過(guò)表達(dá)天山雪蓮SikCDPK1基因提高轉(zhuǎn)基因煙草耐低溫能力的機(jī)制初探

田曉涵，龐學(xué)兵，祝建波，朱新霞

石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000

過(guò)表達(dá)天山雪蓮SikCDPK1基因提高轉(zhuǎn)基因煙草耐低溫能力的機(jī)制初探

田曉涵，龐學(xué)兵，祝建波，朱新霞

石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000

鈣依賴(lài)型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases，CDPKs)在植物參與非生物脅迫信號(hào)響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了天山雪蓮鈣依賴(lài)性蛋白激酶基因SikCDPK1在-4 ℃低溫脅迫處理下的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫可以誘導(dǎo)天山雪蓮內(nèi)源SikCDPK1基因表達(dá)，且在處理3 h表達(dá)量迅速積累達(dá)到最高值。將SikCDPK1基因構(gòu)建在由組成型CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子控制的雙子葉轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA2300上，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草NC89，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株在低溫脅迫后，耐低溫能力明顯增強(qiáng)；脯氨酸、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶活性均高于非轉(zhuǎn)基因煙草植株；丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率均低于非轉(zhuǎn)基因煙草植株。上述研究結(jié)果表明，SikCDPK1基因可以通過(guò)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、增強(qiáng)抗氧化酶活性和維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性來(lái)提高植物的耐低溫能力。

天山雪蓮；SikCDPK1基因；低溫；表達(dá)分析；轉(zhuǎn)基因

低溫、干旱、鹽漬、洪澇等非生物逆境脅迫是制約農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要限制因素[1]，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物形成了復(fù)雜而又精細(xì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而保護(hù)自身免受脅迫傷害。在植物細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，鈣離子作為第二信使，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和感知環(huán)境刺激的過(guò)程中扮演了非常重要的角色，其中鈣依賴(lài)型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs)是一類(lèi)廣泛存在于植物中的Ser/Thr類(lèi)蛋白激酶，可不需鈣調(diào)素而被鈣信號(hào)直接激活，對(duì)植物感受鈣信號(hào)并在細(xì)胞內(nèi)放大信號(hào)和傳遞信號(hào)起關(guān)鍵作用[2]。自1982年在豌豆[3]中發(fā)現(xiàn)鈣依賴(lài)蛋白激酶至今，陸續(xù)又在擬南芥[4]、水稻[5]、小麥[6]、煙草[7]、玉米[8]、黃瓜[9]等多種植物中發(fā)現(xiàn)，是植物中研究較多、了解較清楚的一類(lèi)蛋白激酶。在轉(zhuǎn)錄水平上，CDPKs基因能夠被多種脅迫信號(hào)誘導(dǎo)表達(dá)。過(guò)表達(dá)擬南芥AtCDPK1基因能明顯提高轉(zhuǎn)基因擬南芥在低溫、高鹽和ABA脅迫下的耐受能力[10]；低溫能誘導(dǎo)胡楊PeCPK10基因的表達(dá)，PeCPK10在擬南芥中異源表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒性[11]；低溫脅迫下，玉米ZmCPK1基因表達(dá)上調(diào)，ZmCPK1可以抑制冷脅迫誘導(dǎo)的Zmerf3基因的表達(dá)[12]；低溫能誘導(dǎo)水稻OsCDPK13基因的表達(dá)，在OsCDPK13啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了低溫應(yīng)答元件LTRECOREATCORl5[13]。

天山雪蓮(Sasussured involucrataKar.et Kir)能夠在常年積雪、氣候多變、晝夜溫差懸殊的海拔2400 m至4100 m的山坡、山谷和石縫中生長(zhǎng)，完成生活史，是優(yōu)異的抗逆資源。本研究利用前期研究獲得的天山雪蓮SikCDPK1基因，構(gòu)建組成型表達(dá)載體導(dǎo)入煙草，測(cè)定低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶活性和細(xì)胞膜穩(wěn)定性變化，探討在煙草中過(guò)表達(dá)天山雪蓮SikCDPK1基因?qū)Φ蜏啬婢趁{迫的響應(yīng)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

天山雪蓮 (Sasussured involucrataKar.et Kir)，煙草(Nicotiana tabacumL.)品種NC89均由新疆石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 菌株及試劑

