miR-210誘導(dǎo)犬BMSCs成血管及成骨向分化的體外實(shí)驗(yàn)研究

王默涵，鄒多宏，周 詠，吳軼群，朱艷秋，何家才

miR-210誘導(dǎo)犬BMSCs成血管及成骨向分化的體外實(shí)驗(yàn)研究

王默涵1，鄒多宏1，周 詠1，吳軼群2，朱艷秋1，何家才1

目的 體外檢測miR-210基因誘導(dǎo)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨和成血管方向分化的作用，探討目的基因雙重調(diào)控作用。方法 構(gòu)建慢病毒載體Lenti-miR-210和Lenti-LacZ，并分別用Lenti-LacZ和Lenti-miR-210轉(zhuǎn)染 BMSCs。分別在目的基因轉(zhuǎn)染 BMSCs的第0、1、4、7、14、21天提取mRNA和蛋白，利用RT-PCR和Western blot檢測關(guān)鍵性成血管和成骨因子［血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和核心結(jié)合因子2（Runx2）］的表達(dá)。同時在目的基因轉(zhuǎn)染的第21天通過堿性磷酸酶（ALP）和鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色觀察體外骨形成的情況。結(jié)果 慢病毒載體Lenti-miR-210和Lenti-LacZ能夠成功轉(zhuǎn)入BMSCs中，并在目的基因轉(zhuǎn)染后，miR-210能夠顯著上調(diào)BMSCs關(guān)鍵性成骨和成血管因子VEGF和Runx2的表達(dá)（P＜0.05）；堿性磷酸酶和茜素紅染色顯示，相對于BMSCs組和Lenti-LacZ組，Lenti-miR-210組能夠明顯促進(jìn)BMSCs的成骨向分化。結(jié)論 miR-210可以顯著促進(jìn)BMSCs向成骨和成血管方向分化，這為將來的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

miR-210；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；基因轉(zhuǎn)染；血管生成；骨形成

目前臨床上骨缺損的修復(fù)重建仍然面臨挑戰(zhàn)。除了自體骨移植，再生醫(yī)學(xué)或組織工程骨的研究和臨床應(yīng)用也日益受到關(guān)注。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是再生醫(yī)學(xué)或骨組織工程常用的種子細(xì)胞，其具有自我更新和多向分化的潛能。在骨的發(fā)育及再生中，血管生成與骨形成密不可分，并以耦合的形式存在［1］。組織工程骨的研究中，功能性血管網(wǎng)的建立是骨形成的關(guān)鍵因素［2］。因此，探索具有雙重調(diào)控作用的生長因子已經(jīng)成為骨組織工程研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是由20～22個核苷酸組成的單鏈RNA，在細(xì)胞的基因調(diào)控中具有重要作用［3］，研究［4-5］顯示miRNAs在血管再生和骨修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，動物實(shí)驗(yàn)［5］表明miR-210有促進(jìn)血管生成、抑制細(xì)胞凋亡的作用，而且其可通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）/activin信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化?；诖?，該研究運(yùn)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，探討miR-210誘導(dǎo)BMSCs成骨及成血管方向分化的雙重調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取健康36周齡雄性拉布拉多犬（約15 kg），由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，在整個實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 慢病毒載體的構(gòu)建 慢病毒載體Lenti-LacZ 和Lenti-miR-210的構(gòu)建由和元生物技術(shù)（上海）有限公司構(gòu)建、鑒定和提供，病毒滴度為2.33×109TU/ml。病毒包裝完成后，收集病毒原液，超速離心機(jī)濃縮，并進(jìn)行病毒滴度測定，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=加入病毒總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)，本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)分別采取MOI值為1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22轉(zhuǎn)染細(xì)胞，病毒轉(zhuǎn)染4～7 d后倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá)情況，確定最佳MOI值。

1.1.3 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、TRIzol RNA抽提試劑盒（Gibco公司，美國）；胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技有限公司，浙江）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）；成骨及成血管因子［核心結(jié)合因子2 （Runt-related transcription factor 2，Runx2）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）］抗體（Abcam公司，英國）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測試劑盒、RIPA裂解液、蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，上海）；慢病毒載體 （和元生物有限公司，上海）；茜素紅（Sigma公司，美國）；PVDF膜（Invitrogen公司，美國）；Runx2和VEGF PCR引物［生工生物工程（上海）股份有限公司，上海］。

