大鼠活體內(nèi)Luciferase標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物發(fā)光示蹤監(jiān)測(cè)

曹 娟，呂 琪，丁 輝，于夢(mèng)洋，劉晉陽，樊毫軍

大鼠活體內(nèi)Luciferase標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物發(fā)光示蹤監(jiān)測(cè)

曹 娟1,2，呂 琪2，丁 輝2，于夢(mèng)洋2，劉晉陽2，樊毫軍2

目的 應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)監(jiān)測(cè)同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC）在健康大鼠體內(nèi)的定植與動(dòng)態(tài)分布情況。方法 Wistar大鼠BMSC經(jīng)穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，e-GFP）和熒光素酶（luciferase）基因的慢病毒感染后，經(jīng)尾靜脈注射植入Wistar大鼠體內(nèi)，通過活體成像連續(xù)監(jiān)測(cè)其動(dòng)態(tài)分布。結(jié)果 活體成像結(jié)果顯示，植入感染病毒的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Luc-GFP-BMSC）1.5 h后在大鼠體內(nèi)生物信號(hào)最強(qiáng)，主要聚集在肺，24 h后背部信號(hào)增強(qiáng)并居于主導(dǎo)，第3天胸部信號(hào)檢測(cè)不到，14 d后，全身生物信號(hào)消失。結(jié)論 同種異體大鼠BMSC經(jīng)尾靜脈植入后，首先聚集于肺部，彌散分布于背部，最終信號(hào)逐漸消失，提示經(jīng)尾靜脈注射植入可能是BMSC治療肺部疾病的有效途徑。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；生物發(fā)光；活體成像；慢病毒

植入細(xì)胞有效地向靶器官或損傷組織遷移是細(xì)胞治療的關(guān)鍵。間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchymal stem cells, MSC）具有低免疫原性、多細(xì)胞譜系分化以及促進(jìn)損傷組織修復(fù)等特性，為多種疑難雜癥的治療提供了新的方法，在各種缺乏標(biāo)準(zhǔn)治療疾病的臨床研究中發(fā)展迅速，如移植物抗宿主病[1,2]、心腦血管疾病[3]、脊髓損傷[4,5]、肝臟疾病[6]、呼吸系統(tǒng)疾病[7,8]。盡管目前體外MSC的特性已經(jīng)達(dá)成一致意見，但是關(guān)于體內(nèi)MSC的生物學(xué)特性仍有許多問題尚待解決，尤其是植入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)分布存在爭議，長期定植更是鮮有報(bào)道，在很大程度上阻礙了其臨床應(yīng)用。

生物發(fā)光技術(shù)利用熒光素酶與底物熒光素在氧氣、三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）共存的條件下，發(fā)生氧化反應(yīng)，釋放可見光能，最后在體外利用敏感的電荷耦合檢測(cè)器（charge-coupled device, CCD）設(shè)備形成圖像?？蓪?shí)現(xiàn)非侵入性地對(duì)同一觀察目標(biāo)的移動(dòng)與變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。而且，因光的產(chǎn)生需要在活細(xì)胞進(jìn)行酶促反應(yīng)[9]，生物發(fā)光示蹤帶有報(bào)告基因的細(xì)胞，信號(hào)強(qiáng)度已被證實(shí)與標(biāo)記的細(xì)胞量線性相關(guān)。該技術(shù)已被用于監(jiān)測(cè)腫瘤生長和治療后的反應(yīng)[10]，以及MSC植入心肌損傷、急性腎損傷、中風(fēng)等動(dòng)物模型后的活體示蹤監(jiān)測(cè)[11-13]。但上述研究多集中在小鼠體內(nèi)進(jìn)行。本研究通過慢病毒感染建立雙基因標(biāo)記的BMSC，應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)連續(xù)監(jiān)測(cè)同種異體BMSC在健康大鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布情況，為干細(xì)胞的基礎(chǔ)和研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠來源的BMSC及專用培養(yǎng)基、胰蛋白酶、成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、油紅O及茜素紅染料均購自廣州賽業(yè)生物科技公司，構(gòu)建攜帶e-GFP與luciferase基因的慢病毒載體及病毒包裝由上海吉?jiǎng)P基因完成，聚凝胺（polybrene）由吉?jiǎng)P基因提供，熒光染料Hoechst33342（北京鼎國公司），Leica DMI 3000B熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司），Heracell 150i細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher），IVIS SPECTRUM活體成像儀（美國PerkinElmer公司），熒光素底物（D-luciferase，美國Gold Biotechnology公司），健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-（軍）2012-0004]。

