超疏水釉質(zhì)表面抑制黏蛋白吸附和細(xì)菌黏附

殷佳莉，唐旭炎，李全利，曹 穎

超疏水釉質(zhì)表面抑制黏蛋白吸附和細(xì)菌黏附

殷佳莉，唐旭炎，李全利，曹 穎

目的 探討涂有超疏水材料釉質(zhì)片表面對于黏蛋白吸附和變形鏈球菌黏附的影響。方法 制備牛牙釉質(zhì)塊若干，隨機(jī)分為兩組：用十七氟癸基三甲氧基硅烷處理釉質(zhì)片作為實(shí)驗(yàn)組，用去離子水處理牙釉質(zhì)片作為空白對照組。用場發(fā)射掃描電鏡對樣品分別面進(jìn)行檢測。對兩組樣品分別進(jìn)行接觸角和唾液黏蛋白的吸附的測定。通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察樣品表面生物膜形態(tài)特征以及計(jì)數(shù)菌落形成單位評估樣品表面變形鏈球菌生物膜形成情況。結(jié)果 場發(fā)射掃描電鏡檢測樣品表面可見實(shí)驗(yàn)組與對照組形貌不同。接觸角測試結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的接觸角明顯大于對照組的接觸角（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組樣品的唾液黏蛋白的吸附量明顯少于對照組（P＜0.05）。場發(fā)射掃描電鏡觀察結(jié)果顯示2 h和24 h的實(shí)驗(yàn)組樣品表面均只有極少量的菌落，而對照組樣品表面有大量的菌斑生物膜。48 h后，兩組樣品表面均被大量細(xì)菌生物膜完全覆蓋。菌落形成單位計(jì)數(shù)結(jié)果與掃描電鏡結(jié)果一致。結(jié)論 涂有超疏水材料釉質(zhì)片表面對于黏蛋白吸附和變形鏈球菌生物膜形成有抑制作用。

牙菌斑生物膜；超疏水；釉質(zhì)表面；唾液黏蛋白；變形鏈球菌

牙菌斑是嵌入到保護(hù)性基質(zhì)和細(xì)菌聚合物中的復(fù)雜的多物種生物膜［1-2］。牙菌斑是齲病與牙周病的致病因素之一［3-4］。同時(shí)，牙菌斑中的細(xì)菌以及牙周組織炎癥也與許多全身疾病相關(guān)［5］。因此，控制口腔牙菌斑生物膜對于人類健康具有非常積極的意義。目前最常用的方法就是機(jī)械清除法，包括刷牙、使用牙線等。這些方法可以清除牙面上已經(jīng)形成的牙菌斑，但是大多數(shù)個(gè)體難以保持長期達(dá)到菌斑控制的標(biāo)準(zhǔn)［6］。因此，許多口腔護(hù)理產(chǎn)品中加入抗菌藥物以確保效果。常用的有氯己定和三氯生［7］，這兩種均為廣譜抗菌劑，因此這些試劑最大的缺點(diǎn)是長期使用會產(chǎn)生耐藥性以及引起口腔菌群失調(diào)［6］。該研究是在牙釉質(zhì)表面形成超疏水表面，研究該表面抑制口腔致病細(xì)菌的黏附和定植的效果，為超疏水納米膜在齲病預(yù)防領(lǐng)域提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）和蔗糖購自美國Sigma公司；其它試劑均購于上海阿拉丁試劑公司。接觸角測試儀（JGW-360A1，承德惠城儀器公司）；多功能酶標(biāo)儀（ELX800，美國BioTek儀器有限公司）；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Sirion 200，美國FEI公司）；厭氧培養(yǎng)箱（DG250，廣州華粵行儀器有限公司）。

1.2 牙片制備 從屠宰場獲取牛牙，用手術(shù)刀片剔除牙上軟組織。將牙齒用3%次氯酸鈉處理，以除去細(xì)菌，并用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗。由水冷金剛砂片慢速切割機(jī)制備的4 mm×4 mm×2 mm釉質(zhì)塊，挑選100片無裂縫完整的釉質(zhì)片。先后用600、1 200、2 400、4 000粒度的金剛砂紙拋光釉質(zhì)片。接著使用丙酮超聲清洗20 min，隨后使用無水乙醇超聲20 min，最后再用離子水超聲清洗20 min。清洗完成后置于去離子水中4℃ 儲存，備用。

