MnSOD-SIRT3在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠肝組織中的表達(dá)和意義

蘇會(huì)萍，張俊強(qiáng)，曹 威，儲(chǔ)海峰，俞 晨，4，李 簡(jiǎn)，楊 睿，宋先兵，陳曉宇

MnSOD-SIRT3在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠肝組織中的表達(dá)和意義

蘇會(huì)萍1，2，張俊強(qiáng)1，曹 威1，儲(chǔ)海峰3，俞 晨1，4，李 簡(jiǎn)3，楊 睿3，宋先兵5，陳曉宇1

目的 探討肝臟錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、去乙?；?（SIRT3）的改變與佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠的關(guān)系。方法 弗氏完全佐劑（FCA）足趾皮下注射誘導(dǎo)SD大鼠AA，造模后12、19、26 d，分批處死大鼠，計(jì)算肝臟指數(shù)，檢測(cè)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）；肝勻漿檢測(cè)丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）的變化；肝組織免疫組化和Western blot法檢測(cè)MnSOD、SIRT3蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 與正常組大鼠比較，AA大鼠造模12 d后，肝臟指數(shù)升高，血清轉(zhuǎn)氨酶升高，肝勻漿中MDA升高，GSH-Px、SOD活性下降（P＜0.05，P＜0.01），肝組織中MnSOD、SIRT3蛋白表達(dá)下降。結(jié)論 AA模型組大鼠存在肝損傷，肝勻漿中氧化應(yīng)激指標(biāo)升高，其機(jī)制與肝臟中MnSOD和SIRT3表達(dá)有一定的關(guān)聯(lián)。

佐劑性關(guān)節(jié)炎；錳超氧化物歧化酶；去乙?；?；大鼠

氧化應(yīng)激性反應(yīng)是導(dǎo)致類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的一個(gè)重要因素，長(zhǎng)期治療、生活方式的改變、關(guān)節(jié)疼痛和功能受限等使RA患者處于應(yīng)激狀態(tài)［1］，機(jī)體出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，氧自由基（oxygen free radical，ROS）的生成增加，而清除ROS的能力下降［2］。佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠模型由于和RA在形態(tài)學(xué)上相似，且造模簡(jiǎn)單，是目前較為常用的RA動(dòng)物模型，常用于RA藥物篩選模型［3］。真核細(xì)胞線粒體中含有錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，Mn-SOD），屬于金屬抗氧化酶，能夠特異性地將超氧陰離子自由基（O-·）2轉(zhuǎn)化為H2O2和O2。MnSOD主要存在于線粒體，而線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化代謝和產(chǎn)生能量、自由基的重要場(chǎng)所，故其在抗氧化損傷中作用顯著［4］。去乙?；福╯irtuins，SIRTs）家族中的SIRT3主要位于線粒體，是具有去乙?；富钚缘腟IRTs，具有調(diào)節(jié)線粒體的能量代謝和抗氧化應(yīng)激的作用［5］。肝臟是機(jī)體重要的物質(zhì)代謝場(chǎng)所，肝細(xì)胞中線粒體含量豐富。近年來(lái)，有文獻(xiàn)［6］報(bào)道AA大鼠存在氧化應(yīng)激性肝損傷，為進(jìn)一步了解其肝損傷原因，該研究探討AA大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激情況以及與肝功能損傷、肝臟中MnSOD和SIRT3表達(dá)的聯(lián)系，旨在進(jìn)一步闡明AA大鼠的氧化應(yīng)激機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

1.1.1 動(dòng)物 40只雄性SD大鼠，清潔級(jí)，（180± 20）g，購(gòu)置并飼養(yǎng)于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，每天光照周期12 h∶12 h，自由飲食水。

