎng)，記錄叢生芽的誘導(dǎo)與增殖情況，分析數(shù)據(jù)得出增殖系數(shù)。

1.2.4 壯苗生根培養(yǎng) 將株高約3 cm,長勢較好的幼苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng),壯苗生根培養(yǎng)以添加0.5～1.0 mg/L的NAA為主，另添加70 g/L的香蕉泥或1%的番茄汁來增強(qiáng)效果。培養(yǎng)基設(shè)為六種(見表4)，每種培養(yǎng)基接種5瓶，置于組培室中培養(yǎng)，記錄幼苗的生根狀況。

1.2.5 煉苗與移栽 將株高4 cm，生有3 cm長根的白芨試管苗和無菌萌發(fā)的種子苗分別在自然光下進(jìn)行煉苗培養(yǎng)，打開培養(yǎng)基瓶蓋,洗凈培養(yǎng)基后于自然光下水培養(yǎng)3天以上，待其適應(yīng)自然環(huán)境再將其移栽入盆中培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基對白芨種子誘導(dǎo)的影響

接種到培養(yǎng)基上的種子在20天左右開始萌動，由原來的黃褐色逐漸變?yōu)榫G色；30天后部分種子長出帶淺綠色芽點(diǎn)的小球狀體，即原球莖；40天后可觀察到接種到①號、②號和④號培養(yǎng)基上的芽點(diǎn)突出長成翠綠色的小尖芽(見圖1)；接種到③號和⑤號培養(yǎng)基上的原球莖在其表面產(chǎn)生了淺黃綠色的較疏松的愈傷組織。通過觀察對比發(fā)現(xiàn)，不同的培養(yǎng)基對種子萌動的影響各有差別。其中萌發(fā)率最高的是①號MS 0培養(yǎng)基，萌發(fā)率高達(dá)95%(見圖1a)，②號和④號培養(yǎng)基中的萌發(fā)情況次之，分別為80%和85%，③號和⑤號的種子啟動時(shí)伴有愈傷組織的形成，但萌發(fā)率最低(見表1)。由表1可知，①號MS 0培養(yǎng)基具備了白芨種子萌發(fā)所需的主要營養(yǎng)物質(zhì)，比添加了生長調(diào)節(jié)劑2,4-D和6-BA的培養(yǎng)基更能促進(jìn)白芨種子的正常萌發(fā)；6-BA含量較高的培養(yǎng)基(②號、④號)比2,4-D含量較高的培養(yǎng)基中種子的萌發(fā)率增加，說明6-BA可促進(jìn)白芨種子的萌發(fā)和芽的分化，而2,4-D的添加則可促進(jìn)白芨幼苗啟動過程中愈傷組織的形成。

表1 不同培養(yǎng)階段種子的萌動Tab.1 Seedinitiationrateofdifferenttrainingstages培養(yǎng)基編號(MS)6—BA(mg/L)2,4—D(mg/L)萌動率(%)20天30天40天①0010.05095②2.00.50.23080③0.52.00.12570④1.001.03585⑤01.00.12060

2.2不同生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對愈傷組織誘導(dǎo)和增殖的影響

經(jīng)切割后轉(zhuǎn)接在添加6-BA和2,4-D不同濃度配比的培養(yǎng)基上的種子苗原球莖在15天后開始在周邊長出淺綠色的疏松的小塊愈傷組織，30天后愈傷組織增多，生長致密，且有部分愈傷組織開始分化出翠綠色的小芽尖。而葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率極低，未見明顯的愈傷組織形成，說明白芨葉片不適于誘導(dǎo)愈傷組織，這可能與白芨葉片中缺乏具分裂能力的形成層細(xì)胞有關(guān)。對以原球莖作為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果如表2。

從表2中可知，原球莖愈傷組織的誘導(dǎo)率隨2,4-D濃度的增大而增加，⑤號培養(yǎng)基2,4-D濃度為2 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可達(dá)到85%，0.5 mg/L的6-BA的添加更有助于愈傷組織的誘導(dǎo)且愈傷組織顏色偏綠且出現(xiàn)淺綠色芽點(diǎn)，質(zhì)地致密，更有利于后期分化；但隨著6-BA濃度的增大，愈傷組織誘導(dǎo)率有所下降，且出現(xiàn)少許褐化現(xiàn)象，表現(xiàn)出過多6-BA對愈傷組織誘導(dǎo)的抑制作用。

