2015年四川省風疹病毒分離株的基因特征分析

劉李 何吉蘭 馬小珍 曹冉冉 黃玉蘭

610041 成都，四川省疾病預(yù)防控制中心

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·論著·

2015年四川省風疹病毒分離株的基因特征分析

劉李 何吉蘭 馬小珍 曹冉冉 黃玉蘭

610041 成都，四川省疾病預(yù)防控制中心

目的 了解2015年四川省風疹病毒的基因特征。方法 采用Vero/SLAM細胞分離培養(yǎng)風疹病毒，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)方法擴增風疹病毒E1基因編碼的739個核苷酸片段，并對擴增產(chǎn)物進行序列測定和分析。結(jié)果 19株風疹病毒分離株均屬于2B基因型，分離株之間的核苷酸和氨基酸同源性分別為99%-100%和97.9%-100%，重要位點未發(fā)生變異。結(jié)論 2015年四川省流行的風疹病毒為2B基因型。

風疹是由風疹病毒(Rubella Virus, RV)引起的以發(fā)熱和出疹為主要臨床癥狀的急性呼吸道傳染病，可通過呼吸道以及直接接觸進行傳播。一般感染后臨床癥狀較輕，并發(fā)癥少，但如果妊娠早期感染風疹病毒，可引起胎兒流產(chǎn)、死亡或嬰兒出生后出現(xiàn)以多器官嚴重損傷為主要表現(xiàn)的先天性風疹綜合癥(Congenital rubella syndrome, CRS)[1]。

RV是披膜病毒科風疹病毒屬(Rubivirus)的唯一成員，為有包膜的單股正鏈核糖核酸(Ribonucleic Acid, RNA)病毒，只有1個血清型，但有多個基因型。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)將E1基因的739個核苷酸作為RV基因型劃分和常規(guī)分子流行病學研究的標準靶核苷酸序列，目前分為12個可識別基因型(1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、2A、2B和2C)和1個臨時基因型(1A)，其中1E和2B是分布最廣的兩種基因型[2,3]。

四川省于2006年首次分離到RV[4]，并在此基礎(chǔ)上逐漸建立了我省風疹病毒數(shù)據(jù)庫。2015年各市州監(jiān)測到多起疑似風疹散發(fā)病例，并對獲得的RV進行了基因特征分析。

1 材料與方法

1.1 標本的采集和處理 各市(區(qū)、縣)疾病預(yù)防控制中心采集疑似風疹患者(出疹5 d內(nèi))咽拭子，標本保存在病毒標本運輸液中，-20 ℃或以下溫度保存，冷凍運輸。標本用終濃度各為1 000 U/ml的青霉素和1 000 μg/ml的鏈霉素處理后，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病毒分離培養(yǎng) 將處理后的咽拭子標本接種于在培養(yǎng)管中生長良好的Vero/SLAM單層細胞上，置5% CO2培養(yǎng)箱，36 ℃連續(xù)培養(yǎng)7 d，逐日觀察pH值變化和細胞病變(Cytopathic effect, CPE)[5]。由于RV不能使細胞發(fā)生明顯的CPE，因此盲傳三代。Vero/SLAM細胞由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國家麻疹風疹實驗室提供。

1.3 風疹病毒RNA提取和鑒定 采用Promega公司的 Maxwell? 16 Viral Total Nucleic Acid Purifi-cation Kit，用Maxwell? 16 Instrument(Magnetic Particle Processor AS2000)按試劑盒說明書提取病毒RNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測RV的核酸。

