拉布拉多犬骨髓基質(zhì)干細胞與牙周干膜細胞裸鼠皮下成骨能力的比較性研究

徐孟丹，周 詠，鄒多宏

拉布拉多犬骨髓基質(zhì)干細胞與牙周干膜細胞裸鼠皮下成骨能力的比較性研究

徐孟丹，周 詠，鄒多宏

目的 觀察比較拉布拉多犬骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs）和拉布拉多犬牙周膜干細胞（PDLSCs）分別與支架材料β-磷酸三鈣（β-TCP）復合后成骨能力的差異。方法 實驗分為 3組：β-TCP組、犬 BMSCs/β-TCP復合體組、犬PDLSCs/β-TCP復合體組。體外培養(yǎng)犬 BMSCs和犬PDLSCs，擴增后取第3代細胞分別接種于厚2 mm、? 6 mm的圓柱形β-TCP材料上，掃描電鏡觀察細胞與材料的黏附情況。裸鼠皮下植入各組細胞材料復合物。8周后取材，HE染色觀察新骨形成，免疫組化檢測成骨相關(guān)基因蛋白的表達。結(jié)果 掃描電鏡結(jié)果可見犬BMSCs和犬PDLSCs均可在β-TCP支架材料上正常生長。裸鼠皮下實驗中，犬BMSCs/β-TCP復合體組和犬PDLSCs/β-TCP復合體組都有骨樣組織形成，犬BMSCs/β-TCP復合體組中骨鈣素（OCN）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）表達量略高于犬PDLSCs/β-TCP復合體組。結(jié)論 兩種細胞經(jīng)體外誘導后都具有一定的成骨性能，其中BMSCs的成骨能力較PDLSCs的成骨能力強。

骨髓基質(zhì)干細胞；牙周膜干細胞；β-磷酸三鈣；裸鼠；異位成骨

外傷、腫瘤術(shù)后等原因可以造成口腔頜面部骨組織缺損，影響正常的美觀和功能恢復。目前，自體骨移植是治療骨缺損的“金標準”［1］，但是存在來源有限、供區(qū)損傷和疼痛等缺點；異體骨移植也廣泛應(yīng)用于骨缺損的治療，但免疫排斥反應(yīng)和致病性等使其無法成為理想的修復手段［2］。近年來，通過骨組織工程技術(shù)復合骨誘導因子，再選取種子細胞及生物相容性良好的可降解性的支架材料治療骨缺損成為研究的熱點。骨髓基質(zhì)干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）來源充足，擴增迅速，具有多項分化潛能，被多數(shù)研究者認為是骨組織工程較合適的種子細胞之一。研究［3］表明BMSCs具有良好的成骨能力。但是，BMSCs的獲取具有一定的風險和創(chuàng)傷性。牙周膜干細胞 （periodontal ligament stem cells，PDLSCs）易于獲得，無額外的創(chuàng)傷，患者也很容易接受。研究［4-5］表明PDLSCs具有分化成牙槽骨細胞、牙周膜細胞和成牙骨質(zhì)細胞的潛能，在生理條件下處于靜息狀態(tài)，參與維持牙周組織中細胞增殖與凋亡的平衡以及細胞功能穩(wěn)態(tài)。近年來隨著對其生物學研究的不斷深入，基于PDLSCs的現(xiàn)代組織工程，細胞治療和基因工程技術(shù)成為骨組織再生的新希望。該研究將拉布拉多犬BMSCs及PDLSCs分別與支架材料β-磷酸三鈣（β-phosphate scaffold tricalcium，β-TCP）復合并植入裸鼠皮下，比較PDLSCs與BMSCs皮下成骨能力的差異。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗動物 2只拉布拉多犬，36周齡，約15 kg，購自上海新岡實驗動物場飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心；6只BALB/c裸鼠，4周齡，18～20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養(yǎng)于中國科學技術(shù)大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、β甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C、戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）；胰蛋白酶（美國Amresco公司）；β-TCP（上海貝奧路生物材料有限公司）；CO2恒溫孵箱（美國Thermo Forma公司）；s-3400掃描電鏡（美國QUESTAR公司）；骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）抗體（美國Abcam公司）；羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；正置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 犬BMSCs的原代培養(yǎng)、擴增及成骨誘導 取成年拉布拉多犬，靜脈注射3%的戊巴比妥鈉（使用劑量為30～35 mg/kg），麻醉起效后，局部備皮消毒，使用骨髓穿刺針于髂后上棘穿刺抽取骨髓約10 ml，離心，棄上清液，接種于培養(yǎng)皿，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基約10 ml，CO2恒溫恒濕孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞融合至80%時傳代。取生長狀態(tài)良好的第3代細胞，加入成骨誘導液（100 nmol/L地塞米松、0.05 mmol/L維生素C、10 mmol/L β甘油磷酸鈉）培養(yǎng)7 d，每3 d更換培養(yǎng)液。