大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、植物表達(dá)載體pCAMBIA- 2300由本實(shí)驗(yàn)室保存。植物總RNA提取試劑盒購(gòu)于北京艾德萊生物科技有限公司，cDNA合成試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA ligase購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司，SYBR GreenⅠMaster Mix購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司，其他試劑均為分析純。引物合成由北京六合華大基因科技股份有限公司完成，本實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1，酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)注。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1 低溫脅迫下天山雪蓮內(nèi)源SikCDPK1基因表達(dá)分析

將天山雪蓮無(wú)菌苗置于-4℃光照培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫脅迫處理，分別取處理0（CK）、1、3、6、12、24 h葉片樣品，液氮速凍，-70℃保存。分別提取對(duì)照和不同時(shí)間處理的雪蓮RNA，以cDNA為模板，對(duì)SikCDPK1基因在低溫脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析。以天山雪蓮看家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，按照Roche公司SYBR GreenⅠMaster Mix 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，利用Light Cycler? 480Ⅱ PCR儀(Roche)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性15s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，取平均值，結(jié)果采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.2 pCAMBIA2300- SikCDPK1植物表達(dá)載體的構(gòu)建

用BamHI和SalI分別雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA2300和陽(yáng)性克隆載體pMD19-SikCDPK1，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目的基因和載體大片段。經(jīng)T4DNA連接酶16℃過(guò)夜連接，重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR、雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆命名為pCAMBIA2300-SikCDPK1，電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。

1.2.3 煙草轉(zhuǎn)化及分子鑒定

將含有質(zhì)粒pCAMBIA2300-SikCDPK1的農(nóng)桿菌通過(guò)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化無(wú)菌煙草NC89，將侵染的煙草葉片置于含有80 μg﹒mL-1卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上進(jìn)行初步篩選，待葉邊緣的愈傷組織逐漸分化出叢生芽，并長(zhǎng)至2～3 cm左右時(shí)，置于卡那霉素抗性的生根培養(yǎng)基中，待根系發(fā)達(dá)后移入營(yíng)養(yǎng)土中。經(jīng)過(guò)15～20 d左右，改良CTAB法提取煙草基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，提取PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化株和受體煙草的總RNA，RT-PCR法檢測(cè)SikCDPK1基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.4 轉(zhuǎn)SikCDPK1基因煙草低溫脅迫實(shí)驗(yàn)

選取生長(zhǎng)旺盛、大小一致的野生型和T0代轉(zhuǎn)基因煙草株系(line1、line2)各3株，放入-4℃的人工氣候箱進(jìn)行低溫脅迫處理0、3、6、9、12h，然后將植株放入25℃培養(yǎng)箱恢復(fù)24h，記錄各階段煙草的形態(tài)變化，并在不同處理階段分別取樣，-70℃冷凍保存。

1.2.5 生理指標(biāo)的測(cè)定

采用李合生[14]的方法測(cè)定野生型和轉(zhuǎn)基因型株系煙草葉片在低溫脅迫處理0、3、6、9、12h后的脯氨酸(Proline)、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白含量、相對(duì)電導(dǎo)率及超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)活性變化，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以LSD法進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性水平設(shè)定為P＜0.05(顯著水平)和P＜0.01(極顯著水平)，采用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 天山雪蓮SikCDPK1基因受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果表明，低溫脅迫能夠改變雪蓮內(nèi)源SikCDPK1基因的表達(dá)量(圖1)。-4 ℃脅迫處理1 h，SikCDPK1基因表達(dá)量急速下降，而后表達(dá)量迅速上升，處理3h時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照的5.8倍；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量降為初始水平；12h時(shí)表達(dá)量降至最低，僅為對(duì)照表達(dá)量的9.6 %；24h時(shí)表達(dá)量又開(kāi)始上升，為對(duì)照的1.79倍，推測(cè)SikCDPK1基因在低溫脅迫中起作用。本研究中脅迫處理1 h的表達(dá)量要低于未脅迫的表達(dá)量，這可能是由于天山雪蓮在-4℃環(huán)境呈現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致。

圖1 低溫脅迫下SikCDPK1基因的表達(dá)分析Fig. 1 Analysis of SikCDPK1 gene expression under cold stress