1.2 方法

1.2.1 犬BMSCs體外培養(yǎng) 用3%戊巴比妥鈉（1 ml/kg）對拉布拉多犬進(jìn)行靜脈注射麻醉，一側(cè)髂骨部位剃毛、消毒、鋪巾。在無菌條件下抽取犬髂骨骨髓約5 ml，完全培養(yǎng)基（含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基）制成單細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)皿中進(jìn)行原代培養(yǎng)，待細(xì)胞融合達(dá)80% ～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取生長狀態(tài)良好的第2代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測BMSCs表面標(biāo)志物 收集第2代對數(shù)生長期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個/ml分別加入CD34-PE、CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-APC單克隆抗體各2 μl，室溫避光孵育1 h，PBS洗2次，加入500 μl PBS重懸細(xì)胞，行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.2.3 犬BMSCs的轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)MOI=10時，轉(zhuǎn)染效率最高，且BMSCs仍然保持增殖狀態(tài)，說明該轉(zhuǎn)染滴度對BMSCs擴(kuò)增狀態(tài)影響很??；實(shí)驗(yàn)分組為BMSCs組、Lenti-LacZ組和Lenti-miR-210組。取對數(shù)生長期的細(xì)胞按照每孔2 ×105個細(xì)胞接種于6孔板中，根據(jù)MOI值計(jì)算所需要的病毒量加入病毒濃縮液及總濃度為8 μg/ml的聚凝胺。12 h后對細(xì)胞進(jìn)行換液，加入完全培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，并在轉(zhuǎn)染后的第3～7天運(yùn)用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，確定病毒轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 ALP和茜素紅鈣結(jié)節(jié)表達(dá)的檢測 將狀態(tài)良好的BMSCs按照每孔2×105個細(xì)胞接種于6孔板中，病毒轉(zhuǎn)染及分組同1.2.3，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，PBS沖洗2次，每次3 min，4%多聚甲醛固定20 min后，PBS沖洗2次，每次3 min，在各自的6孔板中分別加入ALP顯色試劑和2%茜素紅染液染色40 min，雙蒸水沖洗2次，掃描儀下掃描后置于倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況，檢測BMSCs向成骨細(xì)胞的分化。

1.2.5 RT-PCR測定成骨和成血管相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 將狀態(tài)良好的BMSCs按照每孔2×105個細(xì)胞接種于6孔板中，病毒轉(zhuǎn)染同1.2.3，分別于轉(zhuǎn)染后的第0、1、4、7、14、21天采用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為矯正標(biāo)本RNA質(zhì)量及逆轉(zhuǎn)錄效率的差異，將標(biāo)本檢測所得的CT值與相應(yīng)的GAPDH基因CT值相減，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測成血管和成骨相關(guān)蛋白的表達(dá) 將狀態(tài)良好的BMSCs按照每孔2×105個細(xì)胞接種于6孔板中，病毒轉(zhuǎn)染同1.2.3，Western blot檢測成血管和成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。具體方法：①分別于轉(zhuǎn)染后第0、1、4、7、14、21天收集細(xì)胞，RIPA蛋白裂解液提取蛋白；②BCA法測定蛋白濃度后計(jì)算含有20～60 μg蛋白的溶液體積，每個樣本以30 μg上樣進(jìn)行；③取出上樣樣品至200 μl EP管中，加入4×LDS上樣緩沖液使終濃度為1×LDS，然后將樣品置于95℃中水浴10 min，使蛋白變性；④10% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，常規(guī)轉(zhuǎn)膜、一抗孵育、二抗行抗體雜交，ECL發(fā)光、顯影、定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析和方差分析，檢測結(jié)果均以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒轉(zhuǎn)染BMSCs效率的結(jié)果 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，目的基因轉(zhuǎn)染5 d后，基因轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，當(dāng)MOI=10 pfu/細(xì)胞時，轉(zhuǎn)染效率最高，且細(xì)胞形態(tài)為梭形，旋渦狀生長，細(xì)胞仍維持增殖狀態(tài)，表明該轉(zhuǎn)染滴度對細(xì)胞的擴(kuò)增影響很小?；蜣D(zhuǎn)染5 d后，熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上。見圖1。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)對BMSCs表面標(biāo)志物的鑒定結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，BMSCs表面抗原CD44、CD90高度表達(dá)，陽性表達(dá)分別為97.2%和99.7%，造血干細(xì)胞表面抗原CD34和CD45表達(dá)陰性，陽性表達(dá)分別為0.288%和0.074%。見圖2。

