犬牙槽骨干細(xì)胞與髂骨骨髓干細(xì)胞體外成骨能力的比較

鄭文龍，吳 濤，鄒多宏，陳喬爾

犬牙槽骨干細(xì)胞與髂骨骨髓干細(xì)胞體外成骨能力的比較

鄭文龍1，2，3，吳 濤1，2，3，鄒多宏1，2，3，陳喬爾1，2，3

目的 比較犬牙槽骨來(lái)源干細(xì)胞（ABSC）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）的體外成骨能力，為骨組織工程的種子細(xì)胞選擇提供新思路。方法 取同一只犬的牙槽骨骨組織和髂骨骨髓作為ABSC和BMSC的來(lái)源。取第3代細(xì)胞進(jìn)行一系列體外檢測(cè)：MTT法檢測(cè)兩種細(xì)胞的增殖能力；成骨誘導(dǎo)和常規(guī)培養(yǎng)條件下，不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行茜素紅和堿性磷酸酶染色，觀察鈣鹽沉積和堿性磷酸酶合成能力，同時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活力進(jìn)行半定量檢測(cè)；成骨誘導(dǎo)后7、14、21 d利用RT-PCR法檢測(cè)關(guān)鍵性成骨因子［Ⅰ型膠原（COL-1）、堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）］的表達(dá)情況。結(jié)果 相較BMSC，ABSC增殖能力略高，鈣結(jié)節(jié)和堿性磷酸酶的表達(dá)能力更強(qiáng)。COL-1早期在ABSC中的表達(dá)高于BMSC，并隨著時(shí)間呈下降趨勢(shì)。ALP在ABSC中的表達(dá)始終高于BMSC，且在14 d達(dá)到最高峰。OCN總體呈上升趨勢(shì)，14 d和21 d有明顯表達(dá)，且ABSC高于BMSC。結(jié)論 犬ABSC的成骨能力與BMSC差別不大，提示犬ABSC可以成為骨組織工程優(yōu)先選擇的種子細(xì)胞之一。

