誘導(dǎo)多能干細(xì)胞研究進(jìn)展概述

李雪犁

摘 要 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cell， iPSC）由于其巨大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力迅速成為近年來全球干細(xì)胞領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)，許多國(guó)家的政府、研究機(jī)構(gòu)對(duì)其加大投入，并取得了巨大進(jìn)展。本文將對(duì)iPSC技術(shù)中體細(xì)胞的選擇、重編程誘導(dǎo)因子的篩選、介導(dǎo)載體、誘導(dǎo)效率、臨床學(xué)的應(yīng)用以及研究中存在的問題幾個(gè)方面做簡(jiǎn)要綜述。

關(guān)鍵詞 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 重編程 誘導(dǎo)效率 載體 再生醫(yī)學(xué)

中圖分類號(hào)：Q813 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2016.09.078

Summary of Research Progress on Induced Pluripotent Stem Cells

LI Xueli

（Patent Examination Cooperation Hubei Center of the Patent Office， SIPO， Wuhan， Hubei 430070）

Abstract Induced pluripotent stem cells due to its great research value and application potential quickly become in recent years the world the focus of attention in the field of cell， the government， research institutes in many countries to increase investment， and have made tremendous progress. This article will make a brief summary on the selection of somatic cells in iPSC technology， the selection of the induced factors of reprogramming， the vector， the induction efficiency， the application of clinical study and the problems in the research.

Key words induced pluripotent stem cells； reprogramming； induced efficiency； carrier； regenerative medicine

0 引言

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cell， iPSC），是將幾種因子的基因引入到成熟體細(xì)胞中，并重編程為與胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）具有相似特征的一種干細(xì)胞。①iPSC于2006年由日本京都大學(xué)山中伸彌（Yamanaka S）研究團(tuán)隊(duì)首次獲得。以此為基礎(chǔ)，Yamanaka和Thomason（美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校）研究團(tuán)隊(duì)于2007年成功獲得人類iPSC。正是iPSC與ESC在形態(tài)、基因表達(dá)及多能細(xì)胞特異基因的表觀遺傳學(xué)性狀上都表現(xiàn)出了極高的相似性，因此研究成果一經(jīng)報(bào)道便迅速引起了干細(xì)胞乃至生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。一向?qū)θ祟惻咛ジ杉?xì)胞領(lǐng)域研究持有爭(zhēng)議態(tài)度的美國(guó)政府，在該研究成果發(fā)布后的幾年中，也逐漸放開了對(duì)干細(xì)胞領(lǐng)域研究的相關(guān)政策，認(rèn)為這才是干細(xì)胞研究的正道。

iPSC技術(shù)被認(rèn)為是生命科學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一場(chǎng)革命，在其誕生的十年時(shí)間里就被廣泛研究并獲得了快速的發(fā)展。世界范圍內(nèi)許多實(shí)驗(yàn)室開始探索其相關(guān)機(jī)制及技術(shù)的改良方法，研究主要集中在體細(xì)胞和重編程因子的選擇、重編程因子介導(dǎo)載體體系的建立、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率的提升以及疾病特異性的iPSC模型的建立等方面。

1 體細(xì)胞的選擇

在體細(xì)胞選擇方面，研究發(fā)現(xiàn)，除了成纖維細(xì)胞，小鼠的肝細(xì)胞、胃細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞，以及人類的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、角化細(xì)胞、外周血細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等都可產(chǎn)生iPSC。②而有絲分裂后的神經(jīng)元和終末分化的淋巴細(xì)胞也可誘導(dǎo)形成iPSC。③由此可見，似乎所有的體細(xì)胞都具備經(jīng)過重編程而被誘導(dǎo)成為iPSC的潛能，但是不同細(xì)胞類型對(duì)產(chǎn)生iPSC的效率、誘導(dǎo)因子作用效果和獲得的iPSC的安全性具有很大的差別。④例如，人類角質(zhì)細(xì)胞比成纖維細(xì)胞重編程的效率高；小鼠胃細(xì)胞與肝細(xì)胞在激活ESC特異性Fbx15基因時(shí)，比成纖維細(xì)胞效率高，且整合的病毒少；不同類型的體細(xì)胞（小鼠尾部皮膚細(xì)胞、胃細(xì)胞以及胚胎皮膚細(xì)胞）誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPSC會(huì)導(dǎo)致小鼠體內(nèi)腫瘤出現(xiàn)概率的不同。

