過表達天山雪蓮SikCDPK1基因提高轉基因煙草耐低溫能力的機制初探

田曉涵，龐學兵，祝建波，朱新霞

石河子大學 生命科學學院農業(yè)生物技術重點實驗室，新疆 石河子 832000

過表達天山雪蓮SikCDPK1基因提高轉基因煙草耐低溫能力的機制初探

田曉涵，龐學兵，祝建波，朱新霞

石河子大學 生命科學學院農業(yè)生物技術重點實驗室，新疆 石河子 832000

鈣依賴型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases，CDPKs)在植物參與非生物脅迫信號響應中發(fā)揮著重要作用。本研究利用實時熒光定量PCR技術分析了天山雪蓮鈣依賴性蛋白激酶基因SikCDPK1在-4 ℃低溫脅迫處理下的表達量，發(fā)現低溫脅迫可以誘導天山雪蓮內源SikCDPK1基因表達，且在處理3 h表達量迅速積累達到最高值。將SikCDPK1基因構建在由組成型CaMV35S強啟動子控制的雙子葉轉化載體pCAMBIA2300上，利用農桿菌介導法轉化煙草NC89，發(fā)現轉基因煙草植株在低溫脅迫后，耐低溫能力明顯增強；脯氨酸、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性均高于非轉基因煙草植株；丙二醛含量和相對電導率均低于非轉基因煙草植株。上述研究結果表明，SikCDPK1基因可以通過積累滲透調節(jié)物質、增強抗氧化酶活性和維持細胞膜穩(wěn)定性來提高植物的耐低溫能力。

天山雪蓮；SikCDPK1基因；低溫；表達分析；轉基因

低溫、干旱、鹽漬、洪澇等非生物逆境脅迫是制約農作物產量和品質的主要限制因素[1]，在長期的進化過程中，植物形成了復雜而又精細的信號轉導途徑，從而保護自身免受脅迫傷害。在植物細胞的信號轉導過程中，鈣離子作為第二信使，在植物生長發(fā)育和感知環(huán)境刺激的過程中扮演了非常重要的角色，其中鈣依賴型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs)是一類廣泛存在于植物中的Ser/Thr類蛋白激酶，可不需鈣調素而被鈣信號直接激活，對植物感受鈣信號并在細胞內放大信號和傳遞信號起關鍵作用[2]。自1982年在豌豆[3]中發(fā)現鈣依賴蛋白激酶至今，陸續(xù)又在擬南芥[4]、水稻[5]、小麥[6]、煙草[7]、玉米[8]、黃瓜[9]等多種植物中發(fā)現，是植物中研究較多、了解較清楚的一類蛋白激酶。在轉錄水平上，CDPKs基因能夠被多種脅迫信號誘導表達。過表達擬南芥AtCDPK1基因能明顯提高轉基因擬南芥在低溫、高鹽和ABA脅迫下的耐受能力[10]；低溫能誘導胡楊PeCPK10基因的表達，PeCPK10在擬南芥中異源表達可以提高轉基因擬南芥的抗寒性[11]；低溫脅迫下，玉米ZmCPK1基因表達上調，ZmCPK1可以抑制冷脅迫誘導的Zmerf3基因的表達[12]；低溫能誘導水稻OsCDPK13基因的表達，在OsCDPK13啟動子區(qū)發(fā)現了低溫應答元件LTRECOREATCORl5[13]。

天山雪蓮(Sasussured involucrataKar.et Kir)能夠在常年積雪、氣候多變、晝夜溫差懸殊的海拔2400 m至4100 m的山坡、山谷和石縫中生長，完成生活史，是優(yōu)異的抗逆資源。本研究利用前期研究獲得的天山雪蓮SikCDPK1基因，構建組成型表達載體導入煙草，測定低溫脅迫下轉基因植株體內滲透調節(jié)物質、抗氧化酶活性和細胞膜穩(wěn)定性變化，探討在煙草中過表達天山雪蓮SikCDPK1基因對低溫逆境脅迫的響應機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

天山雪蓮 (Sasussured involucrataKar.et Kir)，煙草(Nicotiana tabacumL.)品種NC89均由新疆石河子大學農業(yè)生物技術重點實驗室保存。

1.1.2 菌株及試劑

大腸桿菌DH5α、農桿菌GV3101、植物表達載體pCAMBIA- 2300由本實驗室保存。植物總RNA提取試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司，cDNA合成試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司，限制性內切酶、T4DNA ligase購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司，SYBR GreenⅠMaster Mix購自羅氏診斷產品（上海）有限公司，其他試劑均為分析純。引物合成由北京六合華大基因科技股份有限公司完成，本實驗所用引物見表1，酶切位點用下劃線標注。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1 低溫脅迫下天山雪蓮內源SikCDPK1基因表達分析

