河北省風(fēng)疹病毒的分離鑒定及基因型分析

杜慧 郭玉 趙娜 朱貞 王晶輝 劉巖 張振國 許文波 李琦

風(fēng)疹是兒童時期常見的傳染病，成人也可感染，表現(xiàn)為發(fā)熱，全身性皮疹，枕下、耳后及頸部淋巴結(jié)腫大和疼痛，孕婦在妊娠早期感染風(fēng)疹病毒，可引起胎兒受感染，發(fā)生先天性風(fēng)疹綜合癥(CRS)［1］，造成發(fā)育遲滯和胎兒畸形等嚴(yán)重后果。目前發(fā)現(xiàn)有多種病毒性感染所引起的癥候群與風(fēng)疹相似，風(fēng)疹亦可產(chǎn)生非典型的臨床表現(xiàn)或亞臨床感染［2］。因此，臨床診斷風(fēng)疹并不可靠，往往需要實(shí)驗(yàn)室診斷證實(shí)，病毒分離作為可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷方法已被廣泛采用，但因風(fēng)疹病毒的細(xì)胞病變(CPE)進(jìn)展緩慢且較難分辨，目前多采用病毒分離結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法進(jìn)行鑒定。為了解河北省風(fēng)疹流行特征，并為我省風(fēng)疹控制工作提供分子流行病學(xué)的基線數(shù)據(jù)，采用病毒分離與RT-PCR相結(jié)合的方法對我省2011年發(fā)熱出疹病例咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了鑒定，并對分離到的風(fēng)疹病毒的基因特征進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 所有標(biāo)本均為采自于2011年1月至9月底疑似風(fēng)疹病例的咽拭子。標(biāo)本采集后保存在2 ml標(biāo)本運(yùn)輸液中，24 h內(nèi)冷藏運(yùn)輸?shù)绞〖壖膊☆A(yù)防控制中心(CDC)麻疹/風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離，－70℃保存?zhèn)錂z。

1.2 病毒分離 咽拭子標(biāo)本融化后取0.2 ml原液接種到長成單層的Vero/SLAM細(xì)胞上，于37℃培養(yǎng)，同時做好陰性細(xì)胞對照，每天觀察培養(yǎng)液的pH值及細(xì)胞狀態(tài)，7～10 d后將細(xì)胞培養(yǎng)管依次置于－70℃和室溫之間，待標(biāo)本融化后依上述方法盲傳三代再進(jìn)行鑒定。

1.3 風(fēng)疹病毒RNA的提取及熒光定量PCR鑒定 使用Qiagen公司的QIAanp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取標(biāo)本懸液中的病毒核酸;使用迅必達(dá)公司的麻疹和風(fēng)疹病毒核酸雙重檢測試劑盒(實(shí)時熒光PCR法)進(jìn)行熒光定量PCR的鑒定。風(fēng)疹病毒陽性者送國家麻疹實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行E1基因核苷酸序列測定和分析。

1.4 生物信息學(xué)分析 序列整理使用Sequencher 4.0.5軟件(GeneCode，Ann Arbor，Michigan，USA)，將 1107 個核苷酸片段序列截成用于分子流行病學(xué)監(jiān)測所需的739個核苷酸片段(8731nt～9469nt);多序列比對、氨基酸和核苷酸同源性分析使用BioEdit Sequence Alignment Editor software(North Carolina St.University，USA)，Version 7.0.5.1;基因親緣性關(guān)系樹使用Mega 4.0 軟件(Sudhir Kumar，Arizona State University，Arizona，USA)中的鄰接法構(gòu)建，建樹的可靠性通過1000bootstrap來評估。