1.2.2 犬PDLSCs的原代培養(yǎng)、擴增及成骨誘導取成年拉布拉多犬，靜脈注射3%的戊巴比妥鈉（使用劑量為30～35 mg/kg），麻醉起效后，口內(nèi)碘伏消毒后，無菌條件下拔取左下頜三顆下前牙，置入盛有無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)瓶中，封瓶口后立即送往實驗室。在超凈工作臺內(nèi)用含雙抗的PBS自根尖至牙冠反復沖洗，用銳利剪刀片充分刮除牙頸部牙齦組織，含雙抗的PBS反復沖洗，無菌條件下用銳利手術(shù)刀片刮取牙根中部1/3的牙周膜組織，在DMEM培養(yǎng)液浸潤下，剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎塊，以5 mm間隔均勻鋪于6 cm培養(yǎng)皿底部，加入1 ml含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于孵箱內(nèi)，4 h后待組織塊貼壁完全，加入3 ml上述DMEM培養(yǎng)液，從第4天開始，每3～5 d換液1次，7～15 d左右當細胞從組織塊周圍游出并達70%～80%融合時，0.25%胰酶消化傳代。取生長狀態(tài)良好的第3代細胞，加入成骨誘導液繼續(xù)培養(yǎng)7 d，每3 d更換培養(yǎng)液。

1.2.3 種子細胞與骨架材料復合體制備 取18塊厚2 mm、直徑為6 mm的圓形β-TCP，高溫高壓消毒后浸泡在不含胎牛血清的DMEM中24 h。取誘導7 d后的第三代犬BMSCs、犬PDLSCs各3皿，消化離心棄去上清液，用3 ml的DMEM稀釋混勻，計數(shù)，并稀釋成1×107個/ml濃度的細胞懸液，滴加在 β-TCP材料中，置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)3 d。

1.2.4 掃描電鏡觀察 取出體外培養(yǎng)3 d的犬BMSCs/β-TCP、犬PDLSCs/β-TCP復合物，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入2.5%戊二醛，4℃固定30 min，PBS洗3次，乙醇系列梯度脫水，臨界點干燥，噴金后掃描電鏡觀察材料表面細胞的形態(tài)。

1.2.5 裸鼠皮下實驗 實驗分為單純β-TCP對照組、犬BMSCs/β-TCP復合體組、犬PDLSCs/β-TCP復合體組。用10%水合氯醛（使用劑量為0.35 mg/ g）麻醉裸鼠后，碘伏消毒手術(shù)區(qū)，剪開其背部的皮膚，依次植入三組材料，縫合并標記。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，觀察裸鼠背后傷口的愈合情況。植入8周后，處死裸鼠，取材，4%多聚甲醛固定后EDTA脫鈣，經(jīng)梯度酒精脫水，石蠟包埋切片，HE染色，免疫組化染色，光學顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 種子細胞體外培養(yǎng)形態(tài)觀察 牙周膜原代培養(yǎng)4 d后可見有部分細胞從組織塊中爬出，成放射狀分布，細胞呈長梭形。培養(yǎng)7 d可見有大量細胞從組織塊中爬出，快速增殖。8～10 d后可進行第1次傳代。BMSCs原代培養(yǎng)5 d后換液，待細胞融合至90%時傳代，每隔2 d更換新鮮培養(yǎng)液。BMSCs呈長梭形。見圖1。