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及鑒定

將SikCDPK1基因插入到由組成型CaMV35S啟動(dòng)子控制的表達(dá)載體pCAMBIA2300上(圖2)。SikCDPK1基因特異引物PCR檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株(圖3)。提取鑒定為陽(yáng)性植株葉片中的RNA，進(jìn)行半定量表達(dá)分析，結(jié)果表明SikCDPK1基因在過(guò)表達(dá)煙草中可以正常轉(zhuǎn)錄(圖3)，其中泳道9和10分別命名為L(zhǎng)ine1、Line2，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 載體pCAMBIA2300-SikCDPK1構(gòu)建簡(jiǎn)圖Fig. 2 Figure of pCAMBIA2300-SikCDPK1 vector

圖3 轉(zhuǎn)SikCDPK1基因煙草的PCR和RT-PCR檢測(cè)Fig.3 PCR and RT-PCR identification of the SikCDPK1 transgenic plants

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草耐低溫能力分析

2.3.1 低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草表型變化

將野生型和表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因株系放入-4℃人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行低溫脅迫處理。如圖4 A所示，室溫生長(zhǎng)狀態(tài)下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系沒(méi)有明顯表型差異；置于-4℃培養(yǎng)箱3 h后，野生型煙草葉片輕度下垂，表現(xiàn)出輕微冷害特征，轉(zhuǎn)基因煙草無(wú)明顯表型變化(圖4 B)；低溫脅迫6 h后，野生型煙草冷害癥狀愈發(fā)明顯，葉片中度萎蔫，出現(xiàn)傷斑，而轉(zhuǎn)基因煙草依舊未出現(xiàn)明顯變化(圖4 C)；低溫脅迫9 h后，野生型煙草基本完全萎蔫，水漬狀明顯，只有頂部小葉芽還有生命體征，而轉(zhuǎn)基因煙草此時(shí)葉片輕微疲軟(圖4 D)；低溫脅迫12 h后，野生型煙草完全萎蔫，而轉(zhuǎn)基因煙草葉片卷曲并下垂，萎蔫嚴(yán)重(圖4 E)；室溫恢復(fù)24 h后，野生型煙草無(wú)明顯恢復(fù)現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因煙草葉片開(kāi)始伸展，逐漸恢復(fù)(圖4 F)。

2.3.2 低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草生理指標(biāo)變化

對(duì)低溫脅迫不同處理時(shí)間的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草分別進(jìn)行了脯氨酸、可溶性蛋白、MDA含量，POD、SOD活性和相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定。

圖4 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草低溫脅迫下的形態(tài)特征Fig. 4 Phenotypes of WT, line 1 and line 2 under cold stress

圖5 低溫脅迫對(duì)野生型(WT)和轉(zhuǎn)SikCDPK1基因煙草部分生理指標(biāo)的影響Fig. 5 Effect of cold stress on physiological contentis of WT and SikCDPK1 tobacco

結(jié)果表明，低溫處理前，野生型和轉(zhuǎn)基因型煙草脯氨酸含量差別不大，隨著低溫脅迫時(shí)間的增加，脯氨酸含量呈現(xiàn)上升—下降—上升—下降的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量高于野生型(圖5 A)，在3 h和9 h之間達(dá)到極顯著水平。說(shuō)明低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草可以積累更多的脯氨酸，從而提高植株的耐冷性。

低溫處理前，野生型和轉(zhuǎn)基因型煙草可溶性蛋白含量差別較小，隨著低溫脅迫時(shí)間的增加，轉(zhuǎn)基因煙草葉片可溶性蛋白含量增加幅度大于野生型（圖5 B），在6 h后達(dá)到極顯著水平；室溫恢復(fù)24 h后，野生型煙草可溶性蛋白含量仍在增加，而轉(zhuǎn)基因煙草開(kāi)始逐漸下降。說(shuō)明在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草葉片可溶性蛋白含量增加使細(xì)胞液濃度增大，從而增強(qiáng)了植株的抗寒性。

低溫處理前，野生型和轉(zhuǎn)基因型煙草MDA含量差別不大，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（圖5 C），轉(zhuǎn)基因植株MDA含量低于野生型，在9 h時(shí)達(dá)到極顯著水平；在室溫恢復(fù)階段MDA含量開(kāi)始下降。說(shuō)明低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞膜受損程度較輕。