2 結(jié)果

2.1 風(fēng)疹病毒的分離和鑒定 2011年截止到9月底共收集發(fā)熱出疹病例咽拭子標(biāo)本118份，在Vero/SLAM細(xì)胞上進(jìn)行病毒增殖和分離后，全部進(jìn)行了熒光定量PCR的鑒定，共分離出24株風(fēng)疹病毒陽性標(biāo)本，分布于全省8個市，其中保定7株(編號為:63、64、97、99、103、105、118)，石家莊 6 株(編號為:16、25、39、40、53、65)，廊坊 3 株(編號為:110、111、114)，承德、秦皇島、唐山各2 株(編號分別為 57、58;86、87;109、117)，滄州、張家口各1株(編號分別為77;91)。熒光定量PCR結(jié)果以下圖為例，見圖1。

圖1 麻疹、風(fēng)疹病毒核酸雙重檢測擴(kuò)增曲線

2.2 風(fēng)疹病毒基因型的確定 將24株風(fēng)疹病毒E1基因的739個核苷酸片段進(jìn)行核苷酸序列測定和分析，并與WHO風(fēng)疹病毒13個基因型的32株參考株相對應(yīng)的核苷酸片段共同構(gòu)建基因親緣關(guān)系樹［3，4］，結(jié)果顯示，分離的24株陽性毒株中有1株與WHO 2B基因型參考株(TAN-IND-00株、TS34-CH-00株和I11-IS-68株)同屬一個分支;其余23株與2株WHO 1E基因型的參考株(T14-CH-02株和M1-MAL-01株)同屬一個分支，而這些毒株又與分離于中國的參考株T14-CH-02株自成一簇，形成一個獨(dú)立的分支。因此可以確定，此23株風(fēng)疹病毒陽性株屬于1E基因型，1株風(fēng)疹病毒陽性株，即Hebei-SJZ-16屬于2B基因型。圖2所示為河北省風(fēng)疹病毒陽性分離株與WHO基因參考株基于E1基因739個核苷酸構(gòu)建的基因親緣性關(guān)系樹。

圖2 河北省風(fēng)疹病毒陽性分離株與WHO基因參考株構(gòu)建的基因親緣性關(guān)系樹

2.3 風(fēng)疹病毒株核苷酸和氨基酸變異分析 在分離到的24株風(fēng)疹病毒株中，23株1E基因型風(fēng)疹病毒之間的核苷酸同源性為98.3% ～100%，氨基酸同源性為99.5% ～100%。23株1E基因型風(fēng)疹病毒與WHO 1E基因型參考株(T14-CH-02株和M1-MAL-01株)之間核苷酸同源性分別為98.4% ～100%和96.8% ～100%，氨基酸的同源性分別為99.1% ～100%和99.1% ～100%。分離到的1株2B基因型風(fēng)疹病毒與WHO 2B基因型參考株(TAN-IND-00株、TS34-CH-00株和I11-IS-68株)之間核苷酸同源性分別97.9%、96.4%和94.8%，氨基酸的同源性分別為100%、99.5%和99.5%。

河北省風(fēng)疹病毒陽性分離株E1基因739個核苷酸中共有38個核苷酸發(fā)生變異。將24株風(fēng)疹病毒分離株E1基因739個核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列與WHO各基因型參考株E1基因739個核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)核苷酸變異為無義突變，氨基酸序列高度保守，N-型糖基化位點(diǎn)、血凝抑制位點(diǎn)和中和位點(diǎn)未發(fā)生改變，并且發(fā)現(xiàn)，1E基因型風(fēng)疹病毒E1蛋白在第338位的氨基酸發(fā)生相同的突變，均突變?yōu)镻he338。