圖1BMSCs、PDLSCs體外培養(yǎng) ×10

2.2 種子細胞與β-TCP結(jié)合情況觀察 掃描電鏡可見兩種細胞均以較高的細胞密度生長于β-TCP表面及孔隙中，細胞呈長梭形或多角形層疊生長，細胞間拉伸成網(wǎng)狀，相互交錯，兩組間未見明顯差異，見圖2。

圖2 BMSCs、PDLSCs與β-TCP掃描電鏡圖 ×1 050

2.2 種子細胞與β-TCP復合后對成骨相關(guān)基因及蛋白表達的影響 HE染色結(jié)果顯示，BMSCs/β-TCP組和PDLSCs/β-TCP組內(nèi)均有明顯的骨樣組織形成。其中BMSCs/β-TCP組的骨樣組織形成略多于PDLSCs/β-TCP組。單純材料對照組內(nèi)未見明顯骨樣組織形成（圖3A）。免疫組織化學染色結(jié)果顯示，BMSCs/β-TCP組和PDLSCs/β-TCP組內(nèi)均可見OCN和BMP-2蛋白陽性表達。BMSCs/β-TCP組的OCN和BMP-2蛋白陽性表達略多于 PDLSCs/β-TCP組。單純材料對照組內(nèi)未見明顯OCN和BMP-2蛋白陽性表達。

圖3 種子細胞與β-TCP復合后對成骨相關(guān)基因及蛋白表達的影響

3 討論

自體骨移植一直被認為是治療口腔頜面部骨組織缺損和骨折的金標準。自體骨包含了多種能有效促進組織再生的基本因素：細胞、細胞外基質(zhì)、生長因子。然而，自體骨移植花費較高、周期較長，可產(chǎn)生疼痛不適及一些并發(fā)癥。除此以外，可用的自體骨組織有限，難以修復大面積的骨缺損。通過組織工程技術(shù)，植入適宜的種子細胞，為骨缺損修復提供了新的方法。

理想的種子細胞應(yīng)具有以下特點：①增殖分化傳代能力強、可塑性強；②植入機體后性能穩(wěn)定，對受植區(qū)環(huán)境適應(yīng)能力強，無免疫排斥反應(yīng)；③取材簡便，容易獲得。成體干細胞可作為理想的種子細胞，其具有自我更新和多向分化能力。在機體需要的時候，成體干細胞可分化為所在組織的細胞，參與所在組織的代謝和結(jié)構(gòu)功能的維持。在特定的誘導下，干細胞可以“橫向分化”為其他組織細胞，實現(xiàn)其他組織的再生［6-7］。

BMSCs是目前研究較為成熟的一種成體干細胞，經(jīng)過適當?shù)捏w外誘導，BMSCs可以分化形成成骨細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、脂肪細胞等［8-10］。體內(nèi)預臨床研究［11］證實，BMSCs可加速長骨標準骨缺損修復。在牙科領(lǐng)域，利用BMSCs進行牙周組織再生及上頜竇提升也獲得了良好的結(jié)果。BMSCs作為理想的組織工程種子細胞，具有優(yōu)良的促進組織再生的作用。但是，獲取BMSCs的過程較麻煩，也會產(chǎn)生疼痛不適，可獲得的干細胞數(shù)目較低。牙周膜組織臨床上易于獲得，通過拔除牙齒就可以得到足夠可用的牙周膜，并分離培養(yǎng)出PDLSCs。Seo et al［12］于 2004年發(fā)現(xiàn) PDLSCs的存在，并證明PDLSCs可表達間充質(zhì)干細胞相關(guān)標志物STRO-1、CDs、多種成牙骨質(zhì)及成骨細胞標志物，具有成骨、成脂肪及成軟骨的多向分化潛能。將PDLSCs移植進入裸鼠體內(nèi)以后，可以形成牙骨質(zhì)/牙周膜樣組織，完成一定程度的牙周缺損修復。動物實驗顯示，除了牙骨質(zhì)牙周膜樣組織形成外，移植部位也可見新骨形成［13］。Kim et al［14］將使用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)的犬BMSCs和PDLSCs分別植入犬種植體周圍骨缺損中，結(jié)果顯示BMSCs和PDLSCs都具有修復骨缺損的能力，但是BMSCs的新骨形成能力較強。