2.3不同生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對白芨幼苗叢生芽分化和增殖的影響

將具有芽點(diǎn)的愈傷組織接種到叢生芽分化和增殖的培養(yǎng)基中，30天后觀察到嫩芽尖伸長且叢生芽數(shù)量增加，50天增殖系數(shù)最高。由表3可知，添加不同濃度配比NAA和6-BA的培養(yǎng)基對叢生芽的增殖有不同的影響作用，隨6-BA濃度的增大，芽的增殖系數(shù)增加，6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，芽的增殖系數(shù)最高可達(dá)到3.72，但當(dāng)濃度升高為1.5 mg/L時(shí)，芽的增殖系數(shù)卻降低。培養(yǎng)基中添加0.15 mg/L NAA比0.2 mg/L NAA更能促進(jìn)芽的增殖和生長。故培養(yǎng)基為②MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L時(shí)增殖效果最好，且幼苗生長的顏色翠綠鮮艷，長勢較好(見圖1b、c、d)。

表3 不同生長調(diào)節(jié)劑對叢生芽增殖的影響Tab.3 Influenceofdifferentgrowthregulatortoclumpbudgeneration培養(yǎng)基編號(MS)6—BA(mg/L)NAA(mg/L)接種芽數(shù)(個(gè))增殖芽數(shù)(個(gè))增殖系數(shù)①0.50.1550901.8②1.00.15501863.72③1.50.15501603.2④0.50.2501002.0⑤1.00.2501082.16⑥1.50.2501452.9

2.4不同培養(yǎng)基對白芨壯苗生根的影響

將株高約3 cm的白芨苗接種到壯苗生根的培養(yǎng)基中，30天后莖基部有白色突起，隨后向培養(yǎng)基內(nèi)延伸，長成白色的幼根。不同培養(yǎng)基對白芨壯苗生根狀況的影響如表4所示：基本培養(yǎng)基為1/2MS時(shí)，生根狀況較MS好；當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)為最適促生根濃度，植株長勢較好，葉片翠綠(見圖1e)；而當(dāng)培養(yǎng)基為②1/2MS+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥70 g/L時(shí)，由于香蕉泥的存在，葉片長勢較其他均大，且植株較高(見圖1f,g)，可以得出香蕉泥對白芨幼苗的壯苗生根具明顯促進(jìn)作用；番茄汁對白芨壯苗有一定的影響，但作用不如香蕉泥明顯；IAA對白芨幼苗壯苗生根并無較大影響。

表4 不同培養(yǎng)基對白芨壯苗生根的影響Tab.4 Influenceofdifferentculturemediumonbletillaseed-lingroot培養(yǎng)基編號基本培養(yǎng)基NAA(mg/L)IAA(mg/L)香蕉泥(g/L)番茄汁(%)生根率(%)①1/2MS0.592②1/2MS0.57093③MS1.01.065④MS1.00.570⑤MS1.00.5170⑥MS1.00.57075

2.5不同幼苗經(jīng)移栽后的生長情況

不同的試管苗和無菌種子幼苗經(jīng)移栽后，成活率有很大差異，如表5所示，相同條件下移栽種子苗的成活率可達(dá)90%，較試管苗的高，且生長較好。而培養(yǎng)瓶內(nèi)生長不同時(shí)間的試管苗經(jīng)移栽后成活率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增大，生根后繼續(xù)培養(yǎng)45天之后的試管苗經(jīng)移栽后成活率可達(dá)33.3%。

表5 移栽苗的生長狀況Tab.5 Thegrowthconditionsoftransplantseedling移栽苗的類型移栽苗數(shù)成活苗數(shù)成活率(%)無菌種子苗50459015天后試管苗300030天后試管苗30413.345天后試管苗301033.3

圖1 白芨的離體培養(yǎng)(a.白芨種子的誘導(dǎo) b.c.d.叢生芽的誘導(dǎo)與增殖 e.f.g.白芨幼苗的壯苗及生根)Fig. 1 In vitro culture of Bletilla

3 結(jié)論與討論

白芨成熟蒴果中的種子極其微小但數(shù)量極多，利用白芨種子萌發(fā)進(jìn)行快速繁殖，在較短時(shí)間內(nèi)可以獲得大量比較合格的種子幼苗，移栽成活率可達(dá)90%。為實(shí)現(xiàn)快速增殖，該研究還嘗試通過器官發(fā)生型途徑即在白芨種子苗萌動過程中誘導(dǎo)愈傷組織并分化叢芽來進(jìn)行培養(yǎng)。

3.1不同濃度配比的植物生長調(diào)節(jié)劑對白芨種子離體誘導(dǎo)的影響

經(jīng)試驗(yàn)可知，MS 0培養(yǎng)基對種子的正常萌發(fā)起促進(jìn)作用，添加不同濃度配比6-BA和2,4-D的MS培養(yǎng)基對白芨種子的無菌萌發(fā)和啟動具有明顯的不同效果，其中1 mg/L 6-BA的適量添加能促進(jìn)種子的萌發(fā)和芽的分化，且原球莖的分化時(shí)間較快并易成型，這與袁寧等[11]研究的結(jié)果相似；添加2 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基能促進(jìn)幼苗萌動過程中愈傷組織的形成，從而改變種子苗萌發(fā)的途徑，轉(zhuǎn)為器官發(fā)生型途徑，愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖最適培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA，這與石云平等[12]對誘導(dǎo)白芨愈傷組織的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的問題一樣，在該過程中容易發(fā)生褐化現(xiàn)象，今后還需要進(jìn)一步探討其原因并在培養(yǎng)基中加入適量活性炭或抗壞血酸[13]以減輕褐化的抑制作用。