1.1.2 試劑 弗氏完全佐劑（FCA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；羊抗鼠MnSOD、SIRT3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗羊生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測(cè)試劑盒（SP-9000）、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京諾博萊德科技有限公司，HE染色試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）（貨號(hào)：C010-3）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT）（貨號(hào)：C009-2）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（貨號(hào)：A001）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）（貨號(hào)：A005）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（貨號(hào)：A003）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Amersham Life Sciences公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 大鼠足跖容積測(cè)量?jī)xYLS-TA（山東醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所）；電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；IX51倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)）；玻璃勻漿器、AM-1 ACE破碎乳化機(jī)（日本Nissel精機(jī)制作所）；熒光顯微鏡、RM2235切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；7020全自動(dòng)生化分析儀（日立中國(guó)公司Hitachi Europe Ltd.）等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和標(biāo)本收集 隨機(jī)將大鼠分為兩組：正常組（10只）、模型組（30只）。模型組于每鼠右后足趾皮內(nèi)注射0.1 ml FCA致炎，建立AA大鼠模型。將AA模型組隨機(jī)均分為3組，分別于致炎后12、19、26 d腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉溶液麻醉SD大鼠，剖開(kāi)腹腔，暴露腹主動(dòng)脈，抽取約5 ml動(dòng)脈血置于EP管中，8 000～10 000 r/min離心10 min分離血清，儲(chǔ)存于-20℃冰箱待測(cè)AST、ALT活力。破腹后取出肝臟，稱(chēng)取肝臟濕重，計(jì)算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)（%）=肝臟濕重/大鼠體重× 100%。留取相同部位肝臟，迅速轉(zhuǎn)移至液氮中做Western blot法檢測(cè)；另取相同部位肝臟置10%福爾馬林溶液中固定。

1.2.2 血清AST、ALT檢測(cè) 按照底物法測(cè)定AST、ALT試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)前應(yīng)用新鮮配置的質(zhì)控液對(duì)生化分析儀進(jìn)行開(kāi)機(jī)校準(zhǔn)，保證測(cè)試結(jié)果在質(zhì)控范圍內(nèi)，進(jìn)行血清樣本AST、ALT活力的檢測(cè)。質(zhì)控品標(biāo)號(hào)：YZB/皖0213-2012。AST、ALT活力的單位為IU/L。

1.2.3 肝勻漿分光光度計(jì)檢測(cè)抗氧化指標(biāo) 取相同新鮮部位的肝組織，以預(yù)冷的生理鹽水為勻漿介質(zhì)，肝組織 ∶生理鹽水按1∶9的比例進(jìn)行勻漿，勻漿液3 500～4 000 r/min離心10 min，留取上清液，即10%的肝組織勻漿液，置于-20℃冰箱中保存待測(cè)。嚴(yán)格按照操作程序說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法檢測(cè)MDA含量；羥胺法檢測(cè)SOD活性和比色法測(cè)定GSH-Px活性。

1.2.4 免疫組化法檢測(cè)肝臟MnSOD、SIRT3蛋白表達(dá) 制備SD大鼠肝臟組織切片，石蠟包埋，5 μm厚切片，脫蠟至水，微波中火抗原修復(fù)（0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液），3%H2O2、37℃孵育10 min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，正常山羊血清封閉液，滴加羊抗鼠MnSOD、SIRT3多克隆抗體（一抗），4℃孵育過(guò)夜，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG/HRF二抗，37℃溫箱中孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡觀察 MnSOD、SIRT3蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)肝組織中MnSOD、SIRT3蛋白表達(dá) 液氮中凍存的肝臟組織取樣，并將組織樣品于研缽中研磨成勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配置組織細(xì)胞裂解液，將肝組織裂解研磨成勻漿，提取組織蛋白。根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定總蛋白含量，-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。各組取30 μg等量的組織蛋白，煮沸變性，SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，10%脫脂奶粉封閉，加入羊抗鼠Mn-SOD、SIRT3多克隆抗體一抗（1∶1 000），4℃過(guò)夜。次日用Tris緩沖液（TBST）洗膜后，加入兔抗羊辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000），37℃孵育1 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，以β-actin為內(nèi)參照，灰度分析軟件Image J作半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析，經(jīng)過(guò)方差齊性檢驗(yàn)后采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝指數(shù)變化 與正常組比較，模型組大鼠活動(dòng)減少、體重減輕，肝臟指數(shù)明顯增加（F= 2.707，P＜0.05），且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組大鼠炎癥的加重，表現(xiàn)為原發(fā)側(cè)足趾腫脹進(jìn)行性加重，且出現(xiàn)漸進(jìn)性的繼發(fā)性足腫脹和前足腫脹，逐漸行動(dòng)不便、站立不穩(wěn)，肝臟指數(shù)逐漸增加，但12、19、26 d模型各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.097，P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 AA大鼠的肝臟指數(shù)（，n=10）