骨髓干細(xì)胞；牙槽骨干細(xì)胞；成骨分化

研究［1］表明，頜骨組織修復(fù)頜面部的骨缺損比使用中軸骨或四肢骨擁有更加穩(wěn)定的成骨效果，遠(yuǎn)期的骨吸收更少。胚胎學(xué)證實(shí)，頜骨起源于神經(jīng)嵴，又稱為外胚間葉組織，而軀干四肢骨起源于中胚層［2］。研究［3］顯示，牙槽骨來(lái)源干細(xì)胞（alveolar bone-derived stem cells，ABSC）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stromal cells，BMSC）在胚胎和骨骼系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)上存在較大差異。近年來(lái)，Clausen et al［4］使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人的ABSC，證明其高表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志 CD13、CD44、CD90、CD73，低表達(dá)CD31，并利用RT-PCR檢測(cè)證明了成骨誘導(dǎo)后其成骨相關(guān)基因的高表達(dá)。Payer et al［5］證明ABSC在體外培養(yǎng)下具有成骨和成脂的潛能。研究［6］證明，頜骨BMSC比髂骨BMSC具有更高的神經(jīng)向分化能力。以上結(jié)果說(shuō)明，牙槽骨中具有多項(xiàng)分化潛能的干細(xì)胞，在組織工程中有巨大的潛力。該研究旨在比較ABSC和BMSC的體外成骨能力，為其將來(lái)更好地應(yīng)用于組織工程提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 拉布拉多犬，1.5歲，18～20 kg，雄性，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、茜素紅（美國(guó)Sigma公司）；胎牛血清、BCI/PNBT堿性磷酸酯顯色試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR反應(yīng)試劑盒（大連TaKaRa公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱（美國(guó)Thermo公司）；I型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；熒光倒置相差顯微鏡和照相系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Stratagene公司）；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司）；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀（北京京百卓顯公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；生物安全柜（中國(guó)ESCO公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) ABSC的培養(yǎng)：使用3%的戊巴比妥鈉對(duì)拉布拉多犬進(jìn)行靜脈麻醉，然后固定于操作臺(tái)，備皮、消毒，拔去犬的上頜前磨牙，從牙槽骨壁及其周圍獲得牙槽骨并送實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。PBS沖洗3遍，去除血凝塊，使用無(wú)菌器械將牙槽骨剪碎成大小約2 mm×2 mm×2 mm，加入含10%FBS的DMEM，于37℃、5%CO2的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。接種5～7 d后進(jìn)行觀察，換液。此后每隔3 d細(xì)胞全換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。BMSC的培養(yǎng)：對(duì)犬的髂骨進(jìn)行穿刺獲得5～8 ml骨髓，置入含肝素鈉的離心管，送實(shí)驗(yàn)室采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞。5 d后小心吸取培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞進(jìn)行首次換液。當(dāng)ABSC和BMSC細(xì)胞生長(zhǎng)融合約80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取第3代兩種細(xì)胞，分別以1×104/ml接種于96孔板，每孔200 μl完全培養(yǎng)基，每組5個(gè)復(fù)孔；使用MTT法，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)兩者的吸光度（optical density，OD值），連續(xù)測(cè)9 d，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 成骨誘導(dǎo)分化后鈣結(jié)節(jié)和ALP的染色 取第3代兩種細(xì)胞，分別以5×104/ml的密度接種于24孔板培養(yǎng)，每孔0.5 ml，每組6個(gè)復(fù)孔。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)90%匯合后，加入成骨誘導(dǎo)液（含10% FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10-7mol/L地塞米松、50 mg/L維生素C）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)約7、14、21 d行茜素紅和ALP染色，掃描并于倒置顯微鏡下觀察。ABSC和BMSC的鈣結(jié)節(jié)面積比較，則將染色后培養(yǎng)皿放在網(wǎng)格板上，平均分9個(gè)視野，取上、下、左、右和中間5個(gè)視野，拍照后，使用Image Pro Plus軟件計(jì)算鈣結(jié)節(jié)所占面積。

1.2.4 ALP相對(duì)活力的檢測(cè) 取第3代兩種細(xì)胞，分別以5×104/ml的密度接種于10 cm板，每板10 ml。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)90%匯合后，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。另設(shè)置對(duì)照組，不加入成骨誘導(dǎo)液，只加普通的培養(yǎng)基。每3 d換液1次。第7、14、21天提取蛋白，使用對(duì)硝基苯磷酸二鈉法（pNPP法）對(duì)ALP的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析成骨相關(guān)基因的表達(dá) 取第3代兩種細(xì)胞，分別以5×104/ml的密度接種于6孔板，每孔2 ml。成骨誘導(dǎo)7、14、21 d后，使用TRIzol試劑分別提取其總的RNA，對(duì)收集的RNA進(jìn)行純度與量的測(cè)定，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系為20 μl。擴(kuò)增基因?yàn)镮型膠原（collagen I，COL-1）、ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）及內(nèi)參基因β-actin。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物由上海生工生物工程公司進(jìn)行設(shè)計(jì)（表1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以表示。

2 結(jié)果

2.1 犬ABSC和BMSC的形態(tài)學(xué)觀察 ABSC從骨組織邊緣遷移出來(lái)，其大小形態(tài)等與BMSC相似，如單細(xì)胞核、成纖維樣（圖1）。原代細(xì)胞傳代時(shí)使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，兩者的活力可達(dá)95%以上。在第3代至第7代細(xì)胞活力沒(méi)有明顯下降趨勢(shì)。

表1 犬引物基因序列表

2.2 犬ABSC和BMSC生長(zhǎng)曲線的比較 MTT結(jié)果顯示ABSC在擴(kuò)增的第1～3天，兩組細(xì)胞增殖情況基本一致，第4天后ABSC增殖速度略高于BMSC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），9 d后，ABSC基本趨于穩(wěn)定（圖2）。