1.3 樣本制備 將上述釉質(zhì)片先用紫外線殺菌30 min，然后用37%磷酸酸蝕30 s，PBS沖洗3次，烘干備用。將釉質(zhì)片隨機(jī)分成兩組，分別做下述處理：將樣品用去離子水微微濕潤后，浸沒于十七氟癸基三甲氧基硅烷液中。24 h后取出樣品，吹去多余液體，作為實(shí)驗(yàn)組樣品備用。將樣品浸沒于去離子水中，作為對照組樣品備用。

1.4 樣品表面性質(zhì)檢測

1.4.1 接觸角檢測 樣品置于接觸角測試儀的載物臺上，用移液管滴取3 μl去離子水于樣品表面。使用軟件捕獲液滴圖片并傳送到計(jì)算機(jī)用于角度測量。每組有6個(gè)樣品。

1.4.2 場發(fā)射掃描電鏡檢測 將樣品用酒精梯度脫水后，冷凍干燥，噴金。用掃描電鏡觀察樣品表面形貌。

1.5 黏蛋白黏附及檢測 將樣品置于10 g/L的黏蛋白溶液中37℃ 孵育2 h，取出PBS溶液漂洗3次，置于阿新藍(lán)溶液中染色30 min取出，PBS溶液漂洗3次，置于1 ml水中，震蕩。離心后，用多功能酶標(biāo)儀測試溶液595 nm的吸光度值。

1.6 細(xì)菌生物膜形成以及檢測

1.6.1 細(xì)菌生物膜形成 將變形鏈球菌（ATCC35668）接種于BHI培養(yǎng)基上，厭氧箱中37 ℃ 培養(yǎng)48 h后，分別挑取單個(gè)菌落于培養(yǎng)液中，37℃下厭氧（80%N2、10%CO2、10%H2）培養(yǎng)24 h后。調(diào)整菌液濃度，使其在550 nm的吸光度值為0.26。取200 μl菌液分別接種于培養(yǎng)板中，加補(bǔ)充5%蔗糖的BHI至1 ml。37℃培養(yǎng)2 h后，用PBS液沖洗3次，再將樣品置于BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)2、24、48 h分別取出檢測。

1.6.2 生物膜掃描電鏡檢測 將樣品置于2.5%戊二醛4℃固定，12 h后取出，用PBS（pH 7.2）漂洗，梯度脫水（50%乙醇溶液10 min、70%乙醇溶液10 min、90%乙醇溶液10 min、100%乙醇溶液20 min）。隨后將樣品冷凍干燥，噴金，掃描電鏡觀察。

1.6.3 菌落計(jì)數(shù) 將樣品置于1 ml BHI培養(yǎng)液中，超聲震蕩60 s，將獲得的原液梯度稀釋，接種于BHI平板上，厭氧培養(yǎng)。72 h后，按菌落形成單位（colony-forming units，CFU）計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，并計(jì)算各組Log10的值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 樣品表面檢測結(jié)果 兩組樣品的接觸角，實(shí)驗(yàn)組與對照組分別為（153.386±3.054）°和（10.869± 2.261）°。實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=123.438，P＜0.05），見圖1。在同一放大倍數(shù)的場發(fā)射掃描電鏡下，觀察兩組樣本表面形貌，可見實(shí)驗(yàn)組表面粗糙顆粒度較小，而對照組可見酸蝕后釉柱魚鱗狀地排列，表面起伏較大，見圖2。

2.2 黏蛋白的吸收 實(shí)驗(yàn)組和對照組樣本的黏蛋白吸附量的吸光度值分別為0.049±0.003、0.187± 0.027。實(shí)驗(yàn)組吸光度值明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-17.693，P＜0.05）。