2.2 大鼠血清AST、ALT的變化 與正常組比較，各模型組大鼠血清AST、ALT含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.261，P＜0.01）；但12、19、26 d模型各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.326，P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 AA大鼠的血清AST、ALT的變化（，n=10）

2.3 各組大鼠肝勻漿MDA含量和SOD、GSH-Px活性的影響 與正常組比較，AA模型組大鼠肝勻漿中MDA含量明顯升高（P＜0.01），SOD活性和GSH-Px酶活力單位顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)表2。模型組12、19、26 d間MDA含量、SOD活性和GSHPx酶活力單位比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.602，P ＞0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 免疫組化法檢測(cè)大鼠肝臟中MnSOD、SIRT3蛋白表達(dá)情況 正常組大鼠肝臟中MnSOD蛋白表達(dá)明顯，主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞質(zhì)和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞上，各模型組大鼠肝臟中MnSOD蛋白表達(dá)明顯減弱，陽(yáng)性主要位于肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞上，而肝細(xì)胞胞質(zhì)中減弱，見(jiàn)圖3。肝臟中SIRT3蛋白表達(dá)情況類(lèi)似于MnSOD蛋白表達(dá)，正常組大鼠SIRT3蛋白表達(dá)明顯，主要表達(dá)于肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞上，模型組大鼠肝臟中SIRT3蛋白表達(dá)明顯減弱，陽(yáng)性結(jié)果主要表達(dá)于肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞，而肝細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)明顯減弱，見(jiàn)圖4。

表2 大鼠肝勻漿中MDA含量和SOD、GSH-Px活性的影響（，n=10）

表2 大鼠肝勻漿中MDA含量和SOD、GSH-Px活性的影響（，n=10）

與正常組比較：＊＊P＜0.01

組別 MDA（μmol/L） SOD（U/ml） GSH-Px（μmol/L）正常 4.36±0.43 212.62±5.04 183.16±6.27模型（12 d） 11.03±0.96＊＊ 138.24±9.73＊＊ 144.82±9.83＊＊模型（19 d） 11.91±1.24＊＊ 130.08±8.85＊＊ 138.87±9.15＊＊模型（26 d） 12.35±1.27＊＊ 127.61±9.35＊＊ 136.82±9.04＊＊

2.5 Western blot法檢測(cè)大鼠肝臟中MnSOD、SIRT3蛋白表達(dá)情況 與免疫組化檢測(cè)大鼠肝臟中MnSOD、SIRT3蛋白表達(dá)結(jié)果相似，Western blot結(jié)果顯示，正常組大鼠肝臟中MnSOD、SIRT3蛋白高表達(dá)，模型組12 d時(shí)肝臟組織中有MnSOD、SIRT3陽(yáng)性表達(dá)，19 d、26 d表達(dá)呈降低趨勢(shì)；通過(guò)Image J軟件，利用灰度比值半定量分析表明，AA模型組大鼠肝臟組織中MnSOD/GAPDH、SIRT3/GAPDH與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.217，P＜0.01）；各模型組間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