圖1 倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)BMSC和ABSC ×40

2.3 成骨誘導(dǎo)后鈣結(jié)節(jié)和ALP的染色 茜素紅染色：成骨誘導(dǎo)14 d時(shí)，茜素紅染色可見(jiàn)ABSC中有局部散在的鈣化結(jié)節(jié)且多余BMSC。21 d時(shí)，ABSC的礦化結(jié)節(jié)面積較大且稠密，明顯多于BMSC。Image-Pro Plus 6.0軟件分析表明，ABSC其鈣結(jié)節(jié)面積百分比高于 BMSC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［14 d：（31.5±1.7）%vs（25.7±0.6）%，t=5.432，P＜0.05；21 d：（59.5±1.4）%vs（35.6±0.5）%，t=27.304，P＜0.05］，見(jiàn)圖3。ALP染色：成骨誘導(dǎo)7 d時(shí)，可見(jiàn)ABSC的皿底散在分布著藍(lán)紫色的顆粒沉淀，而BMSC僅有皿底中央?yún)^(qū)域散在分布的著色點(diǎn)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，ALP越來(lái)越多。21 d時(shí)，可見(jiàn)ABSC的ALP表達(dá)明顯高于BMSC（圖4）。

圖2 第3代ABSC和BMSC生長(zhǎng)曲線比較

圖3 ABSC和BMSC誘導(dǎo)14 d和21 d后茜素紅染色掃描和鏡下（×40）以及兩者鈣結(jié)節(jié)面積所占百分比

圖4 ABSC和BMSC誘導(dǎo)7 d和21 d后ALP染色掃描和鏡下 ×40

2.3 ALP活力相對(duì)定量檢測(cè) 非誘導(dǎo)組中，ABSC 中ALP在14 d之后較為穩(wěn)定，BMSC則一直較為穩(wěn)定。成骨誘導(dǎo)后，ABSC中ALP增加趨勢(shì)明顯，BMSC中ALP在21 d才有明顯增加，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)ABSC 中ALP的活性均高于BMSC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（7 d：t=0.868，14 d：t=6.439，21 d：t=1.940，P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 ABSC和BMSC成骨誘導(dǎo)與常規(guī)培養(yǎng)ALP活力相對(duì)定量

2.4 成骨誘導(dǎo)后成骨相關(guān)基因的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，ABSC和BMSC的成骨相關(guān)基因COL-1、ALP、OCN都有差異表達(dá)。7、14 d，COL-1在 ABSC中的表達(dá)高于 BMSC（7 d：t= 37.283，14 d：t=14.900），且COL-1在兩種細(xì)胞中的表達(dá)隨著時(shí)間呈下降趨勢(shì)。ALP在兩組細(xì)胞的表達(dá)在14 d達(dá)到最高峰，且ABSC的ALP的表達(dá)始終高于BMSC（7 d：t=12.674，14 d：t=7.007，21 d：t =6.099）。OCN隨著誘導(dǎo)時(shí)間在兩種細(xì)胞中均呈上升趨勢(shì)，14 d和21 d的OCN在ABSC的表達(dá)高于BMSC（14 d：t=36.908，21 d：t=23.938），以上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