圖1 樣品表面水滴接觸角

圖2 樣本表面形貌掃描電鏡圖 ×10 000

2.3 生物膜形態(tài) 由掃描電鏡結(jié)果圖可見實(shí)驗(yàn)組2 h的樣品表面幾乎看不見菌落，見圖3 A1。而對照組2 h的樣品表面可見成團(tuán)塊狀聚集的細(xì)菌，菌落之間的間隙可見釉質(zhì)表面，見圖3 B1。24 h后，實(shí)驗(yàn)組樣品表面仍未見明顯菌落，見圖3 A2。而對照組樣品表面被細(xì)菌生物膜密集覆蓋，見圖3 B2。48 h，實(shí)驗(yàn)組樣品表面可見多層細(xì)菌生物膜，但視野中部分區(qū)域仍可見釉質(zhì)表面，見圖3 A3。而對照組樣品表面被多層厚的細(xì)菌生物膜完全覆蓋，釉質(zhì)表面完全不可見，見圖3 B3。

圖3 樣品表面菌落形態(tài)掃描電鏡圖 ×1 000

2.4 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品的菌落計(jì)數(shù)值（Log CFU/ml）如圖4所示。在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組和對照組同一時(shí)間樣品菌落計(jì)數(shù)結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-31.705、-62.349、-16.40，P＜0.05）。

圖4 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

3 討論

牙菌斑生物膜是齲病和牙周病發(fā)生的主要因素之一。在牙菌斑生物膜的形成第一階段是唾液蛋白在定植表面先形成獲得性膜，其可作為中間界面介導(dǎo)隨后細(xì)菌的黏附和定植?？谇绘溓蚓窃缙诙ㄖ驳南蠕h菌，其對于后續(xù)其它口腔細(xì)菌的定植具有重要的作用。變形鏈球菌被認(rèn)為是口腔鏈球菌中最具有致齲性的，而與其致齲性相關(guān)的主要因素包括黏附、產(chǎn)酸性和耐酸性［8-9］。這些細(xì)菌能利用蔗糖合成葡聚糖，而葡聚糖可以介導(dǎo)變形鏈球菌和其它口腔細(xì)菌菌群對牙齒表面的黏附，促進(jìn)牙齒生物膜的形成。在口腔生物膜中的致齲菌，可更多地利用碳水化合物進(jìn)而增加pH降低的幅度以及釉質(zhì)脫礦的概率，最終導(dǎo)致齲齒的形成。

然而目前還沒有哪一種方法或材料能明確有效地預(yù)防齲病，常用來抑制口腔細(xì)菌生物膜方法都有其局限性。因此，尋求新的防齲措施非常必要。在其它的領(lǐng)域中，抑制細(xì)菌生物膜的一個(gè)比較熱門和常用的方法就是構(gòu)建“生物清污”界面。大自然中許多界面都具有自清潔功能，例如蝴蝶翅膀、蒼蠅眼睛、荷葉及其它許多植物的枝葉。其中研究最多的是荷葉，其疏水性（θ＞150°）是由于表面的雙層微觀結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)由微凸結(jié)構(gòu)（乳突表皮細(xì)胞）浸沒在大量密集的表面蠟質(zhì)中而構(gòu)成。正如其它拒水的植物一樣，污染顆粒落在荷葉上被水滴帶走。為了能夠?qū)崿F(xiàn)這種超疏水的自清潔過程，污染微粒在葉子的表面的黏附力要比水滴小，這種自潔現(xiàn)象被稱為荷葉效應(yīng)［10］。在過去二十年里，圍繞這種超疏水自潔表面有大量的研究，人們在這一領(lǐng)域的研究中也取得了很大的進(jìn)展，而且己經(jīng)利用多種方法制備出了多種性能優(yōu)異的超疏水性表面。采用物理、化學(xué)等方法來產(chǎn)生表面微細(xì)結(jié)構(gòu)制備超疏水自潔表面的方法一般包含兩個(gè)部分：一是在疏水材料基底上構(gòu)建微細(xì)結(jié)構(gòu)化表面結(jié)構(gòu)，二是在微細(xì)結(jié)構(gòu)化表面上修飾低表面能的物質(zhì)［11］。