2 重編程因子的選擇

盡管Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4是最先發(fā)現(xiàn)的可以將成纖維細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)化為iPSC的4種重編程因子，但是隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在一定情況下，一些因子的調(diào)整或替代，同樣也能獲得良好的誘導(dǎo)效果，⑤如Oct4、Sox2、Nanog、Lin28也可以將人類成纖維細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)化為iPSC；Oct4和Sox2兩種因子就能將人臍血干細(xì)胞重編轉(zhuǎn)化為iPSC；人成纖維細(xì)胞可以內(nèi)源性表達(dá)c-Myc和Klf4，在重編程轉(zhuǎn)化過程中，沒有外源性c-Myc的參與也能成功獲得iPSC；對(duì)于內(nèi)源性高表達(dá)Sox2和c-Myc的神經(jīng)干細(xì)胞，僅用Oct4即可重編轉(zhuǎn)化為iPSC。這些研究結(jié)果說明成熟體細(xì)胞的重編程存在多個(gè)信號(hào)途徑。

3 重編程因子的介導(dǎo)載體

慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒是iPSC技術(shù)研究初始階段用于介導(dǎo)重編程因子的兩種主要載體。但隨著研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)慢病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可能會(huì)造成外援致瘤因子整合進(jìn)入細(xì)胞基因組內(nèi)，引起插入突變。病毒基因的激活已經(jīng)導(dǎo)致由iPSC分化產(chǎn)生的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了腫瘤，這一結(jié)果無疑給iPSC在臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用方面引入了不小的風(fēng)險(xiǎn)，甚至?xí)?dǎo)致不良后果。

正是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了存在載體在使用過程中、或是誘導(dǎo)基因本身會(huì)引發(fā)致瘤的問題，很多研究小組致力于尋找方法能夠產(chǎn)生非整合的iPSC來減少致瘤風(fēng)險(xiǎn)。這些方法包括腺病毒、仙臺(tái)病毒、質(zhì)粒、合成RNA、蛋白質(zhì)、piggyBac轉(zhuǎn)座子和小分子誘導(dǎo)重編程等，并且這些方法已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室水平得到實(shí)現(xiàn)。⑤⑥雖然現(xiàn)階段有關(guān)安全介導(dǎo)載體體系建立的研究還不太成熟，但相信隨著研究的逐步深入，科學(xué)家們終將會(huì)尋找到最安全、也最適合用于人類iPSC的誘導(dǎo)方法，從而將風(fēng)險(xiǎn)降到最低。

4 iPSC的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率

雖然iPSC建系可重復(fù)，但效率很低，并且在提高iPSC安全性的同時(shí)會(huì)伴隨著重編程效率的降低。因此，提高iPSC重編程效率也一直是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。雖然iPSC形成的分子機(jī)制不是十分清楚，但是研究發(fā)現(xiàn)很多因素，如細(xì)胞類型、重編程因子、載體，甚至培養(yǎng)條件和微環(huán)境都與iPSC的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率相關(guān)。④⑤如脂肪干細(xì)胞以O(shè)ct4、Sox2、c-Myc、Klf4因子重新編程的效率達(dá)到0.2%，且是相同條件下皮膚成纖維細(xì)胞的20倍；利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體誘導(dǎo)人幼年角質(zhì)形成細(xì)胞重編程的效率要達(dá)到成纖維細(xì)胞的100倍；缺氧微環(huán)境培養(yǎng)iPSC，其生成效率可提高至原來的2.5-4.2倍。

5 iPSC的應(yīng)用

iPSC對(duì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最直接的貢獻(xiàn)在于為疾病的研究提供了體外模型，如，Rashid等⑦成功利用肝病患者的皮膚細(xì)胞培育出與病人肝臟細(xì)胞高度相似細(xì)胞；來自iPSC的心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞，可以替代現(xiàn)有的方法用于毒理學(xué)試驗(yàn)，這些是其它細(xì)胞所無法比擬的。一方面，利用從病患身上產(chǎn)生的iPSC，可以簡(jiǎn)化建立疾病模型的過程，提高模型仿真性，更有利于了解該種疾病的發(fā)病機(jī)理；另一方面，iPSC可以為新藥的開發(fā)提供模型，用于測(cè)試候選藥物的療效、毒性，以及篩選新的藥物治療方法。⑧

iPSC技術(shù)為未來使用干細(xì)胞研究及治療各種疾病開辟了新的研究途徑，如何將iPSC在體外定向分化為能模擬體內(nèi)情況的功能性細(xì)胞，以及如何獲得足夠量的靶細(xì)胞用于下游的應(yīng)用將成為今后研究的重點(diǎn)。