3 討論

有關(guān)頜骨內(nèi)干細(xì)胞的研究之前多是從頜骨中進(jìn)行骨髓的抽取并進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，而對(duì)于從頜骨骨松質(zhì)中遷移出來(lái)的干細(xì)胞研究相對(duì)較少。研究［7］表明，從頜骨骨髓、骨松質(zhì)或者兩者混合物中生長(zhǎng)出來(lái)的干細(xì)胞，三者在早期的細(xì)胞增殖速度上有所區(qū)別，但是在干細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)上沒(méi)有明顯的區(qū)別。在30代內(nèi)，三者沒(méi)有致癌基因的異常表達(dá)，35代后才有核型異常的發(fā)生。Akintoye et al［8］報(bào)道，人類的頜骨中含有更少的造血干細(xì)胞，并顯示較高的增殖能力和骨向分化能力。但是，在裸鼠皮下試驗(yàn)中，BMSC的成骨能力卻又高于ABSC。研究［9］表明，不管是體外還是體內(nèi)試驗(yàn)，大鼠的ABSC成骨能力均高于脛骨來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。Matsubara et al［10］報(bào)道人和犬的ABSC和BMSC具有相似的成骨能力，但是成軟骨和成脂肪能力卻有不同。Pekovits et al［11］報(bào)道，人類下頜骨骨松質(zhì)與髂骨骨髓來(lái)源的干細(xì)胞的增殖能力沒(méi)有明顯差別。盡管這些研究結(jié)果之間存在著爭(zhēng)議，但是多數(shù)研究［9-11］表明ABSC 和BMSC確實(shí)存在位點(diǎn)差異。出現(xiàn)這些爭(zhēng)議有可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象（物種、年齡）、研究方法的不同導(dǎo)致。解剖位點(diǎn)的差異主要受以下因素影響：①血供區(qū)域的不同；②骨皮質(zhì)和骨松質(zhì)數(shù)量與結(jié)構(gòu)的不同；③ 空間物理結(jié)構(gòu)的不同；④ 基因表達(dá)的不同［12］。從胚胎發(fā)育來(lái)看，頜骨起源于外胚層的神經(jīng)嵴，并經(jīng)歷骨膜內(nèi)成骨過(guò)程。軀干四肢骨起源于中胚層的間葉細(xì)胞，并經(jīng)歷軟骨成骨［2］。胚胎發(fā)生的不同對(duì)兩者在骨骼系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)上會(huì)產(chǎn)生一定的影響，并影響著疾病的發(fā)生。如巨頜癥、甲狀旁腺亢進(jìn)-頜骨腫瘤綜合征等僅發(fā)生在頜骨。除此之外，頜面部的骨纖維異常增殖癥在組織學(xué)和影像學(xué)上與中軸骨和四肢骨也有明顯的不同。近期，有很多關(guān)于下頜骨長(zhǎng)期使用抗吸收劑（二碳磷酸鹽）導(dǎo)致骨壞死發(fā)生的病例。然而將二碳磷酸鹽應(yīng)用于中軸骨，僅僅導(dǎo)致輕微骨折而不是骨壞死［3］。

圖6 ABSC和BMSC在成骨誘導(dǎo)后，骨相關(guān)基因的表達(dá)

本次研究所選擇的干細(xì)胞已經(jīng)被證實(shí)具有多向分化潛能，并具有較強(qiáng)的成骨特性［13］。為使干細(xì)胞更快的從骨松質(zhì)中遷移出來(lái)，研究者使用膠原酶對(duì)骨組織進(jìn)行了處理，這不可避免的對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生一定的影響［8］。為了排除干擾，此次實(shí)驗(yàn)并未使用膠原酶。由于細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，為保證在觀察期內(nèi)細(xì)胞不受接觸抑制繼續(xù)生長(zhǎng)，MTT實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞濃度控制在1×104/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，ABSC的增殖能力高于BMSC，這與之前的研究［8］結(jié)果相一致。研究［3］顯示，ABSC的同源異型盒基因家族的MSX基因相對(duì)BMSC高表達(dá)，而MSX作為核轉(zhuǎn)錄因子對(duì)細(xì)胞的增殖能力具有較強(qiáng)的控制能力。