生物材料表面的化學(xué)組成、臨界表面張力、界面能、表面親水或疏水性、表面電荷等對細(xì)菌附著影響較大。如果能夠在牙齒表面修飾上一層超疏水納米膜，將能夠有效阻止細(xì)菌與牙齒界面的接觸，并可阻止酸性物質(zhì)對牙齒硬組織的侵蝕，就能有效防止齲病的發(fā)生。有兩種方式可以在牙齒界面形成較為致密的納米單分子薄膜：一是利用脂肪酸的羥基和牙齒表面的鈣離子通過靜電相互作用結(jié)合在一起；另外一種是利用硅烷化鏈狀有機(jī)分子與牙齒界面存在的水分子發(fā)生水解，并縮合形成較為致密的單分子，從而形成牢固結(jié)合［12］。如果應(yīng)用超疏水型有機(jī)分子，由于單分子膜外部端鏈分子的高度疏水特性，表面靜態(tài)接觸角一般可以大于150度，這樣能夠使牙齒表面自由能大幅降低，阻止細(xì)菌黏附到牙齒表面。有研究［13］顯示可以利用有機(jī)硅烷改性口腔正畸矯治器的表面來減少生物膜形成和促進(jìn)其被機(jī)械清除。本實(shí)驗(yàn)采用十七氟癸基三甲氧基硅烷這種試劑來對牙釉質(zhì)表面改性。這種硅烷化偶聯(lián)劑的一側(cè)端能與酸蝕后多孔的牙齒表面發(fā)生緊密結(jié)合，而另一側(cè)端高度的疏水特性可使牙齒表面的自由能降低。一般而言，低黏附性表面都具有低表面能和疏水性的特點(diǎn)，故而在蛋白或者細(xì)菌等黏附時(shí)具有大的接觸角［14］。同時(shí)，十七氟癸基三甲氧基硅烷中有碳氟化合物的存在，這可以改變有機(jī)硅烷的功能，并且在其應(yīng)用于表面改性時(shí)，可賦予表面低滯留效應(yīng)［15］。因此，這種硅烷化的表面可以抑制細(xì)菌對牙面的附著，影響菌斑的形成，進(jìn)而減少了致病細(xì)菌的黏附數(shù)量，消除致齲的環(huán)境，從而有效預(yù)防齲病形成。在本實(shí)驗(yàn)中，微生物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以表明至少在24 h內(nèi)可以有效減少變形鏈球菌的黏附以及生物膜的形成。關(guān)于涂層性能穩(wěn)定性方面的內(nèi)容，還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，超疏水納米膜在釉質(zhì)表面形成涂層后，影響了致病細(xì)菌的黏附能力，這對于口腔微生態(tài)環(huán)境及防治齲病和牙周病等牙菌斑相關(guān)性疾病的發(fā)展都具有重要意義。

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The superhydrophobic enamel surface inhibition of mucin adsorption and bacterialadhesion

Yin Jiali，Tang Xuyan，Li Quanli，et al
（Stomatologic College of Anhui Medical University；Dept of Prosthetics，Affiliated Stomatological Hospital
of Anhui Medical University，Key Lab of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei230032）

Objective To investigate the effect of superhydrophobic enamel surfacein salivary mucin adhesion and oral biofilm formation.Methods Bovine enamel blocks were prepared as specimens and they were randomly divided into two groups.The experimental group received（heptadecafluoro-1，1，2，2-tetradecyl）trimethoxysilane application，while the control group received deionized water application.The sample surfaces were detected by field emission scanning electron microscope（FE-SEM）.Contact angles and salivary mucin absorption were measured.The morphological characteristics were observed by FE-SEM and oral biofilm formation inhibition on enamel disks was assessed by counting colony-forming units（CFU）.Results The surface topographies of the experimental group and the control group were different according to the FE-SEM.And the contact angles of the experimental group were significantly bigger than the control group（P＜0.05）.The mucin absorbed by the experimental group was significantly less than the control group（P＜0.05）.Very few bacteria were found in the experimental group after 4 hours and 24 hours.While bacteria were widely distributed in the control group.After 48 hours bacteria growth，the surfaces were completely covered by biofilms in all samples.And the results of Log（CFU）were consistent with that. Conclusion Superhydrophobic surfaces can inhibit salivary mucin adhesion and oral biofilm formation.

plaque biofilm；superhydrophobic；enamel surface；salivary mucin；Streptococcus mutans

R 780.1

A

1000-1492（2016）09-1273-04

時(shí)間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.018.html

2016-05-04接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81571018、81400559）

安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院、安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科、安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

殷佳莉，女，碩士研究生；唐旭炎，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：txy8302@hotmail.com；

李全利，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ql-li@126.com