2.3 miR-210對成骨細(xì)胞分泌ALP和成骨細(xì)胞礦化功能的影響 轉(zhuǎn)染后21 d，可見培養(yǎng)的BMSCs聚集生長，ALP染色Lenti-miR-210/BMSCs組可見較多的陽性表達(dá)，而BMSCs組和Lenti-LacZ/BMSCs組很少表達(dá)（圖3A）。茜素紅染色顯示，在聚集生長中心可見點(diǎn)狀染色陽性的鈣化結(jié)節(jié)，細(xì)胞周圍鈣鹽被染成橘紅色。BMSCs組和Lenti-LacZ/BMSCs組僅有較少的鈣結(jié)節(jié)形成，而Lenti-miR-210/BMSCs組可見較多細(xì)胞聚集形成結(jié)節(jié)（圖3B）。

圖1 目的基因轉(zhuǎn)染結(jié)果 ×100

圖2 犬BMSCs表面標(biāo)志物陽性表達(dá)情況

圖3 犬BMSCs培養(yǎng)21 d后ALP和茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色觀察

2.4 miR-210介導(dǎo)的BMSCs成血管及成骨相關(guān)因子mRNA的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，BMSCs組VEGF和Runx2 mRNA維持低水平少量表達(dá)，LentimiR-210/BMSCs組自目的基因轉(zhuǎn)染后的第4天開始，VEGF和Runx2 mRNA表達(dá)顯著增高，監(jiān)測至第21天仍維持較高水平，與蛋白表達(dá)趨勢幾乎一致。轉(zhuǎn)染后第4、7、14、21天，BMSCs組VEGF和Runx2 mRNA表達(dá)均低于 Lenti-miR-210/BMSCs組（P＜0.05）。見圖4。

2.5 miR-210介導(dǎo)的BMSCs成血管和成骨等標(biāo)志分子檢測 目的基因轉(zhuǎn)染后的第4天VEGF蛋白過表達(dá)，隨著時間延長，蛋白表達(dá)持續(xù)升高，BMSCs組的VEGF蛋白表達(dá)水平和Lenti-miR-210/BMSCs組相比有明顯差異；Runx2蛋白在目的基因轉(zhuǎn)染后，基因表達(dá)趨勢幾乎與VEGF蛋白表達(dá)一致。見圖5。

3 討論

本研究顯示miR-210有促進(jìn)BMSCs骨向和血管向分化的作用，該因子具有雙重調(diào)控功能。因?yàn)樵诠前l(fā)育和再生過程中，血管生成與骨形成以耦合的形式存在，密不可分，所以在骨組織工程研究中，血管化問題的重要性日益彰顯。當(dāng)組織工程骨的厚度超過100～200 μm時，在體內(nèi)構(gòu)建能為細(xì)胞提供氧、營養(yǎng)及去除代謝廢物的功能性血管會面臨重大挑戰(zhàn)［1］。因此，目前血管再生已被認(rèn)為是骨組織工程繼種子細(xì)胞、支架材料、細(xì)胞因子3大要素之后的第4大要素。

圖4 RT-PCR檢測目的基因轉(zhuǎn)染BMSCs后成血管及成骨相關(guān)因子的表達(dá)