3 討論

圖3 大鼠肝臟中蛋白表達(dá)情況 免疫組化 ×400

圖4 AA大鼠肝臟組織MnSOD、SIRT3蛋白表達(dá)

目前，最常用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的佐劑為FCA，制備中先將抗原水溶液 ∶油劑（石蠟油）按1∶1混合，然后加入乳化劑（羊毛脂等）構(gòu)成油包水抗原乳劑，制備成不完全弗氏佐劑，最后在其中加入滅活分枝桿菌的卡介苗，形成FCA［7］。在本研究中，SD大鼠在注射FCA的3 d表現(xiàn)為急性炎癥表現(xiàn)，原發(fā)注射側(cè)足趾紅腫，關(guān)節(jié)處于注射1周內(nèi)表現(xiàn)明顯的腫脹，1周后繼發(fā)側(cè)表現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹，14 d關(guān)節(jié)腫脹進(jìn)一步發(fā)展，嚴(yán)重者不能負(fù)重，隨著時(shí)間的推移，繼發(fā)性炎癥進(jìn)一步發(fā)展，說(shuō)明AA造模成功。肝臟指數(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，各模型組之間差異并不明顯。正常組肝臟呈棕褐色、質(zhì)柔軟，肝臟指數(shù)正常，而模型組肝臟體積增大、肝被膜緊張、色澤蒼白混濁，肝臟指數(shù)相對(duì)于正常組有顯著的增加，表明肝臟受到一定程度的損傷。AST和ALT是反映肝細(xì)胞膜損傷的敏感性指標(biāo)，肝細(xì)胞膜損傷后，導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶大量進(jìn)入血液中，引起血清中AST和ALT升高。本研究中，正常組大鼠血清AST、ALT含量均在正常范圍內(nèi)，各模型組大鼠血清AST、ALT含量明顯升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但12、19、26 d模型各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，說(shuō)明足趾注射FCA，引起佐劑性肝損傷。

生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的濃度高低可反映出組織細(xì)胞受自由基攻擊后氧化損傷的程度，GSH-Px和SOD是廣泛存在于機(jī)體的抗氧自由基損傷的重要酶類(lèi)，GSH-Px能特異性催化還原型谷胱甘肽（GSH）對(duì)H2O2的還原過(guò)氧化的脂質(zhì)，因此具有保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的作用。本研究表明，12、19、26 d模型各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相對(duì)于正常組，AA模型組大鼠肝臟組織勻漿中GSH-Px 和SOD活性顯著升高，而MDA的濃度下降，說(shuō)明AA模型組大鼠肝臟組織中存在氧化應(yīng)激作用。過(guò)量的氧自由基造成肝細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化，損傷抗氧化酶，引起GSH-Px和SOD的催化作用降低甚至失活。