ALP雖然是成骨分化的早期標(biāo)志物，但是在骨細(xì)胞的形成期表達(dá)依然存在。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ALP半定量和ALP染色檢測(cè)成骨誘導(dǎo)7、14、21 d的變化情況。鈣結(jié)節(jié)是成骨分化的晚期標(biāo)志物，因此選擇檢測(cè)的時(shí)間為14、21 d。為使細(xì)胞更快地增殖和匯集，進(jìn)行骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)中選擇細(xì)胞濃度為5× 104/ml。鏡下顯示ALP和鈣結(jié)節(jié)特別容易在皿底中央聚集，這可能是由于高密度狀態(tài)更容易表現(xiàn)出骨向分化趨勢(shì)。ALP是細(xì)胞成骨向分化的早期分泌產(chǎn)物，在ABSC中早期就有表達(dá)，說(shuō)明ABSC的成骨分化趨勢(shì)更加明顯。鏡下顯示，不同細(xì)胞間著色程度不同，這可能是因?yàn)榧词故峭慌鷤鞔募?xì)胞，每個(gè)細(xì)胞個(gè)體的分化潛能也存在著差異。此次研究培養(yǎng)的是混合型細(xì)胞群，并不是所有細(xì)胞均具有三系分化的潛能，能分化的干細(xì)胞只是其中一部分［11］。ALP半定量結(jié)果顯示，ABSC的ALP活力高于BMSC，這與研究［8-9］結(jié)果一致。ABSC在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)情況下ALP活力的表達(dá)存在較大差異，說(shuō)明ABSC更容易受到骨誘導(dǎo)的影響。

本實(shí)驗(yàn)采用COL-1、ALP、OCN 3種骨向分化相關(guān)基因作為RT-PCR的檢測(cè)指標(biāo)，COL-1、ALP基因是成骨分化的早期標(biāo)志物，OCN是成骨分化的晚期標(biāo)志物。RT-PCR的結(jié)果表明，COL-1、ALP在ABSC中的高表達(dá)，有利于其成骨早期分泌更多的礦化基質(zhì)，這與ALP染色和ALP半定量結(jié)果相符。OCN的表達(dá)隨著時(shí)間逐漸增加與細(xì)胞進(jìn)入礦化期有關(guān)，有利于形成更多的鈣結(jié)節(jié)，其在ABSC中的高表達(dá)與茜素紅的染色結(jié)果一致。

以上結(jié)果說(shuō)明：ABSC的成骨能力與BMSC差別不大，是骨組織工程中很有潛力的種子細(xì)胞，其深入機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Canine alveolar bone-derived stem cells and bone marrow mesenchymal stromal cells：a comparative study of the osteogenic potential

Zheng Wenlong1，2，3，Wu Tao1，2，3，Zou Duohong1，2，3，et al
（1Stomatologic College of Anhui Medical University，2The Affiliated Stomatologic Hospital
of Anhui Medical University，3Key Lab of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To compare the osteogenic ability of two different canine stem cells in the application of bone tissue engineering in vitro，namely alveolar bone-derived stem cells（ABSC）and bone marrow mesenchymal stromal cells（BMSC）.Methods ABSC and BMSC were prepared from the alveolar bone and bone marrow of a dog. The third generation of these cells were used for the following studies.Firstly，the proliferation of the two cells was detected by MTT assay.Secondly，after osteogenic induction，the osteogenic ability was detected by alizarin red staining and alkaline phosphatase staining.Thirdly，after osteogenic induction for 7，14 and 21 d，the activity of intracellular alkaline phosphatase was detected by the pNPP method.Fourthly，after osteogenic induction，the expression of collagenⅠ（COL-1），alkaline phosphatase（ALP）and osteocalcin（OCN）was analyzed by RT-PCR.Results ABSC showed higher proliferative ability.After osteogenic induction，ABSC produced more calcium nodules and alkaline phosphatase.The results showed that the expression of COL-1 in ABSC was higher than that in BMSC and both of them decreased gradually.The expression of ALP in them reached the highest peak at 14 d.OCN was significantly expressed in ABSC at 14 and 21 d，and was higher in BMSC.Conclusion The osteogenic abilities of ABSC are similar to that of BMSC，which is an ideal seed cell in the research of bone tissue engineering.

bone marrow mesenchymal stromal cells；alveolar bone-derived stem cells；osteogenic differentiation

R 78.02

A

1000-1492（2016）09-1252-06

時(shí)間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.010.html

2016-06-03接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31370983）

1安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院、2安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)

院、3安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032作者簡(jiǎn)介：鄭文龍，男，碩士研究生；

陳喬爾，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：chqe0111 @163.com