圖5 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

研究［6-7］表明miRNAs參與了細(xì)胞的凋亡、增殖、衰老、自噬及分化等過程，且能夠通過上調(diào)或下調(diào)這些過程來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。miRNAs在血管發(fā)生及形成中起著關(guān)鍵作用。miR-210在細(xì)胞低氧時高表達(dá)，是低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的下游靶基因，HIF-1α驅(qū)動著miR-210的過表達(dá)和細(xì)胞過程（細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、線粒體功能、凋亡和血管生成等）［8］。而且HIF-1α可以誘導(dǎo)VEGF的高表達(dá)，VEGF促進(jìn)新血管形成后，新生血管為骨缺損區(qū)輸送大量與骨形成相關(guān)的生長因子，生長因子成熟后可以演變?yōu)樾鹿牵?-10］。研究［11-12］表明，在組織缺血時，miR-210對調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞血管化有決定性作用；且miR-210過表達(dá)后，其通過抑制TGF-β/activin信號通路傳導(dǎo)促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化［5］。因此，探索miR-210的雙重調(diào)控作用（成骨和成血管）具有可靠的理論基礎(chǔ)，該假說被本研究所證實(shí)。

由于慢病毒載體能高效的整合至靶細(xì)胞中長期穩(wěn)定表達(dá)，且慢病毒載體不會產(chǎn)生特異性細(xì)胞反應(yīng)［13］，而在預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中表明，慢病毒的轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的增殖不會產(chǎn)生顯著影響，因此，本研究利用慢病毒構(gòu)建miR-210過表達(dá)載體，當(dāng)MOI=10 pfu/時，轉(zhuǎn)染效率最高，且細(xì)胞仍維持增殖狀態(tài)，表明該轉(zhuǎn)染滴度對細(xì)胞的擴(kuò)增影響較小。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所用的BMSCs符合成體干細(xì)胞的特性（BMSCs表面標(biāo)志物顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原的CD44和CD90表達(dá)為高度陽性，分別為97.2%和99.7%；造血干細(xì)胞表面抗原的CD34、CD45為高度陰性，分別為0.288%和0.074%）［14-15］。這為體內(nèi)外細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)提供了可靠的種子細(xì)胞來源。

RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，目的基因轉(zhuǎn)染BMSCs后的第4天，Lenti-miR-210/BMSCs組的Runx2和VEGF標(biāo)志性成骨和成血管因子出現(xiàn)過表達(dá)，持續(xù)到第21天。相比BMSCs組及Lenti-LacZ組，目的基因組的成骨和成血管因子的過表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明外源性miR-210有促進(jìn)BMSCs血管及骨向分化的雙重調(diào)控作用。ALP是骨形成的功能性酶，是成骨細(xì)胞分化早期標(biāo)志，并在成骨細(xì)胞的鈣鹽沉積中起關(guān)鍵作用［16］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，在目的基因轉(zhuǎn)染BMSCs的第21天，利用ALP和茜素紅染色。結(jié)果顯示，Lenti-miR-210/BMSCs在培養(yǎng)第21天時，ALP和茜素紅染色及鈣結(jié)節(jié)表達(dá)明顯高于其它兩組（BMSCs組和Lenti-LacZ/BMSCs組）。表明Lenti-miR-210能夠促進(jìn)BMSCs合成和分泌較多的成骨特異性蛋白及基質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)我們的假說。

［1］ Riddle R C，Khatri R，Schipani E，et al.Role of hypoxia-inducible factor-1α in angiogenic-osteogenic coupling［J］.J Mol Med，2009，87（6）：583-90.

［2］ Zou D，Zhang Z，He J，et al.Blood vessel formation in the tissueengineered bone with the constitutively active form of HIF-1α mediated BMSCs［J］.Biomaterials，2012，33（7）：2097-108.

［3］ van Rooij E，Olson E N.MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease：opportunities and obstacles［J］.Nat Rev Drug Discov，2012，11（11）：860-72.

［4］ Patella F，Rainaldi G.MicroRNAs mediate metabolic stresses and angiogenesis［J］.Cell Mol Life Sci，2012，69（7）：1049-65.

［5］ Mizuno Y，Tokuzawa Y，Ninomiya Y，et al.miR-210 promotes osteoblastic differentiation through inhibition of AcvR1b［J］.FEBS Lett，2009，583（13）：2263-8.

［6］ Liu K，Huang J，Xie M，et al.MIR34A regulates autophagy and apoptosis by targeting HMGB1 in the retinoblastoma cell［J］.Autophagy，2014，10（3）：442-52.