在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草POD和SOD活性無(wú)明顯差異(圖5 D, E)，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草POD活性持續(xù)上升，在冷處理6 h達(dá)到最高值，分別為初始的2.16倍和2.29倍，隨后開(kāi)始下降，在恢復(fù)階段又開(kāi)始上升；而SOD活性處于持續(xù)上升狀態(tài)，轉(zhuǎn)基因煙草SOD活性增長(zhǎng)幅度高于野生型，在恢復(fù)24 h后開(kāi)始下降。說(shuō)明低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草擁有更高的POD和SOD活性，對(duì)細(xì)胞膜能起到保護(hù)作用，從而增強(qiáng)植株的抗寒性。

隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)電導(dǎo)率均呈明顯上升趨勢(shì)(圖5 F)，在室溫恢復(fù)24 h后轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)電導(dǎo)率開(kāi)始下降，而CK仍保持上升趨勢(shì)；整個(gè)過(guò)程轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于野生型，其中第6 h和第9 h達(dá)到極顯著水平。說(shuō)明低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞膜透性變化相對(duì)較小，胞質(zhì)外滲程度較低，細(xì)胞膜受損較輕。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示SikCDPK1基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐低溫能力。CDPKs基因家族成員較多，且不同CDPK基因成員對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)模式可能不同，后續(xù)還需要發(fā)掘并研究CDPK低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵分子、篩選出下游有價(jià)值的與SikCDPK1相互作用的蛋白等，從而更好的揭示SikCDPK1基因的抗逆分子機(jī)制。

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：TIAN Xiaohan, PANG Xuebing, ZHU Jianbo, et al. Effect of over-expression ofSaussurea involucrataSikCDPK1gene on improving cold tolerance in transgenic tobacco [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(6)

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轉(zhuǎn)OjDREB基因提高煙草耐鹽能力的研究

【作者】 李聰，郭夢(mèng)陽(yáng)，韓烈保

中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2012年第4期

摘要：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將沿階草OjDREB基因轉(zhuǎn)入煙草植株中。通過(guò)RT-PCR檢測(cè),獲得轉(zhuǎn)OjDREB基因的煙草植株。以400mmol/L NaCl處理轉(zhuǎn)基因煙草植株和野生型對(duì)照10 d后,結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)葉綠素含量和SOD酶活性是野生型對(duì)照的16.98倍和1.91倍;體內(nèi)的MDA含量和電解質(zhì)滲透率分別是野生型對(duì)照的59.23%和55.07%,說(shuō)明過(guò)量表達(dá)OjDREB基因可以提高煙草的耐鹽能力。

關(guān)鍵詞：沿階草；OjDREB基因；耐鹽性；煙草

Effect of over-expression ofSaussurea involucrata SikCDPK1gene on improving cold tolerance in transgenic tobacco

TIAN Xiaohan, PANG Xuebing, ZHU Jianbo, ZHU Xinxia
Key Laboratory of Agricultural Biotechnology,College of Life Science, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

CDPKs(calcium-dependent protein kinases) play a very important role in abiotic stress response. Real-time PCR was used to analyze expression ofSikCDPK1gene to cold stress inSaussurea involucrata. Results showed that endogenousSikCDPK1gene was induced by cold stress, andSikCDPK1expression reached the peak after 3 h. TheSikCDPK1gene was constructed on dicotyledonous transformation vector pCAMBIA2300, which was composed of a strong promoter of CaMV35S, and the gene was introduced into tobacco NC89 byAgrobacturium-mediated transformation method to identify the gene function. It turned out that after cold stress, cold resistance of transgenic tobacco plants was significantly enhanced, and the content of proline, soluble protein and the activities of POD and SOD in transgenic tobacco plants were higher than that of wild type, whereas the MDA content and electrolyte leakage were lower than that of wild type plants. These results indicated thatSikCDPK1gene could enhance the resistance of plants to cold stress by accumulating more osmotic adjustment substances, enhancing the activity of the antioxidant system and maintaining the stability of the cell membrane.

Sasussured involucrataKar.et Kir;SikCDPK1; low temperature; expression analysis; transgenosis

田曉涵，龐學(xué)兵，祝建波，等. 過(guò)表達(dá)天山雪蓮SikCDPK1基因提高轉(zhuǎn)基因煙草耐低溫能力的機(jī)制初探[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2016,22（6）

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)“新疆特色植物基因資源研究與利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”(2014CC005); 石河子大學(xué)育種專(zhuān)項(xiàng)(gxjs2014-yz04)

田曉涵（1990—），碩士，研究方向?yàn)榄h(huán)境生物技術(shù)，Email：723745781@qq.com

朱新霞（1968—），Email：302641316@qq.com

2016-06-12