用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場快速檢測的微流控芯片研制

苑寶龍，王曉東，楊 平，范真真，黃昱俊，陳 炯，葉嘉明,3,*

（1.寧波大學海洋學院生物與海洋科學系，浙江 寧波 315211；2.浙江清華長三角研究院，浙江 嘉興 314006；3.國家食品安全風險評估中心應(yīng)用技術(shù)合作中心，浙江 嘉興 314006）

用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場快速檢測的微流控芯片研制

苑寶龍1,2，王曉東2，楊 平2，范真真2，黃昱俊2，陳 炯1,*，葉嘉明2,3,*

（1.寧波大學海洋學院生物與海洋科學系，浙江 寧波 315211；2.浙江清華長三角研究院，浙江 嘉興 314006；3.國家食品安全風險評估中心應(yīng)用技術(shù)合作中心，浙江 嘉興 314006）

研制一種用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場快速檢測的微流控芯片。設(shè)計制作的一次性高聚物微流控芯片集成進樣、酶抑制反 應(yīng)、顯色反應(yīng)及檢測單元，結(jié)合自制的手持式光度分析檢測裝置，可以實現(xiàn)對有機磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥的現(xiàn)場、低成本、快速、準確的檢測。結(jié)果表明：通過在 芯片內(nèi)部 固定存儲生化試劑，只需一次進樣，7 min內(nèi)即可實現(xiàn)對克百威和樂果的快速檢測，最低檢出限分別為0.02、0.6 mg/L，對克百威加標回收率為95.0%～103.3%，制作的芯片在1 個月內(nèi)的穩(wěn)定性較好。使用微流控農(nóng)藥殘留快速檢測芯片系統(tǒng)，有望實現(xiàn)全自動檢測流程，特別適合于基層非專業(yè)人員開展現(xiàn)場、快速、高通量的農(nóng)藥殘留篩查。

微流控芯片；農(nóng)藥殘留；快速檢測；低成本

農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用，它的使用可以有效保障或提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。當前我國的農(nóng)藥生產(chǎn)量和使用量均排名世界前列，其中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥使用量占到了農(nóng)藥總量的70%[1]，而且多使用于果蔬作物上。隨著農(nóng)藥使用量的逐漸擴大及其降解處理的不完善，上述兩類農(nóng)藥在蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品中的殘留超標現(xiàn)象嚴重[2-4]。因此，為了確保廣大人民群眾的農(nóng)產(chǎn)品食用安全，采取有效的檢測手段對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全進行快速監(jiān)測顯得尤為重要。

目前，用于農(nóng)藥殘留的檢測方法主要包括兩大類：一類是以色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-7]為代表的精密儀器分析方法；另一類是快速檢測方法，主要包括活體生物檢測法[8-10]、免疫法[11-13]、酶抑制法[14-16]、生物傳感器法[17-19]等。其中，精密儀器分析方法具有高靈敏度、高選擇性，可精確定量分析的優(yōu)點，并可同時檢測多種農(nóng)藥。但是該方法的儀器設(shè)備龐大，檢測成本高，耗時長，前處理繁瑣，需要專業(yè)人員操作，難以實現(xiàn)大批量樣品的現(xiàn)場快速篩查需求?？焖贆z測方法由于便攜、快速、簡單易用、低成本等顯著優(yōu)點成為近年來研究的熱點。其中，酶抑制法基于比色法原理[20]，利用農(nóng)藥靶標酶——乙酰膽堿酯酶（AChE）活性受抑制的程度，對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行半定量檢測，操作簡易，無需昂貴的儀器，尤其適用于保存時間相對較短的蔬菜、水果類鮮食農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)殘現(xiàn)場、快速檢測。因此該方法作為最常用的農(nóng)殘速測手段被廣泛接受?，F(xiàn)行的國家標準——蔬菜中有機磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測[21]，主要包括農(nóng)殘速測儀法和比色速測卡法，方法學上已能滿足大量農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)殘初篩的需求，但是仍存在諸多不足之處，例如配件繁多，攜帶不便；操作繁瑣，過程冗長；準確率、靈敏度、重復性還有待提高；此外還需要專業(yè)人員操作。

微流控芯片又稱為芯片實驗室，是把生物、化學實驗室分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等操作單元微縮、集成到一張幾平方厘米的芯片上，通過對微通道網(wǎng)絡(luò)內(nèi)流體的操縱和控制，自動完成分析過程。與傳統(tǒng)的分析方法比較，微流控芯片分析技術(shù)具有微型化、集成化、高通量、低成本的顯著優(yōu)點，因此在食品安全快速檢測[22-24]、環(huán)境監(jiān)測[25-27]、醫(yī)療診斷[28-30]等領(lǐng)域，具有重大的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究價值。