1.2 方法

1.2.1 BMSC的慢病毒感染 依據(jù)國際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)判定MSC達(dá)成的共識(shí)[14]，已對(duì)BMSC表面標(biāo)記物進(jìn)行了流式檢測(cè)。待細(xì)胞生長至90%融合度時(shí)，按照1∶2的比例傳代，擴(kuò)增后的BMSC生長達(dá)90%融合度時(shí)，0.25%胰蛋白酶對(duì)其消化、傳代，按照1×105密度將細(xì)胞種植在六孔板中，24 h后，除去陳舊培養(yǎng)液，逐滴加入攜帶e-GFP與luciferase基因的慢病毒、完全培養(yǎng)基混懸液1 ml，并加入polybrene至終濃度達(dá)5 μg/ml。置37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，8 h后更換為新鮮完全培養(yǎng)基2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，應(yīng)用熒光染料對(duì)細(xì)胞核染色，熒光倒置顯微鏡觀察慢病毒感染效率，紫外場(chǎng)選取6個(gè)視野分別計(jì)數(shù)BMSC，對(duì)應(yīng)相同視野的熒光場(chǎng)計(jì)數(shù)表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞，取兩者比值的均數(shù)計(jì)算BMSC轉(zhuǎn)染效率。待細(xì)胞達(dá)90%融合度后按1∶2傳代擴(kuò)增。

1.2.2 Luc-GFP-BMSC的成脂、成骨誘導(dǎo)分化 對(duì)擴(kuò)增后的細(xì)胞（Luc-GFP-BMSC）進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)（方法參照賽業(yè)生物科技提供資料）。成脂誘導(dǎo)前，于六孔板中按照2×105個(gè)/孔的密度接種。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全融合后，每孔加入2 ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)。3 d后，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基換為誘導(dǎo)維持培養(yǎng)基。24 h后，再換回誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。如此循環(huán)4次后，用成脂分化誘導(dǎo)維持培養(yǎng)基繼續(xù)維持5 d，4%甲醛固定，油紅O染色。進(jìn)行成骨誘導(dǎo)時(shí)，于六孔板中按照3×105個(gè)/孔的密度接種，加入足夠的完全培養(yǎng)液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察Luc-GFP-BMSC約60%融合。更換培養(yǎng)基為2 ml成骨分化誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔3 d換液。3周后，4%甲醛固定，茜素紅染色。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 20只Wistar大鼠，體重（170±10）g，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，保持室溫20～24 ℃，濕度60%，自由攝食和飲水。隨機(jī)將大鼠分為兩組，Luc-GFPBMSC植入組（實(shí)驗(yàn)組）和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）注入組（對(duì)照組），每組10只。

1.2.4 Luc-GFP-BMSC體外成像 為評(píng)價(jià)Luc-GFPBMSC內(nèi)的luciferase活性，在植入其至大鼠體內(nèi)前，種植2×105個(gè)/孔Luc-GFP-BMSC于六孔板中，對(duì)照組種植正常未感染病毒的BMSC，分別另設(shè)置復(fù)孔，于2 ml的培養(yǎng)基中加入D-luciferase（150 μg/ml），室溫孵育10 min后，置于活體成像儀的暗箱中，應(yīng)用高敏的CCD進(jìn)行成像。luciferase活性在10 min后最強(qiáng)，生物信號(hào)獲得后應(yīng)用活體成像軟件（Living Image Software 4.5）分析。