6-BA和NAA的協(xié)同作用極大地促進(jìn)了愈傷組織的分化和芽的增殖，江勝徳等[14]還認(rèn)為NAA的影響要大于6-BA,本試驗(yàn)中最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)高達(dá)3.72，這也與前人的結(jié)論相一致并與葉靜等[15]的報(bào)道相似，說明此類激素配比對白芨叢生芽誘導(dǎo)增殖有良好的效果。

3.2不同復(fù)合性營養(yǎng)物質(zhì)對白芨誘導(dǎo)的影響

已有多項(xiàng)研究表明，培養(yǎng)基中不同復(fù)合性營養(yǎng)物質(zhì)(如馬鈴薯汁、番茄汁、椰子汁、蜂王漿等)的添加可促進(jìn)對離體培養(yǎng)中植物組織的生長發(fā)育[16-18]。有研究認(rèn)為，番茄汁對白芨無根苗的生根和壯苗有明顯的促進(jìn)作用，而本試驗(yàn)中白芨的壯苗生根培養(yǎng)基以1/2MS+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥70 g/L的效果最為顯著，香蕉泥的添加雖然對生根率的影響不大,但生根試管苗的植株較高且葉片長勢好,具光澤，說明香蕉泥對白芨的生根和壯苗狀況有較好的促進(jìn)作用。

3.3不同培養(yǎng)時(shí)間對白芨試管苗生根移栽的影響

已有報(bào)道表明經(jīng)移栽后的白芨無菌種子苗成活率較高[19]，本研究中結(jié)果也是一樣，但生根的試管苗移栽的成活率卻極低，且出現(xiàn)隨瓶內(nèi)生根培養(yǎng)時(shí)間的延長而成活率逐漸升高的現(xiàn)象。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，白芨無菌種子苗在生長的過程中會在莖基部膨大形成球形的原球莖，繼而在原球莖上長出不定根吸收基質(zhì)的水分和無機(jī)鹽，輸送到植株地上部分，能通過自養(yǎng)成活。而離體培養(yǎng)不定芽生根不久形成的試管苗一旦離開培養(yǎng)基栽培到基質(zhì)中就會根部腐爛致死，但如果在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至45天之后，部分試管苗的基部也會形成類原球莖，萌發(fā)出根，從而能夠移栽成活。這和曾經(jīng)報(bào)道的盾葉薯蕷[20]試管苗移栽的研究相似，故今后可以著眼于誘導(dǎo)白芨試管苗類原球莖的發(fā)生及提高試管苗成活率的研究，從而可以脫離種子苗培養(yǎng)的限制，實(shí)現(xiàn)真正意義上的離體培養(yǎng)快速繁殖。

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CultureinvitroofBletillastriata

ZHANG Doudou1, PENG Xiaoying1, ZHU Yongzhou2, YANG Yabo1, AO Dongyang1

(1.Bioscience and Technology College , Hunan Agricultural University,Changsha 410128, China; 2.Longtanhe Agro-technical Station in Cili, Cili 427228, China)

To propagate the high quality seedlings ofBletillastriatarapidly, the seeds were used as explants for in vitro culture.The results showed that, MS basic medium could promote the rapid aseptic germination of bletilla seeds.When the concentration of 6-BA was 1.0 mg/L could promote the rapid growth of seedlings.The medium added with 2 mg/L 2, 4-D could effectively promote the formation of callus.The callus induction rate on the medium of MS+2 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L 6-BA was 85%. 1.0 mg/L 6-BA and 0.15 mg/L NAA could induce the rapid proliferation of clump buds.And the medium of 1/2MS added with 0.5 mg/L NAA and 70 g/L banana puree could effectively promote the root development.The transplant survival rate of aseptic seedling was 90%，whereas the survival rate of the plantlets was lower.

Bletillastriata; callus; rapid propagation; proliferation coefficient

2016-07-15

長沙市科技局一般項(xiàng)目(K1406021-21)；2014年度湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院大學(xué)生創(chuàng)新性研究項(xiàng)目。

張豆豆(1993-)，女，河南省漯河市人，本科，研究方向：生物技術(shù)專業(yè)。

彭曉英，女，博士，副教授；E-mail:xypeng@hunau.net。

S 682.31; S 567.9

A

1003-5710(2016)05-0047-05

10. 3969/j. issn. 1003-5710. 2016. 05. 009

(文字編校：龔玉子)