將天山雪蓮無菌苗置于-4℃光照培養(yǎng)箱進行低溫脅迫處理，分別取處理0（CK）、1、3、6、12、24 h葉片樣品，液氮速凍，-70℃保存。分別提取對照和不同時間處理的雪蓮RNA，以cDNA為模板，對SikCDPK1基因在低溫脅迫下的表達進行分析。以天山雪蓮看家基因GAPDH作為內參基因，按照Roche公司SYBR GreenⅠMaster Mix 試劑盒說明書操作，利用Light Cycler? 480Ⅱ PCR儀(Roche)進行擴增。反應程序為94℃預變性5min；94℃變性15s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)。試驗進行3次重復，取平均值，結果采用2-ΔΔCt法對數據進行分析。

1.2.2 pCAMBIA2300- SikCDPK1植物表達載體的構建

用BamHI和SalI分別雙酶切植物表達載體pCAMBIA2300和陽性克隆載體pMD19-SikCDPK1，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的基因和載體大片段。經T4DNA連接酶16℃過夜連接，重組子轉化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞，經菌落PCR、雙酶切鑒定，陽性克隆命名為pCAMBIA2300-SikCDPK1，電擊法轉入農桿菌GV3101。

1.2.3 煙草轉化及分子鑒定

將含有質粒pCAMBIA2300-SikCDPK1的農桿菌通過葉盤法轉化無菌煙草NC89，將侵染的煙草葉片置于含有80 μg﹒mL-1卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上進行初步篩選，待葉邊緣的愈傷組織逐漸分化出叢生芽，并長至2～3 cm左右時，置于卡那霉素抗性的生根培養(yǎng)基中，待根系發(fā)達后移入營養(yǎng)土中。經過15～20 d左右，改良CTAB法提取煙草基因組DNA，進行PCR檢測，提取PCR陽性的轉化株和受體煙草的總RNA，RT-PCR法檢測SikCDPK1基因的轉錄水平。

1.2.4 轉SikCDPK1基因煙草低溫脅迫實驗

選取生長旺盛、大小一致的野生型和T0代轉基因煙草株系(line1、line2)各3株，放入-4℃的人工氣候箱進行低溫脅迫處理0、3、6、9、12h，然后將植株放入25℃培養(yǎng)箱恢復24h，記錄各階段煙草的形態(tài)變化，并在不同處理階段分別取樣，-70℃冷凍保存。

1.2.5 生理指標的測定

采用李合生[14]的方法測定野生型和轉基因型株系煙草葉片在低溫脅迫處理0、3、6、9、12h后的脯氨酸(Proline)、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白含量、相對電導率及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性變化，實驗進行生物學重復3次。

1.2.6 數據分析

實驗數據采用SPSS17.0軟件進行統計分析，以LSD法進行差異顯著性分析，顯著性水平設定為P＜0.05(顯著水平)和P＜0.01(極顯著水平)，采用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 天山雪蓮SikCDPK1基因受低溫脅迫誘導表達

qRT-PCR結果表明，低溫脅迫能夠改變雪蓮內源SikCDPK1基因的表達量(圖1)。-4 ℃脅迫處理1 h，SikCDPK1基因表達量急速下降，而后表達量迅速上升，處理3h時達到最大值，為對照的5.8倍；隨著處理時間的延長，表達量降為初始水平；12h時表達量降至最低，僅為對照表達量的9.6 %；24h時表達量又開始上升，為對照的1.79倍，推測SikCDPK1基因在低溫脅迫中起作用。本研究中脅迫處理1 h的表達量要低于未脅迫的表達量，這可能是由于天山雪蓮在-4℃環(huán)境呈現應激反應導致。

圖1 低溫脅迫下SikCDPK1基因的表達分析Fig. 1 Analysis of SikCDPK1 gene expression under cold stress

2.2 轉基因煙草的獲得及鑒定

將SikCDPK1基因插入到由組成型CaMV35S啟動子控制的表達載體pCAMBIA2300上(圖2)。SikCDPK1基因特異引物PCR檢測陽性轉化株(圖3)。提取鑒定為陽性植株葉片中的RNA，進行半定量表達分析，結果表明SikCDPK1基因在過表達煙草中可以正常轉錄(圖3)，其中泳道9和10分別命名為Line1、Line2，用于后續(xù)實驗。

圖2 載體pCAMBIA2300-SikCDPK1構建簡圖Fig. 2 Figure of pCAMBIA2300-SikCDPK1 vector

圖3 轉SikCDPK1基因煙草的PCR和RT-PCR檢測Fig.3 PCR and RT-PCR identification of the SikCDPK1 transgenic plants

2.3 轉基因煙草耐低溫能力分析

2.3.1 低溫脅迫下轉基因煙草表型變化

將野生型和表達量高的轉基因株系放入-4℃人工氣候箱內進行低溫脅迫處理。如圖4 A所示，室溫生長狀態(tài)下，野生型和轉基因株系沒有明顯表型差異；置于-4℃培養(yǎng)箱3 h后，野生型煙草葉片輕度下垂，表現出輕微冷害特征，轉基因煙草無明顯表型變化(圖4 B)；低溫脅迫6 h后，野生型煙草冷害癥狀愈發(fā)明顯，葉片中度萎蔫，出現傷斑，而轉基因煙草依舊未出現明顯變化(圖4 C)；低溫脅迫9 h后，野生型煙草基本完全萎蔫，水漬狀明顯，只有頂部小葉芽還有生命體征，而轉基因煙草此時葉片輕微疲軟(圖4 D)；低溫脅迫12 h后，野生型煙草完全萎蔫，而轉基因煙草葉片卷曲并下垂，萎蔫嚴重(圖4 E)；室溫恢復24 h后，野生型煙草無明顯恢復現象，而轉基因煙草葉片開始伸展，逐漸恢復(圖4 F)。