1.2.5 Luc-GFP-BMSC植入后活體成像技術(shù)示蹤監(jiān)測(cè) 將2×106個(gè)Luc-GFP-BMSC消化、離心后于1 ml滅菌后的PBS中重懸，經(jīng)尾靜脈注射入實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi)，對(duì)照組注射PBS 1 ml。分別于細(xì)胞植入后的1.5、18 h，1、2、3、7、10、14 d應(yīng)用活體成像系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè)Luc-GFP-BMSC在大鼠體內(nèi)的分布。成像前，應(yīng)用戊巴比妥鈉麻醉（50 mg/kg）大鼠后，腹腔注射D-luciferase，10 min后，放入活體成像儀成像暗箱平臺(tái)，進(jìn)行成像監(jiān)測(cè)。選定生物發(fā)光區(qū)域，計(jì)算所在區(qū)域光子數(shù)，進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSC感染慢病毒效率評(píng)估 BMSC體外培養(yǎng)時(shí)，顯微鏡下觀察細(xì)胞呈梭形、貼壁、放射狀生長，狀態(tài)良好。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果慢病毒感染大鼠BMSC的復(fù)感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI）大約為4，六孔板中感染時(shí)體積為1 ml，以此條件進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)大感染實(shí)驗(yàn)。慢病毒載體感染72 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察并計(jì)算BMSC的感染效率約為76.45%。與未感染病毒的BMSC相比較，細(xì)胞形態(tài)學(xué)無差異（圖1）。

圖1 Luc-GFP-BMSC綠色熒光蛋白的表達(dá)（×100）

2.2 Luc-GFP-BMSC成脂、成骨誘導(dǎo)分化 為評(píng)估感染病毒是否影響B(tài)MSC的分化特性，對(duì)Luc-GFPBMSC進(jìn)行體外成脂、成骨誘導(dǎo)。經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化20 d后，顯微鏡下觀察有黃色圓形脂肪滴形成，油紅O染色可見大量紅染脂滴（圖2A）；成骨誘導(dǎo)3周后，顯微鏡下觀察有淺黃色不規(guī)則團(tuán)塊形成，茜素紅染色可見陽性染色的鈣結(jié)節(jié)（圖2B）。

圖2 Luc-GFP-BMSC經(jīng)成脂、成骨誘導(dǎo)后染色（×400）

2.3 Luc-GFP-BMSC體外成像結(jié)果 BMSC感染慢病毒以后，10代之內(nèi)，仍能穩(wěn)定表達(dá)luciferase。圖3示活體成像儀觀察感染后10代BMSC表達(dá)luciferase的情況。

2.4 Luc-GFP-BMSC體內(nèi)成像結(jié)果 活體成像結(jié)果示對(duì)照組在整個(gè)成像實(shí)驗(yàn)過程中無生物發(fā)光信號(hào)，實(shí)驗(yàn)組各大鼠的生物信號(hào)強(qiáng)度相當(dāng)，整體信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間呈減低趨勢(shì)。植入Luc-GFP-BMSC后1.5 h主要聚集在肺，彌散分布于背部，胸部信號(hào)自植入細(xì)胞后呈持續(xù)衰減，至第3天檢測(cè)不到，而背部信號(hào)在植入后下降復(fù)升并在1 d后上升至最強(qiáng)，之后再次減低至第2天，3～7 d背部信號(hào)逐漸增強(qiáng)，至第7天出現(xiàn)高峰，但明顯低于24 h的光子量，之后逐漸減低，并于14 d后信號(hào)消失（圖4）。

圖3 體外檢測(cè)Luc-GFP-BMSC中l(wèi)uciferase的表達(dá)

圖4 正常Wistar大鼠經(jīng)尾靜脈植入Luc-GFP-BMSC后體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布

3 討 論

細(xì)胞治療是近些年來研究的熱點(diǎn)。植入細(xì)胞在靶器官、靶組織的存活數(shù)量是評(píng)價(jià)細(xì)胞治療有效性和安全性的關(guān)鍵因素。關(guān)于MSC植入后在體內(nèi)的歸巢及定植各項(xiàng)研究差別很大，有研究表明經(jīng)靜脈植入人MSC以后，首先聚集于肺，之后遷移至肝、脾、最后腎組織[15]，但Eggenhofer等[16]研究發(fā)現(xiàn)，MSC只存在肺組織當(dāng)中，并不向其他組織遷移。本研究發(fā)現(xiàn)靜脈植入同種異體大鼠BMSC后，主要?dú)w巢于肺，隨后遷移至背部，并逐漸消失。