1.4 RT-PCR 將RV核酸陽性標本的RNA采用Qiagen公司OneStep RT-PCR Kit進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。分別擴增RV E1基因的479個核苷酸片段(8633F-9112R)和633個核苷酸片段(8945F-9577R)，反應(yīng)條件為50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5 核苷酸序列測定和分析 擴增產(chǎn)物在毛細管電泳上鑒定后用Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)按說明書進行純化。純化產(chǎn)物經(jīng)標記反應(yīng)后在ABI 3500xl DNA 測序儀上自動完成序列測定。分別使用BioEdit 7.0和MEGA 6.0軟件對我省分離到的19株毒株El基因編碼的739個核苷酸(8 731-9 469nt)與WHO公布的32個基因型參考株進行基因親緣性關(guān)系樹的構(gòu)建以及核苷酸和氨基酸序列的同源性分析(Kimura 2 參數(shù)模型，鄰位-連接法，1 000次bootstrap檢驗)。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離和鑒定 2015年共收到34份疑似風疹病例咽拭子標本，接種到Vero/SLAM細胞上未見明顯CPE；經(jīng)實時熒光定量RT-PCR鑒定，共分離到19株RV，病毒分離率為55.88%，其中成都9株(2015-906與2015-908為同一個病例，在以下的數(shù)據(jù)分析中均作為1株計算)、自貢4株、南充3株、廣安2株、內(nèi)江1株(表1)。

2.2 基因親緣性關(guān)系分析 用BioEdit7.0和MEGA6.0軟件對分離到的19株RV與32株WHO參考毒株基于E1基因739個核苷酸序列構(gòu)建基因親緣性關(guān)系樹，結(jié)果顯示，2015年四川省的19株RV與 WHO參考株(RVi-Washington.USA-16.00-2B)形成一個分支，屬于2B基因型，bootstrap值為73%(圖1)。

表1 2015年四川省19株RV相關(guān)信息表

將2015年四川省分離的RV與GenBank中下載的中國其他15個省和WHO的3株2B基因型參考株構(gòu)建基因親緣性關(guān)系樹，結(jié)果顯示，我省2015年的RV跟其他省不同年代份分離株交織在一起(圖2)。

圖1 2015年四川RV與WHO參考株E1基因739個核苷酸的親緣關(guān)系樹Fig.1 Phylogenetic tree of Sichuan RV isolates in 2015 compared to WHO reference strains based on E1 739 nucleotides

2.3 核苷酸序列分析 18株RV(2015-906與2015-908為同一個病例，在以下的數(shù)據(jù)分析中均作為1株計算)之間的核苷酸序列同源性為99%-100%，其中2015-189、190與191；630與740；865與866；906、911、1022、1023與1025的核苷酸序列完全一致。與該基因型WHO參考株(RVi-TelAviv.ISR-0.68-2B、RVi-Anhui.CHN-0.00-2-2B、RVi-Washington.USA-16.00-2B)的核苷酸序列同源性為94.8%-97.6%，比對各分離株與參考株E1基因的739個核苷酸，共有8個核苷酸位點發(fā)生整體變異，還有11個位點的變異在個別分離株零星發(fā)生的。

▲四川省2015年風疹病毒分離株；△中國部分省市2B基因型分離株；○ WHO 2B基因型參考株；● 2006年四川省首次分離到的2B基因型分離株圖2 2015年四川省RV與中國其他省份RV 2B分離株E1基因739個核苷酸親緣關(guān)系樹▲ RV strains of Sichuan in 2015;△ RV 2B strains of other provinces in China;○ RV 2B reference strains of WHO;● RV 2B strains isolated of Sichuan in 2006 2BFig.2 Phylogenetic tree of Sichuan RV isolates in 2015 compared to 2B strains of other provinces based on E1 739 nucleotides

2.4 氨基酸序列分析 18株RV之間的氨基酸同源性為97.9%-100%，與該基因型WHO參考株(RVi-TelAviv.ISR-0.68-2B、RVi-Anhui.CHN-0.00-2-2B、RVi-Washington.USA-16.00-2B)的氨基酸同源性為83.9%-95%。比對各分離株與參考株基于 E1基因 739 核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列(aa159-404)，氨基酸序列高度保守，只有少數(shù)幾個位點存在氨基酸的變異。其中2015-1024株的aa244位點 由精氨酸變異為谷氨酰胺，2015-1005株的aa257位點由亮氨酸變異為苯丙氨酸，2015-1006株的aa327位點由賴氨酸變異為精氨酸，2015-543株的aa337位點由丙氨酸變異為蘇氨酸。