研究［15］證實，在含有β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松的礦化誘導液中，PDLSCs可向成骨分化，在β-甘油磷酸鈉和地塞米松的共同作用下形成礦化結(jié)節(jié)，并表達成骨細胞特異性蛋白，具有更強的成骨能力。

本實驗通過使用含有地塞米松的骨誘導液體外誘導培養(yǎng)BMSCs與PDLSCs，并于裸鼠皮下接種細胞材料復合物研究兩種細胞的骨向分化能力。石蠟切片HE染色結(jié)果顯示，復合細胞的兩組材料內(nèi)均有骨樣組織形成。免疫組織化學結(jié)果顯示，OCN和BMP-2蛋白在BMSCs/β-TCP組和PDLSCs/β-TCP組內(nèi)均有表達。

本研究結(jié)果證明BMSCs和PDLSCs均有較強的成骨能力，BMSCs較 PDLSCs強，但是由于PDLSCs易于獲得，獲取的過程創(chuàng)傷小。本研究結(jié)果證實了PDLSCs可作為骨組織工程理想的種子細胞，為頜面部骨組織缺損的修復治療提供了新的方法。

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Comparison of the subcutaneous osteogenesis ability between BMSCs and PDLSCs in BALB/c-nu

Xu Mengdan，Zhou Yong，Zou Duohong
（Oral Implantology Center，Affiliated Stomatological Hospital of Anhui Medical University，
Key Laboratory of Oral Disease Research In Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To compare the ability of osteogenesis of bone marrow stromal cells（BMSCs）and periodontal ligament stem cells（PDLSCs）of Labrador dog when seeded with β-phosphate scaffold tricalcium（β-TCP）respectively into nude mice subcutaneously.Methods 3 groups were divided for the subcutaneous implant experiment：β-TCP group，BMSCs/β-TCP complex group and PDLSCs/β-TCP complex group.8 weeks after the operation，all implants were harvested and fixed.Sections were cut and stained with hematoxylin and eosin（HE）.Immunohistochemical（IHC）staining was operated to detect the expression of bone matrix protein 2（BMP2）and osteocalcin（OCN）.Results Both BMSCs and PDLSCs could adhere to the β-TCP scaffold and grew well.HE staining showed there was bony-like tissue formation both in the BMSCs group and PDLSCs group in balbc-nu experiment. More expressions of BMP-2 and OCN were observed in the BMSCs group than that in the PDLSCs group.Conclusion Both BMSCs and PDLSCs can be induced to express the osteoblast specific protein and improve bony-like tissue formation.

bone marrow stem cells；periodontal ligament stem cells；β-tricalcium phosphate；nude mice；ectopic bone formation

R 783.3

A

1000-1492（2016）09-1244-04

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.006.html

2016-05-04接收

國家自然科學基金（編號：31370983）；安徽省杰出青年科學基金（編號：1508085J08）；高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目（編號：gxyqZD2016058）；安徽醫(yī)科大學“青年拔尖人才計劃”

安徽醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙種植中心、安徽省口腔疾病

研究省級重點實驗室，合肥 230032

徐孟丹，女，碩士研究生；

鄒多宏，男，博士，副教授，責任作者，E-mail：zdhyy@ahmu. edu