植入MSC在體內(nèi)的歸巢、遷移與植入途徑及細(xì)胞數(shù)量、種類、狀態(tài)等許多因素相關(guān)，這些為臨床治療必須考慮的因素?？紤]到免疫反應(yīng)，臨床理想的細(xì)胞供者是自體。然而，對(duì)于患有血液及自身免疫性疾病患者，自體干細(xì)胞不適合用作治療。此外，自體干細(xì)胞的提取、純化、培養(yǎng)、擴(kuò)增需花費(fèi)大量時(shí)間，這可能會(huì)使患者錯(cuò)失最佳治療時(shí)間窗。在這種情況下，異體低免疫的供體干細(xì)胞非常必要。MSC因其具有低免疫原性，是細(xì)胞治療的理想候選者。本研究選取同種異體BMSC，比較貼近臨床.此外，選取靜脈輸入，也是臨床最簡便易行和常用的植入途徑。

MSC經(jīng)靜脈植入后主要聚集于肺組織，一方面有研究證實(shí)MSC的直徑大于肺部毛細(xì)血管直徑，絕大多數(shù)經(jīng)靜脈植入的MSC聚集于肺部毛細(xì)血管，限制了其向其他器官歸巢[17]。此外，MSC表達(dá)的黏附分子與肺泡上皮細(xì)胞相應(yīng)的受體結(jié)合可能參與MSC向肺的聚集以及遷移[18]。作為體內(nèi)代謝器官，腎臟血液循環(huán)豐富，有研究發(fā)現(xiàn)植入MSC后約1%存在于腎小球以及腎小管周圍毛細(xì)血管[19]，這可能是植入后干細(xì)胞數(shù)量下降的一個(gè)原因。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，BMSC在植入后很快向背部腎區(qū)遷移，而且該區(qū)域的生物信號(hào)是最后缺失的。關(guān)于背部強(qiáng)信號(hào)，除了腎組織，還有可能的聚集部位為背部皮下組織。BMSC存在于骨髓，需要黏附在細(xì)胞外基質(zhì)生存和生長，不存在于循環(huán)流通中，因此，當(dāng)不再黏附于細(xì)胞外基質(zhì)或血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，除了炎性趨化因子，它們傾向于向具有特異性的細(xì)胞外基質(zhì)衍生信號(hào)部位遷移。此外，BMSC具有向成脂細(xì)胞分化的特性，本研究發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間最短，表明可能脂肪細(xì)胞本身或胞外基質(zhì)更適于BMSC的生存，而且皮下疏松結(jié)締組織結(jié)構(gòu)較實(shí)質(zhì)器官疏松，更利于BMSC通過，但是，難以理解的是，植入后的BMSC主要聚集在背部皮下組織，而在其他部位的皮下未見生物信號(hào)。

生物信號(hào)最終消失表明BMSC未在體內(nèi)長期定植，這結(jié)果同文獻(xiàn)[15,16]報(bào)道一致。除前文提及的經(jīng)腎臟少量持續(xù)清除外，另有研究提到了失巢凋亡，即由于MSC不是循環(huán)流通細(xì)胞，需要細(xì)胞外基質(zhì)衍生的信號(hào)來生存，當(dāng)脈管系統(tǒng)中這些信號(hào)匱乏，失去基質(zhì)的永久支撐，就會(huì)引起MSC的凋亡[20,21]。這也可能是植入的BMSC消失的一個(gè)主要原因。另外，盡管大量研究證明MSC具有低免疫原性并且具有免疫調(diào)節(jié)功能，這并不能排除MSC在移植后能夠逃避宿主的免疫排斥反應(yīng)，而且本研究植入異體BMSC至具有免疫活性的大鼠體內(nèi)，并未應(yīng)用免疫抑制藥，該研究結(jié)果很有可能是在第7天宿主的免疫系統(tǒng)將移植入體內(nèi)的干細(xì)胞清除[22]。因此，筆者認(rèn)為如何減少細(xì)胞凋亡以提高細(xì)胞治療的有效性，應(yīng)該是今后細(xì)胞治療需要關(guān)注的方向。