2.3.2 低溫脅迫下轉基因煙草生理指標變化

對低溫脅迫不同處理時間的野生型和轉基因煙草分別進行了脯氨酸、可溶性蛋白、MDA含量，POD、SOD活性和相對電導率的測定。

圖4 野生型和轉基因煙草低溫脅迫下的形態(tài)特征Fig. 4 Phenotypes of WT, line 1 and line 2 under cold stress

圖5 低溫脅迫對野生型(WT)和轉SikCDPK1基因煙草部分生理指標的影響Fig. 5 Effect of cold stress on physiological contentis of WT and SikCDPK1 tobacco

結果表明，低溫處理前，野生型和轉基因型煙草脯氨酸含量差別不大，隨著低溫脅迫時間的增加，脯氨酸含量呈現上升—下降—上升—下降的趨勢，轉基因植株脯氨酸含量高于野生型(圖5 A)，在3 h和9 h之間達到極顯著水平。說明低溫脅迫下，轉基因煙草可以積累更多的脯氨酸，從而提高植株的耐冷性。

低溫處理前，野生型和轉基因型煙草可溶性蛋白含量差別較小，隨著低溫脅迫時間的增加，轉基因煙草葉片可溶性蛋白含量增加幅度大于野生型（圖5 B），在6 h后達到極顯著水平；室溫恢復24 h后，野生型煙草可溶性蛋白含量仍在增加，而轉基因煙草開始逐漸下降。說明在低溫脅迫下，轉基因煙草葉片可溶性蛋白含量增加使細胞液濃度增大，從而增強了植株的抗寒性。

低溫處理前，野生型和轉基因型煙草MDA含量差別不大，隨著低溫脅迫時間的延長，野生型和轉基因煙草MDA含量均呈現上升趨勢（圖5 C），轉基因植株MDA含量低于野生型，在9 h時達到極顯著水平；在室溫恢復階段MDA含量開始下降。說明低溫脅迫下轉基因植株細胞膜受損程度較輕。

在正常生長狀態(tài)下，野生型和轉基因煙草POD和SOD活性無明顯差異(圖5 D, E)，隨著低溫脅迫時間的延長，野生型和轉基因煙草POD活性持續(xù)上升，在冷處理6 h達到最高值，分別為初始的2.16倍和2.29倍，隨后開始下降，在恢復階段又開始上升；而SOD活性處于持續(xù)上升狀態(tài)，轉基因煙草SOD活性增長幅度高于野生型，在恢復24 h后開始下降。說明低溫脅迫下，轉基因煙草擁有更高的POD和SOD活性，對細胞膜能起到保護作用，從而增強植株的抗寒性。

隨著脅迫時間的延長，野生型和轉基因煙草相對電導率均呈明顯上升趨勢(圖5 F)，在室溫恢復24 h后轉基因煙草相對電導率開始下降，而CK仍保持上升趨勢；整個過程轉基因植株相對電導率顯著低于野生型，其中第6 h和第9 h達到極顯著水平。說明低溫脅迫下，轉基因植株細胞膜透性變化相對較小，胞質外滲程度較低，細胞膜受損較輕。

本試驗結果顯示SikCDPK1基因顯著提高了轉基因煙草的耐低溫能力。CDPKs基因家族成員較多，且不同CDPK基因成員對低溫脅迫的響應模式可能不同，后續(xù)還需要發(fā)掘并研究CDPK低溫信號轉導途徑的關鍵分子、篩選出下游有價值的與SikCDPK1相互作用的蛋白等，從而更好的揭示SikCDPK1基因的抗逆分子機制。

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：TIAN Xiaohan, PANG Xuebing, ZHU Jianbo, et al. Effect of over-expression ofSaussurea involucrataSikCDPK1gene on improving cold tolerance in transgenic tobacco [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(6)

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關鍵詞：沿階草；OjDREB基因；耐鹽性；煙草

Effect of over-expression ofSaussurea involucrata SikCDPK1gene on improving cold tolerance in transgenic tobacco

TIAN Xiaohan, PANG Xuebing, ZHU Jianbo, ZHU Xinxia
Key Laboratory of Agricultural Biotechnology,College of Life Science, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

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Sasussured involucrataKar.et Kir;SikCDPK1; low temperature; expression analysis; transgenosis

田曉涵，龐學兵，祝建波，等. 過表達天山雪蓮SikCDPK1基因提高轉基因煙草耐低溫能力的機制初探[J]. 中國煙草學報，2016,22（6）

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田曉涵（1990—），碩士，研究方向為環(huán)境生物技術，Email：723745781@qq.com

朱新霞（1968—），Email：302641316@qq.com

2016-06-12