6 iPSC研究存在的問題

雖然iPSC技術(shù)發(fā)展迅速，有著誘人的應(yīng)用前景，但對(duì)該領(lǐng)域的研究總體還處于最初的探索階段，并且在該技術(shù)發(fā)展的過程中還存在諸多的問題，這些都使得iPSC技術(shù)應(yīng)用在臨床方面還具有很長(zhǎng)的距離。

（1）iPSC與ESC有差異嗎？iPSC存在的最重要的問題之一就是它與ESC是否真正相似。雖然有部分結(jié)果顯示它們存在差異，但大部分實(shí)驗(yàn)還是表明iPSC與ESC在各方面都具有驚人的相似性。顯示兩者具有差異性的研究結(jié)果可能是由于不同實(shí)驗(yàn)室所采用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件的不同所造成的。同時(shí)，山中伸彌認(rèn)為“ESC不應(yīng)當(dāng)成為判斷iPSC特性的金標(biāo)準(zhǔn)，研究者應(yīng)更加關(guān)注iPSC自身的性質(zhì)”。

（2）iPSC產(chǎn)生的效率問題。iPSC產(chǎn)生的效率較低。這與基因?qū)氲姆绞?、整合位點(diǎn)、表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的數(shù)量和模式等多種因素有關(guān)。如：Oct-4在胃或腸內(nèi)的表達(dá)阻止了原始細(xì)胞的分化。同時(shí)，由于來源于多能干細(xì)胞的組織在移植后的存活率很低，因此iPSC在臨床應(yīng)用上也將會(huì)面臨移植后要求組織存活較長(zhǎng)時(shí)間的問題。

（3）安全問題。在iPSC技術(shù)中，用病毒作為載體可能會(huì)導(dǎo)致外援基因整合進(jìn)入細(xì)胞基因組，致使一些癌基因的激活或某些重要基因的表達(dá)受阻；并且重編程因子c-Myc和Klf4屬于致瘤因子，因此這些因素都將有可能引起基因的突變，從而產(chǎn)生具有高致瘤性的iPSC。這些問題將成為iPSC科學(xué)研究和臨床應(yīng)用的最大障礙。

（4）機(jī)制問題。幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子如何完成細(xì)胞由分化狀態(tài)逆轉(zhuǎn)為多能性狀態(tài)？如何從根本上解決致瘤性的問題？為何iPSC誘導(dǎo)效率低下，分化能力存在差異？這些問題都需要通過對(duì)體細(xì)胞重編程的分子機(jī)制、分化機(jī)制以及調(diào)控機(jī)制等進(jìn)行深入的研究來解答。

注釋

① Yamanaka S.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）：過去、現(xiàn)在和未來.朱麗華，譯.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2012.34（10）：1055-1062.

②⑧Kiskinis E，Eggan K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation，2010.120（1）：51-59.

③ Kim J， Lengner CJ， Kirak O， et al. Reprogramming of postnatal neurons into induced pluripotent stem cells by defined factors. Stem Cells，2011.29（6）：992-1000.

④ 李鑫，王加強(qiáng)，周琪.體細(xì)胞重編程研究進(jìn)展.中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2016.46（1）：4-15.

⑤ Gonzalez F， Boue S， Belmonte， JCI. Methods for making induced pluripotent stem cells： reprogramming a la carte. Nature Reviews Genetics，2011.12（4）：231-242.

⑥ Ye JK， Hong JY， Ye FS. Reprogramming rat embryonic fibroblasts into induced pluripotent stem cells using transposon vectors and their chondrogenic differentiation in vitro. Molecular Medicine Reports， 2015.11（2）：989-994.

⑦ Rashid ST， Corbineau S， Hannan N， et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest， 2010.120（9）：3127-3136.