本實驗提出了一種用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場快速檢測的微流控芯片，旨在使用一次性的高聚物芯片，配合自行研制的手持式檢測儀，基于酶抑制原理結(jié)合光度分析方法，實現(xiàn)對有機磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥的現(xiàn)場、低成本、快速、準確的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小白菜 市購。

光學級聚甲基丙烯酸甲酯（p o l y m e t h y l methacrylate，PMMA）板材，0.3 mm、2.0 mm兩種厚度規(guī)格；光學級雙面膠，0.1 mm厚度；以上材料購自上海佰芯生物科技有限公司。

乙酰膽堿酯酶（EC 3.1.1.7，來自電鰻，217 U/mg）、碘化硫代乙酰膽堿、5,5-二硫二硝基苯甲酸 美國Sigma公司；克百威、樂果標準物 上海市農(nóng)藥研究所；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和碳酸氫納均為分析純。

pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液：分別稱取11.9 g無水磷酸氫二鉀與3.2 g磷酸二氫鉀，去離子水定溶于1 000 mL容量瓶。顯色劑：分別稱取160.0 mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6 mg碳酸氫納，用20 mL緩沖溶液溶解。底物：稱取25.0 mg硫代乙酰膽堿，加3.0 mL蒸餾水溶解。乙酰膽堿酯酶液：根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，DA0值應(yīng)控制在0.3以上[21]；農(nóng)藥標準液：準確稱量0.1 mg農(nóng)藥標準品，加入10 mL丙酮（分析純，99.5%）溶解配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的母液。使用時，根據(jù)需要用磷酸鹽緩沖溶液稀釋成不同質(zhì)量濃度的標準液體。

1.2 儀器與設(shè)備

YoungLaser-V12型二氧化碳激光芯片雕刻機（激光波長10.6 μm，連續(xù)激光輸出功率12 W，最細刻蝕寬度60 μm） 蘇州揚清芯片科技有限公司；DW系列超低溫保存箱（-86 ℃） 海爾生物醫(yī)療公司；Scientz-系列N型真空冷凍干燥機 寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器制造有限公司；FA1604電子天平 上海精科實業(yè)有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)（18 MΩ） 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 芯片的設(shè)計與制作

圖1 農(nóng)殘檢測微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖（A）和實物照片（B）Fig.1 Schematic presentation of the microfluidic chip for detection of pesticides (A) and photograph (B)

如圖1所示，本實驗所設(shè)計的微流控芯片由三層PMMA基片組成，頂層和底層為厚度0.3 mm的空白基片，中間層為厚度2 mm的通道層。其中2 個反應(yīng)池的體積均為115 μL，流體通道橫截面為矩形，其寬度和深度分別為1 mm和0.5 mm，進樣通道和連接通道的長度和體積分別均為20 mm和10 μL。芯片的制作過程如下：首先，用Corel DRAW軟件設(shè)計芯片各層的結(jié)構(gòu)圖案；其次，通過二氧化碳激光雕刻機直接在PMMA基材上雕刻反應(yīng)池和微通道，同時切割獲得空白蓋板和底板；最后，用雙面膠將空白蓋板、刻有通道圖案的基片、空白底板逐層鍵合，制得一次性的農(nóng)殘快速檢測芯片。

1.3.2 試劑的預存儲

芯片鍵合前，在圖1所示芯片的酶抑制反應(yīng)池中加入5 μL酶溶液，在顯色反應(yīng)與檢測池中依次加入5 μL顯色劑和5 μL底物溶液，超低溫冰箱-80 ℃預凍20 min后，置于真空冷凍干燥機內(nèi)冷凍干燥。

1.3.3 流體的操控

為了精確進樣，需要制作了用于芯片內(nèi)部微流體操控的微柱塞泵，其基本結(jié)構(gòu)包括微型步進電機和與之匹配的微型氣缸。如圖2所示，使用時將氣缸導管與芯片的微泵接口連接，步進電機控制氣缸內(nèi)活塞保證從芯片外部提取定量的待測液體至酶抑制反應(yīng)池（步驟1）；并且，也能夠進一步精密操控液體轉(zhuǎn)移至顯色反應(yīng)與檢測池（步驟2）。

圖2 進樣及液體在芯片內(nèi)各反應(yīng)池之間的轉(zhuǎn)移Fig.2 Solution aspiration and transportation in microchip