3 討論

RV于1962年首次分離成功，為有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長9 762 bp，含有2個不重疊的開放讀碼框架和3種主要的結(jié)構(gòu)蛋白C、E2和El。其中E1糖蛋白基因全長1 443 bp，有3個潛在的N-型糖基化位點，具有重要的中和抗原決定簇和血凝抑制活性[6]。許文波等[7]于1999年起開展了我國RV的分子流行病學研究，初步建立了RV毒株庫和基因數(shù)據(jù)庫。

我國自1999年以來開展風疹病毒學監(jiān)測，2004年將風疹納入中國疾病監(jiān)測信息報告管理系統(tǒng)，按丙類傳染病進行管理[8]。我省雖未開展系統(tǒng)的風疹和CRS的監(jiān)測，但隨著麻疹消除的臨近，已將風疹的實驗室檢測逐步整合到麻疹監(jiān)測中去。通過連續(xù)的風疹病毒學監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，RV的流行模式在不斷地發(fā)生改變。2001-2011年，1E基因型替代1F基因型成為我國優(yōu)勢流行基因型，而2B基因型只有零星檢測到；從2011年起，2B基因型在全國逐漸蔓延，成為我國近兩年的絕對優(yōu)勢流行基因型[9-14]。我省RV的流行情況與全國類似，在06年首次分離到輸入性風疹病例2B基因型，隨后陸續(xù)分離到1E基因型，成為我省優(yōu)勢流行基因型；2013年1E和2B兩種基因型交互流行，從2014年至今只分離到2B基因型，逐漸取代1E基因型成為了我省RV的優(yōu)勢基因型。

2015年我省分離的RV之間的核苷酸同源性為99%-100%，不同地市州檢測到相同的RV，可能有來自同一傳播鏈的RV在持續(xù)傳播；而同一地區(qū)內(nèi)的分離株分處于不同的小分支內(nèi)，說明同一地區(qū)存在不同的RV傳播鏈。從我省與我國其他地區(qū)流行株的親緣關(guān)系來看，我國近幾年2B型RV呈交叉循環(huán)流行，無明顯的時間和地域差異。單從時間上看，與近年來(2011-2015年)的病毒株比較靠近，而與06、08年的病毒分離株較為疏遠，分屬于不同的小分支上。我省分離的RV之間的氨基酸同源性為97.9%-100%，氨基酸序列高度保守，只有4個位點存在氨基酸的變異，N-型糖基化位點、血凝抑制位點和中和位點均未發(fā)生改變。

據(jù)現(xiàn)有的風疹監(jiān)測數(shù)據(jù)分析，我國的風疹發(fā)病可能呈現(xiàn)7-8年的一個流行高峰[15]。2008年發(fā)病達到高峰，有可能2016年會出現(xiàn)一個流行高峰，所以做好風疹的監(jiān)控尤為重要。本研究為以后四川省RV的分子流行病學研究打下了基礎(chǔ)，通過對RV的基因特征分析，有助于了解病毒基因型的分布，追蹤病毒的來源、傳播途徑和變異情況，以及有效地評價疫苗的免疫效果。目前我省的風疹病毒學監(jiān)測還比較薄弱，需要進一步加強并擴大開展RV監(jiān)測，建立完整的RV分子流行病學基線數(shù)據(jù)，為風疹和CRS的控制提供重要的科學依據(jù)。

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Genetic characteristics of rubella virus isolated in Sichuan province in 2015

LiuLi,HeJilan,MaXiaozhen,CaoRanran,HuangYulan

SichuanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Chengdu610041,China

HuangYulan,Email: 33599886@qq.com

Objective To understand the genetic characteristics of rubella virus in Sichuan province in 2015. Methods Vero/SLAM cells were used for rubella virus isolation and culture. The 739 nucleotides of E1 gene was amplified by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and subjected to sequence and homological analysis. Results 19 strains of rubella virus were isolated and identified as genotype 2B. The homology of nucleotides and amino acids were 99%-100% and 97.9%-100%, respectively. There were no changes in the important antigenic epitopes. Conclusions The rubella virus genotype circulated in Sichuan province in 2015 was genotype 2B.

Rubella virus; Sequence analysis; Genotype

黃玉蘭，Email：33599886@qq.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.003

風疹病毒屬；序列分析；基因型

2016-04-12)