相比其他活體內(nèi)追蹤標(biāo)記細(xì)胞的方法，生物發(fā)光技術(shù)具有其自身的優(yōu)點(diǎn)。它可實(shí)現(xiàn)非侵入性、實(shí)時(shí)連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體內(nèi)各種生物學(xué)過程，從而降低個(gè)體間差異的影響。由于背景干擾信號(hào)低，該技術(shù)具有較高的敏感性和特異性，不需要外源性激發(fā)光，避免對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞造成損傷，有利于長期觀察，并具有無放射性等優(yōu)點(diǎn)。然而生物發(fā)光也有不足之處，如其組織穿透能力具有波長依賴性，光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射等。目前該技術(shù)多用于小鼠活體成像，實(shí)驗(yàn)中需對(duì)動(dòng)物體重嚴(yán)格限制，并采取仰臥位、俯臥位監(jiān)測(cè)記錄，以盡量避免生物信號(hào)的遺漏。本研究表明，生物發(fā)光可以高度敏感地監(jiān)測(cè)植入體內(nèi)的BMSC，明確其在體內(nèi)的分布與動(dòng)態(tài)遷移，該技術(shù)不僅適用于小鼠，同樣適用于大鼠。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)尾靜脈植入異體BMSC至同種健康大鼠體內(nèi)，首先歸巢于肺，經(jīng)二次分布于整個(gè)背部，至第14天消失，證實(shí)植入的BMSC并未在體內(nèi)長期存活；同時(shí)證實(shí)生物發(fā)光技術(shù)可在大鼠體內(nèi)追蹤植入的BMSC，而不再局限于小鼠模型，這一發(fā)現(xiàn)是細(xì)胞示蹤研究的進(jìn)步，同時(shí)，本研究提示經(jīng)靜脈植入BMSC可能是治療肺部疾病的有效途徑，為基于BMSC的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（2015-11-09收稿 2015-12-23修回）

（責(zé)任編輯 付 輝）

In vivo monitoring of luciferase labeled bone marrow mesenchymal stem cells by bioluminescent in rats

CAO Juan1,2, LV Qi2, DING Hui2, YU Mengyang2, LIU Jinyang2，and FAN Haojun2. 1. Specialty of Respiratory Internal Medicine, Xinxiang Medical College, Xinxiang 453003, China; 2. Institute of Disaster and Emergency Rescue Medicine, Affiliated Hospital to Logistics University, Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300162, China

Objective To monitor the colonization and dynamic distribution of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) in healthy rats by using the technique of bioluminescent imaging. Methods BMSC from Wistar rat were infected by lentiviral which carry stable expression genes of luciferase and green fluorescence protein (Luc-GFP-BMSC), then implanted into Wistar rats by tail vein injection. Dynamic distribution of Luc-GFP-BMSC in rats was continuously monitored by using in vivo imaging system. Results In vivo imaging results showed that biological signal was strongest at 1.5 hours after implantation of Luc-GFP-BMSC in rats, and mainly resided in the lung, 24 hours later, signal in the back gradually enhanced and became dominant, after 3 days, signal in the chest couldn’t be detected, after 14 days, biological signal in the whole body disappeared. Conclusions After implantation through the tail vein, allogeneic BMSC in healthy Wistar rats initially reside in the lungs, and then egress to the back, finally the biological signal gradually disappeared, which suggests that tail vein injection of BMSC may be an effective approach for lung disease.

bone marrow mesenchymal stem cell; bioluminescent imaging; in vivo imaging; lentiviral

Q256

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.01.004

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（14ZCDZSY00033）

曹 娟，碩士研究生在讀，住院醫(yī)師，E-mail: juanziapple@126.com

1. 453003，河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科專業(yè)；2. 300162 天津，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院救援醫(yī)學(xué)研究所

樊毫軍，E-mail: fanhaojun999@126.com