1.3.4 實驗室自制手持式檢測裝置

為配合集成生化反應(yīng)的微流控芯片進行農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場快速檢測，本實驗搭建了一套手持式便攜檢測裝置（圖3），其基本組成包括光電檢測、流體控制、溫度控制和數(shù)據(jù)處理等模塊。

圖3 手持式便攜檢測裝置外觀（A）及模塊組成示意圖（B）Fig.3 Schematic illustration of portable detection device appearance (A) and composition diagram (B)

1.3.5 酶活性的檢測

參考Ellman等[31]的方法。吸取125 μL磷酸緩沖液至芯片酶抑制反應(yīng)池，與預存儲酶混合溶解，37 ℃恒溫一段時間后進入顯色反應(yīng)與檢測池進行顯色反應(yīng)，記錄反應(yīng)初始時與反應(yīng)3 min時溶液在410 nm波長處吸光度的差值DA，作為酶活性。以最佳條件下的酶活力為100%，其余條件下同樣蛋白量的預存儲酶與最佳條件下的酶活力之比，記為相對酶活力。

1.3.6 農(nóng)殘速測芯片的驗證

取農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中較常用到的有機磷類農(nóng)藥樂果與氨基甲酸酯類農(nóng)藥克百威，分別配制一系列質(zhì)量濃度梯度標準液，吸取125 μL上述標準液加入芯片，在37 ℃恒溫條件下，農(nóng)藥標準液在酶抑制反應(yīng)池中與預存儲酶試劑發(fā)生酶抑制反應(yīng)適當時間，反應(yīng)液隨后進入顯色反應(yīng)與檢測池進行顯色反應(yīng)，記錄反應(yīng)初始時與反應(yīng)3 min時溶液在410 nm波長處吸光度的差值DA，按照酶抑制率公式計算各農(nóng)藥標液的酶抑制率[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計及封裝

根據(jù)酶抑制率法快速檢測農(nóng)殘的原理，在芯片上設(shè)計了2 級串聯(lián)反應(yīng)池，其中酶抑制反應(yīng)池底部固定酶，顯色反應(yīng)與檢測池底部固定底物和顯色劑，反應(yīng)池間用蛇形通道連接。檢測時待測液首先進入酶抑制反應(yīng)池，在37 ℃恒溫條件下農(nóng)藥組分與酶發(fā)生酶抑制反應(yīng)，隨后混合液進入顯色反應(yīng)與檢測池發(fā)生水解反應(yīng)并顯色。檢測池的厚度，即光程對光學檢測結(jié)果的精度有較大的影響[32]，根據(jù)朗姆比爾定律，光程變長，靈敏度提高，檢出限變低，但同時會增加芯片的厚度導致物料成本上升。綜合考慮芯片物料成本、檢測試劑消耗量及檢測精度需求，本實驗選擇厚度為2 mm的PMMA板材制作微結(jié)構(gòu)，2 個反應(yīng)池的體積均為115 μL。

目前PMMA微流控芯片的封裝技術(shù)多采用熱壓鍵合法[33]，考慮到高溫條件下芯片內(nèi)部固定化的酶試劑極易失活，本實驗采用雙面膠貼合法，在室溫條件下實現(xiàn)芯片的快速鍵合。

2.2 酶試劑存儲條件的確定

真空冷凍干燥目的是將生物材料制品凍干后保持其活性，適合長期保存，方便運輸，而且能快速復活利用[34]，該技術(shù)可以很好地滿足酶在芯片內(nèi)部存儲的兩個條件：預存儲的酶在水溶液中能夠迅速溶解釋放，具有較高的反應(yīng)活性；酶與芯片基材具有足夠的結(jié)合強度，以免芯片在使用過程中試劑脫落。在反應(yīng)池加入5 μL酶液，-80 ℃預凍20 min后，在冷阱溫度-80 ℃、真空度3 Pa的條件下制備獲得固定于芯片的酶粉，著重考察冷凍干燥時間對酶活的影響。分別將預凍后的酶試劑真空冷凍干燥0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 h，按照1.3.4節(jié)步驟測酶活性。如圖4所示，冷凍干燥2 h的相對酶活力最高，隨后酶活逐漸降低，其原因可能是隨著冷凍時間的延長，蛋白質(zhì)分子表面的單層水分子被凍結(jié)，蛋白質(zhì)表面的氫鍵以及極性基團暴露在周圍環(huán)境中導致蛋白質(zhì)的變性失活[35]。因此本實驗選擇2 h作為最佳真空冷凍干燥時間，在此條件下酶試劑與芯片基材的結(jié)合強度完全能夠滿足實驗要求。