［7］ Zhang F，Cui J，Liu X，et al.Roles of microRNA-34a targeting SIRT1 in mesenchymal stem cells［J］.Stem Cell Res Ther，2015，6（1）：1-13.

［8］ Dang K，Myers K A.The Role of hypoxia-induced miR-210 in cancer progression［J］.Int J Mol Sci，2015，16（3）：6353-72.

［9］ Voellenkle C，van Rooij J，Guffanti A，et al.Deep-sequencing of endothelial cells exposed to hypoxia reveals the complexity of known and novel microRNAs［J］.Rna，2012，18（3）：472-84.

［10］Zou D，He J，Zhang K，et al.The bone-forming effects of HIF-1alpha-transduced BMSCs promote osseointegration with dental implant in canine mandible［J］.PLoS One，2012，7（3）：e32355.

［11］Lou Y L，Guo F，Liu F，et al.miR-210 activates notch signaling pathway in angiogenesis induced by cerebral ischemia［J］.Mol Cell Biochem，2012，370（1-2）：45-51.

［12］Alaiti M A，Ishikawa M，Masuda H，et al.Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in exvivo expanded CD34+cells enhances cell-mediated angiogenesis［J］.J Cell Mol Med，2012，16（10）：2413-21.

［13］D'Costa J，Mansfield S G，Humeau L M.Lentiviral vectors in clinical trials：Current status［J］.Curr Opin Mol Ther，2009，11 （5）：554-64.

［14］M?dder U I，Roforth M M，Nicks K M，et al.Characterization of mesenchymal progenitor cells isolated from human bone marrow by negative selection［J］.Bone，2012，50（3）：804-10.

［15］Martins A A，Paiva A，Morgado J M，et al.Quantification and immunophenotypic characterization of bone marrow and umbilical cord blood mesenchymal stem cells by multicolor flow cytometry ［C］.Transplant Proc，2009，41（3）：943-6.

［16］寧寅寬，李 強(qiáng)，蔡偉良，等.綠色熒光蛋白標(biāo)記兔BMSCs體外成骨的定量能譜分析［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，50 （4）：415-8.

miR-210 gene in promoting the formation of bone and blood vessel by canine BMSCs in vitro

Wang Mohan，Zou Duohong，Zhou Yong，et al
（Stomatologic College of Anhui Medical University，The Affiliated Stomatological Hospital
of Anhui Medical University，Key Lab of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To explore the function of miR-210 gene in promoting the differentiation of BMSCs into bone and blood vessels in vitro.Methods The lentiviral vector carrying miR-210 or green fluorescent protein（GFP）gene （Lenti-miR-210 or Lenti-LacZ）was constructed and then transduced into the canine BMSCs.After transduced with targeted gene，expressions of relative osteogenic and angiogenic factors were detected by RT-PCR and Western blot on day 0，1，4，7，14 and 21.Alkaline phosphatase（ALP）and calcium nodules were detected by ALP staining and alizarin red staining（ARS）on day 21 of transduction.Results The BMSCs were successfully tranduced with miR-210 and GFP recombinant lentiviral vectors.After the targeted gene was transduced，expressions of VEGF and Runx2 at the mRNA and protein levels were significantly increased（P＜0.05）.Results of ALP and ARS staining showed that the targeted gene could induce the osteogenic differentiation of BMSCs more than Lenti-LacZ and BMSCs.Conclusion The miR-210 gene could promote the overexpressions of osteogenic and angiogenic factors，which could lay a foundation for the relative study in vivo in the future.

miR-210；bone marrow mesenchymal stem cells；gene transduction；osteogenesis differentiation；angiogenesis differentiation

Q 7；R 34

A

1000-1492（2016）09-1258-05

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.012.html

2016-04-14接收

國家自然科學(xué)基金（編號：31370983、81371114、81371190）；安 徽 省 自 然 科 學(xué) 基 金 （編 號：1408085MKL29）；安徽省杰出青年科學(xué)基金（編號：1508085J08）；高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（編號：gxyqZD2016058）；安徽醫(yī)科大學(xué)“青年拔尖人才支持計(jì)劃”

1安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室，合肥 2300322上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔種植科，上海 200011

王默涵，男，碩士研究生；何家才，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hejiacai@163.com