3 討論

風(fēng)疹病原體是一種單鏈RNA病毒，有一個血清型，多個基因型。世界衛(wèi)生組(WHO)將E1基因的739個核苷酸(8731-9469nt，159-404aa)作為基因型劃分和常規(guī)分子流行病學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)靶序列，并將全球流行的風(fēng)疹病毒劃分為兩個進(jìn)化枝(Clade 1和Clade 2)，其中 Clade 1包括6個基因型(1B、1C、1D、1E、1F、1G)和4 個臨時基因型(1a、1h、1i、1j);Clade 2 包括3個基因型(2A、2B、2C)［5］。我國自2001 年發(fā)現(xiàn)1E 基因型之后，該基因型逐漸成為我國優(yōu)勢流行基因型，我國各省的風(fēng)疹爆發(fā)主要與1E基因型風(fēng)疹病毒有關(guān)［6］。然而，當(dāng)前2B基因型風(fēng)疹病毒的傳播未被阻斷，如2000年安徽省監(jiān)測到2B基因型風(fēng)疹病毒，2006年四川省報道從越南輸入2株2B基因型風(fēng)疹病毒［7］，但從流行情況看，2B基因型風(fēng)疹病毒在中國的流行為弱勢。通過河北省風(fēng)疹病毒的分析結(jié)果可以看出，2011年河北省分離到的毒株以1E基因型為主，因此我們推斷1E基因型風(fēng)疹病毒可能是河北省主要的本土流行株。河北省于2011年監(jiān)測到一株2B基因型風(fēng)疹病毒，提示我們今后應(yīng)密切關(guān)注2B基因型在河北省的流行情況。從基因親緣性關(guān)系樹中還可以看出，同一市區(qū)在同一年份內(nèi)引起風(fēng)疹流行的傳播鏈有所不同，如Hebei-BD-64與Hebei-BD-105;不同的市區(qū)之間存在著相同的病毒傳播鏈，如Hebei-TS-117與Hebei-QHD-87，提示河北省風(fēng)疹病毒流行是由1E基因型風(fēng)疹病毒的多個傳播鏈引起的，且無明顯的地理分布傾向。

朱貞等［6］發(fā)現(xiàn)我國1E基因型風(fēng)疹病毒在E1蛋白的第338位氨基酸為Phe338，而其他基因型及其他國家的1E基因型風(fēng)疹病毒E1蛋白的該位點(diǎn)的氨基酸為 Leu338，氨基酸Phe338為我國風(fēng)疹病毒E1蛋白所特有。河北省分離到的1E基因型風(fēng)疹病毒中，E1蛋白的第338位氨基酸同樣為Phe338，符合我國1E基因型的流行特征，檢測結(jié)果又進(jìn)一步驗(yàn)證了朱貞等［6］的研究結(jié)論。

2011年，河北省建立了熒光定量PCR的方法檢測風(fēng)疹病毒，該方法特異性好，靈敏度高，操作簡單安全，自動化程度高，不易污染，彌補(bǔ)了河北省只能依靠血清學(xué)檢測或臨床表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)感染風(fēng)疹病毒病例的空白。同時，河北省使用了雙重檢測試劑盒，同時檢測麻疹、風(fēng)疹兩種病毒，能夠快速的對病例進(jìn)行確定診斷，指導(dǎo)基層進(jìn)行處置，經(jīng)過近一年的實(shí)踐取得了良好的效果。

河北省首次成功分離出風(fēng)疹病毒，并確定了河北省風(fēng)疹病毒本土基因型，即以1E基因型風(fēng)疹病毒流行為主，同時存在弱勢的2B基因型風(fēng)疹病毒的流行。今后應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)監(jiān)測，從而獲得更加完整的監(jiān)測數(shù)據(jù)，指導(dǎo)河北省風(fēng)疹流行的控制工作。

1 Frey TK.Molecular biology of rubella virus.Adv Virus Res，1994，44:69-160.

2 盧錦漢，章以浩，趙鎧主編.醫(yī)學(xué)生物制品學(xué).第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1995.619.

3 WHO.Global distribution of measles and rubella genotypes-update.WER，2006，81:474-479.

4 WHO.Update of standard nomenclature for wild-type rubella virus，2007.WER，2007，82:216-222.

5 朱貞，郭學(xué)斌，崔愛利，等.中國2007-2008年風(fēng)疹流行病學(xué)和病毒基因特征分析.中國疫苗和免疫，2009，20:201-204.

6 朱貞，許文波，毛乃穎，等.2003-2007年中國風(fēng)疹病毒基因特征分析.病毒學(xué)報，2008，24:7-16.

7 何吉蘭，朱貞，孫莉，等.四川省首次分離出的風(fēng)疹野病毒的基因型分析.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34:1751-1752.