圖4 真空冷凍干燥時間對酶活性的影響Fig.4 Effect of vacuum freeze-drying time on enzymatic activity

2.3 微泵的穩(wěn)定性測試

精確、穩(wěn)定的流體控制是微流控分析重復性的前提保證。為了精確進樣，本實驗制作了基于步進電機耦合微型氣缸的微柱塞泵，進樣體積為0～200 μL，流速為0～20 μL/s?？紤]到過快的液體流速會在反應(yīng)腔室引入氣泡，實驗選取微泵的流速為10 μL/s，在該流速條件下往復抽取125 μL磷酸緩沖液，用天平稱量每次泵取液體的質(zhì)量，重復6 次的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為3.9%，說明自制的微型計量泵能夠滿足微流控農(nóng)殘檢測的要求。

2.4 光學檢測器的穩(wěn)定性

配制0.04 g/L鉻酸鉀溶液，加入芯片檢測池后放入光學檢測裝置中[36]，每30 min測量波長410 nm處鉻酸鉀溶液吸光度，RSD（n=6）為0.8%，說明自制的光學檢測裝置能基本滿足實驗檢測的要求。

2.5 芯片中酶抑制反應(yīng)時間的確定

常規(guī)條件下，酶抑制反應(yīng)溶液需在37 ℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)10～15 min。針對本實驗芯片中的微反應(yīng)體系，將質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的克百威標準液加入預恒溫37 ℃的芯片中，考察反應(yīng)時間對農(nóng)殘抑制率的影響。如圖5所示，當反應(yīng)時間超過4 min后，農(nóng)殘抑制率達到一穩(wěn)定平臺?？紤]到快速檢測需求，本實驗采用4 min作為芯片中酶抑制反應(yīng)時間。

圖5 芯片中酶抑制反應(yīng)時間對農(nóng)殘抑制率的影響Fig.5 Effect of reaction time in the chip on inhibition of enzymatic activity

2.6 農(nóng)藥標樣檢測及檢出限

分別配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5 mg/L的克百威農(nóng)藥標準溶液，0.2、0.5、1、2、5、10、20 mg/L的樂果農(nóng)藥標準溶液，按1.3.5節(jié)步驟進行檢測，結(jié)果如圖6所示。通過將抑制率與農(nóng)藥質(zhì)量濃度的標準曲線用Origin軟件擬合，可以計算出每種農(nóng)藥抑制AChE活性50%所對應(yīng)的質(zhì)量濃度，即為本方法對該農(nóng)藥的檢出限。對于克百威和樂果，國標速測儀方法檢出限為0.05 mg/L和3 mg/L[21]，本方法檢出限分別為0.02 mg/L和0.6 mg/L，因此本實驗所制備農(nóng)藥殘留檢測芯片的檢出限優(yōu)于現(xiàn)有國標速測儀檢出限標準，具有很強的實用價值。

圖6 克百威（A）和樂果（B）農(nóng)藥標樣檢測結(jié)果Fig.6 Analytical results of carbofuran (A) and cygon (B)

2.7 回收率測定實驗結(jié)果

為考察方法的可靠性，進行了回收率實驗。以未噴灑農(nóng)藥的小白菜為例，按國標法操作提取待測液，向提取液中加入定量的0.02 mg/L克百威農(nóng)藥。回收率實驗測定了5 組樣品，每組測定6 次，測得農(nóng)藥的回收率在95.0%～103.3%之間，結(jié)果見表1。

表1 加標檢測結(jié)果Table 1 Recoveries from spiked sample

2.8 芯片的穩(wěn)定性實驗結(jié)果

將制備的農(nóng)藥殘留檢測芯片分別在4 ℃和25 ℃密封存放，30 d后測得相對酶活力分別為95.4%、81.5%。由此可以看出，本實驗所制備的農(nóng)殘檢測芯片比較穩(wěn)定。

2.9 方法對比

為了驗證方法的可靠性，取同一噴灑農(nóng)藥的小白菜樣品（樂果、克百威為例），按國標提取待測液后，選用某知名國產(chǎn)農(nóng)殘速測儀與本實驗的微流控芯片快速檢測方法對比，二者綜合特性比較見表2、3。

表2 本實驗和農(nóng)殘速測儀方法對比Table 2 Comparison of the developed method with rapid pesticideresidue analyzer

表3 本實驗和農(nóng)殘速測儀檢測結(jié)果對比Table 3 Comparison of analytical results obtained for cabbage sampleusing the developed method and rapid pesticide residue analyzer