MnSOD是機(jī)體重要的氧自由基清除劑，是位于線粒體中的酶，有催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的作用。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)和產(chǎn)生能量的重要場(chǎng)所，同時(shí)也是產(chǎn)生自由基的場(chǎng)所，故MnSOD抗氧化損傷的作用顯著［4］。SIRT3是一種去乙?；福懈叨缺Ｊ靥匦?，依賴(lài)于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸發(fā)揮功能，能對(duì)線粒體內(nèi)相關(guān)的乙?；鞍酌撘阴；?，加強(qiáng)ROS清除氧自由基，穩(wěn)定線粒體，抑制線粒體內(nèi)ROS的蓄積［5］。SIRT3在線粒體內(nèi)通過(guò)對(duì)組蛋白/非組蛋白的去乙?；饔?，調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)的能量代謝，提高細(xì)胞內(nèi)的ATP含量，可保護(hù)細(xì)胞，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用［8］。研究［9］表明，SIRT3通過(guò)引起MnSOD 122位賴(lài)氨酸殘基脫乙?；M(jìn)而活化Mn-SOD，減少線粒體生成ROS，參與抗衰老等作用。文獻(xiàn)［10］報(bào)道，SIRT3作為能量感受器及ROS清除的介導(dǎo)者可能在RA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)肝臟組織的免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果表明，正常組大鼠肝臟中MnSOD蛋白表達(dá)明顯，主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞質(zhì)和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞上，各模型組大鼠肝臟中MnSOD蛋白表達(dá)明顯減弱，SIRT3蛋白在肝組織中表達(dá)情況類(lèi)似于MnSOD蛋白表達(dá)，表明肝小葉中存在MnSOD-SIRT3相關(guān)抗氧化作用。本研究進(jìn)一步采用Western blot法檢測(cè)肝勻漿中Mn-SOD、SIRT3蛋白表達(dá)情況，結(jié)果與免疫組化法檢測(cè)結(jié)果相似，正常組大鼠肝臟中MnSOD、SIRT3蛋白高表達(dá)，模型組12 d時(shí)肝臟組織中有少量MnSOD、SIRT3陽(yáng)性表達(dá)，19、26 d表達(dá)呈降低趨勢(shì)；灰度比值半定量分析表明，AA模型組大鼠肝臟組織中Mn-SOD/GAPDH、SIRT3/GAPDH明顯較正常組降低，說(shuō)明肝組織中有MnSOD-SIRT3相關(guān)抗氧化作用。

綜上所述，AA模型組大鼠存在肝損傷、血清轉(zhuǎn)氨酶升高、肝勻漿中氧化應(yīng)激指標(biāo)升高，其機(jī)制與肝臟中MnSOD和SIRT3表達(dá)有一定的聯(lián)系。

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Expression and significance of MnSOD-SIRT3 in adjuvant arthritis of rat liver tissue

Su Huiping1，2，Zhang Junqiang1，Cao Wei1，et al
（1Dept of Histology and Embryology，Anhui Medical University，Hefei 230032；
2Dept of Rehabilitation，Anqing Medical College，Anqing 246052）

Objective To investigate the relationship between the changes of manganese superoxide dismutase（Mn-SOD），sirtuin 3（SIRT3）with adjuvant arthritis（AA）rats.Methods Complete Freund's adjuvant（FCA）of subcutaneous injection of SD rats induced by AA，the AA rats were put to death on the day 12，19 and 26，calculate the liver index，serum aspartate transaminase（AST），alanineaminotransferase（ALT）were detected，methane dicarboxylic aldehyde（MDA），glutathione peroxidase（GSH-Px）and superoxide dismutase（SOD）in liver homogenate were also detected，and MnSOD，SIRT3 protein expression changes were detected in the liver tissue by immunohistochemistry and Western blot.Results Compared with the normal rats，AA rats on the day 12，the liver index，serum transaminase eleations，liver homogenate MDA increased，GSH-Px，SOD activity decreased（P＜0.05，P＜0.01）.The expressions of MnSOD and SIRT3 protein decreased in liver tissue.Conclusion There is liver damage in AA model grouprats，oxidative stress index increases in liver homogenate.The mechanism is related to the expression of MnSOD and SIRT3 in the liver.

adjuvant arthritis；manganese superoxide dismutase；sirtuin 3；rat

R 322.72

A

1000-1492（2016）09-1268-05

時(shí)間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.016.html

2016-05-30接收

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81373421）；安徽高校 自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2015A350）；安徽醫(yī)科大學(xué)“早期接觸科研”訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2015-ZQKY-01）

1安徽醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，合肥 2300322安慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校康復(fù)保健教研室，安慶 2460523安徽醫(yī)科大學(xué)14級(jí)“5+3”臨床醫(yī)學(xué)系，合肥 2300324皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院護(hù)理系，六安 2370005安徽省醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，合肥230601

蘇會(huì)萍，女，碩士研究生； 陳曉宇，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：chenxy@163.com