從表3可以看出，對比傳統(tǒng)的農(nóng)殘速測方法，本實驗提出的微流控芯片直接將農(nóng)藥殘留檢測試劑預存儲于芯片內(nèi)部，無需現(xiàn)場配制溶液；檢測時間由20 min縮短為7 min；樣本及試劑消耗量降至常規(guī)檢測的1/20；操作簡便，檢測精度、重復性與準確性能夠滿足農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場快速檢測需求。

3 結(jié) 論

本實驗提出了一種用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場快速檢測的微流控芯片制備方法。旨在使用一次性的高聚物芯片，配合自行研制的手持式檢測儀，基于酶抑制原理結(jié)合光度分析方法，實現(xiàn)對有機磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥的現(xiàn)場、低成本、快速、準確的檢測。相對于現(xiàn)有的農(nóng)殘速測儀和速測卡，本實驗研制的微流控芯片檢測方法優(yōu)點包括：1）試劑、樣品消耗量??；2）試劑存儲于芯片中，降低人工配制及移取溶液試劑所帶來的誤差；3）可在芯片內(nèi)部實現(xiàn)自動進樣、生化反應(yīng)及檢測，最大程度地減少人工操作步驟；4）溶液反應(yīng)體系封閉，進一步提高反應(yīng)均一性和檢測準確度；5）使用高聚物為芯片基材，芯片成本低、易批量化生產(chǎn)，適合一次性農(nóng)藥殘留檢測需求。此外，將本實驗研制的微流控芯片進一步結(jié)合手持式檢測儀，以及便攜式農(nóng)殘快速提取儀，可實現(xiàn)全自動檢測流程，特別適合于基層非專業(yè)人員開展現(xiàn)場、快速、高通量的農(nóng)藥殘留篩查。

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Fabrication and Analytical Application of Microfludic Chip for Rapid On-Site Detection of Pesticide Residues

YUAN Baolong1,2, WANG Xiaodong2, YANG Ping2, FANG Zhenzhen2, HUANG Yujun2, CHEN Jiong1,*, YE Jiaming2,3,*
(1. Department of Biology and Marine Science, School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University, Jiaxing 314006, China; 3. China National Center for Food Safety Risk Assessment Cooperation Center for Application Technology, Jiaxing 314006, China)

A novel disposable microfludic chip was developed for rapid detection of pesticide residues in agricultural products, which integrated sampling, enzyme inhibition reaction, color development and detection chamber. By coupling with a laboratory-prepared colorimetric detection device, the chip could provide a simple, easy to use, low-cost and sensitive approach for rapid detection of organophosphate and carbamate pesticides on site. Due to pre-storage of biochemical reagents in the chip, the detection could be achiev ed within 7 min by just one injection. The limits of detection (LOD) of the method were 0.02 mg/L for carbofuran and 0.6 mg/L for dimethoate, the recoveries of carbofuran from spiked samples were in the range of 95.0% to 103.3%. Furthermore, this microfludic chip had a long storage life of up to 30 days. The microfluidic chip coupled with laboratory-prepared detection device is expected to achieve an automatic detection process, and is particularly suitable for on-site, rapid, and high-throughput screening of pesticide res idues by non-professionals.

microfludic chip; pesticide residues; rapid detection; low cost

10.7506/spkx1002-6630-201602035

TS207.3；S481.8

A

1002-6630（2016）02-0198-06

苑寶龍, 王曉東, 楊平, 等. 用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場快速檢測的微流控芯片研制[J]. 食品科學, 2016, 37(2): 198-203. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602035. http://www.spkx.net.cn

YUAN Baolong, WANG Xiaodong, YANG Ping, et al. Fabrication and analytical application of microfludic chip for rapid on-site detection of pesticide residues[J]. Food Science, 2016, 37(2): 198-203. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602035. http://www.spkx.net.cn

2015-03-11

嘉興市公益性應(yīng)用技術(shù)研究計劃項目（2014AY21024）

苑寶龍（1976—），男，碩士，主要從事微流控芯片以及食品安全檢測研究。E-mail：yuanbaolong@hotmail.com

*通信作者：陳炯（1975—），男，研究員，博士，主要從事動物細胞因子及細胞免疫調(diào)控研究。E-mail：jchen1975@163.com

葉嘉明（1979—），男，高級工程師，博士，主要從事微流控分析芯片研發(fā)及其在生物醫(yī)學快速檢測研究。

E-mail：yejiaming723@126.com