響應(yīng)面法優(yōu)化半枝蓮黃酮提取工藝及體外抗氧化性分析

陳紅梅，謝 翎

（安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 安慶 246011）

響應(yīng)面法優(yōu)化半枝蓮黃酮提取工藝及體外抗氧化性分析

陳紅梅，謝 翎*

（安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 安慶 246011）

研究半枝蓮黃酮的提取工藝及其抗氧化活性。以黃酮得率為指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken設(shè)計四因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗，建立各因素與響應(yīng)值之間的數(shù)學(xué)模型，確定最佳提取工藝。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、液料比40∶1（mL/g）、超聲時間80 min、超聲功率220 W，在此工藝條件下，半枝蓮黃酮得率為11.53%。通過對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、羥自由基清除率及還原力測定，表明半枝蓮黃酮提取物具有一定的抗氧化活性。

半枝蓮；黃酮；響應(yīng)面法；抗氧化

半枝蓮（Soutellaria barbata D. Don）別名并頭草、牙刷草、窄葉韓信草等，為唇形科黃芩屬草本植物。半枝蓮全草可入藥，具有清熱解毒、活血散瘀、利尿消腫、止痛抗癌等功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明常用于治療各種感染，單方或復(fù)方治療肺癌、胃癌、肝癌等疾病[1]。在我國有廣泛的種植面積。半枝蓮中含有多種化學(xué)成分，主要含有生物堿、類黃酮、甾體化合物等，其中類黃酮物質(zhì)含量最高[2-4]，為植物生長過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物[5]，具有抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、降血脂、延緩衰老等作用[6-7]，是一種天然的抗氧化劑[8]，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化妝品行業(yè)。

超聲波機(jī)械熱振動的傳播過程中有助于植物有效成分的溶出和擴(kuò)散，空穴作用可能以將能量全部釋放，產(chǎn)生瞬時的高溫和高壓促使細(xì)胞壁破解，使得內(nèi)含物直接溶出與溶劑充分接觸，增加提取物的得率[9]。超聲波輔助提取法已廣泛應(yīng)用于植物次生代謝物質(zhì)的提取[10-13]。響應(yīng)面法可以通過回歸方程和直觀圖形分析，高效地對實驗進(jìn)行研究[14]。采用超聲波輔助提取的方法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時間、功率對黃酮得率的影響，結(jié)合響應(yīng)面法對黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。另外，對半枝蓮黃酮提取物抗氧化清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基及羥自由基能力及其還原力進(jìn)行測定，評價其抗氧化活性，為半枝蓮黃酮資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

半枝蓮購于安慶市安慶大藥房，置于60 ℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎后過50 目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院；DPPH美國Sigma公司；無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、甲醇、硫酸鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、雙氧水等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV759型紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；FA2004A型電子天平 上海精天電子儀器有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海洪旋實驗儀器有限公司；SY-360型臺式數(shù)控超聲波提取機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；FW-100高速粉碎機(jī) 上海楚定分析儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取烘干至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用70%乙醇溶液溶解，并定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精準(zhǔn)吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液補(bǔ)充至10 mL，再依此加入5%的亞硝酸鈉溶液1.5 mL，混勻，放置6 min，再加入10%的硝酸鋁溶液2 mL，搖勻，放置6 min，加入4%的氫氧化鈉溶液2 mL，用70%乙醇溶液定容，搖勻，放置15 min，置于510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.192 3C-0.202 3，R2=0.998 5。

1.3.2 黃酮提取工藝及含量測定

準(zhǔn)確稱取半枝蓮粉末10.0 g，放入磨口三角燒瓶中，加入乙醇溶液，超聲波輔助提取，過濾，石油醚脫色處理后，所得濾渣用70%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，作為待測液，按1.3.1節(jié)進(jìn)行操作，測定黃酮含量。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

準(zhǔn)確稱取烘干至質(zhì)量恒定的半枝蓮粉末10.0 g，按液料比20∶1的比例分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，在超聲功率200 W的條件下，提取55 min，測定不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下半枝蓮黃酮得率。

1.3.3.2 液料比的選擇

稱取烘干至質(zhì)量恒定的半枝蓮粉末10.0 g，分別按液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，在超聲功率200 W條件下，提取55 min，測定不同液料比條件下半枝蓮黃酮得率。

1.3.3.3 超聲時間的選擇

稱取烘干至質(zhì)量恒定的半枝蓮粉末10.0 g，按液料比20∶1的比例加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，在超聲功率200 W的條件下，分別提取45、55、65、75、85、95、105 min，測定不同超聲時間條件下半枝蓮黃酮得率。

1.3.3.4 超聲功率的選擇

稱取烘干至質(zhì)量恒定的半枝蓮粉末10.0 g，按液料比20∶1的比例加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，分別在超聲功率150、200、250、300、350、400、450 W的條件下，提取55 min，測定不同超聲功率條件下半枝蓮黃酮得率。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，以黃酮得率為響應(yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時間、超聲功率為因變量，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面分析試驗，中心試驗重復(fù)5 次，共29 個試驗點(diǎn)，試驗因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface experiments

1.3.5 黃酮體外抗氧化性實驗

1.3.5.1 DPPH自由基清除率測定[15-16]

配制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，取2.0 mL樣品溶液，加入2.5 mL 0.1 mmol/L的DPPH甲醇溶液，充分混勻，在室溫條件下反應(yīng)2 h，置于517 nm波長處測定吸光度，以未加入樣品的DPPH甲醇溶液作空白參比，同時以VC和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）作陽性對照。DPPH自由基的清除率按公式（1）計算。

式中：A0為空白對照吸光度；A1為樣品溶液吸光度。

1.3.5.2 還原力的測定[17-18]

配制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，取1.5 mL樣品溶液，加入1.5 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液和1.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，充分混勻，置于50 ℃恒溫水浴鍋中保溫25 min，冷卻后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，充分振蕩，于4 500 r/min條件下離心10 min。取其上清液1 mL再加入1 mL 0.1% FeCl3溶液和2 mL蒸餾水，充分混勻，靜置10 min，置于700 nm波長處測定其吸光度，以蒸餾水作空白參比。同時以VC作陽性對照。

1.3.5.3 羥自由基清除率[19-20]

配制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，取1.5 mL樣品溶液，分別加入1.0 mL 2.5 mmol/L的水楊酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液和2.0 mL蒸餾水，充分混勻，加入1.0 mL 5 mmol/L的H2O2，置于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，再置于510 nm波長處測定其吸光度，以蒸餾水作空白參比，同時以VC作陽性對照。羥自由基的清除率按公式（2）計算。

式中：A0為空白對照吸光度；A2為樣品溶液吸光度（加H2O2）；A1為樣品溶液吸光度（不加H2O2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on flavonoid yield

如圖1所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃酮得率也增加。乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時，黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而下降。這可能是因為當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時，黃酮類物質(zhì)溶出趨于飽和，而同時隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步升高，其他醇溶性物質(zhì)溶出也增多，從而使得黃酮得率反而下降。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選用70%為宜。

2.1.2 液料比對黃酮得率的影響

圖2 液料比對黃酮得率的影響Fig.2 Effects of liquid-to-solid ratio on flavonoid yield

如圖2所示，隨著提取溶劑用量的增加，黃酮得率也隨之呈增長趨勢，當(dāng)液料比達(dá)到50∶1（mL/g）時，此時若繼續(xù)增加溶劑的用量，黃酮得率反而呈緩慢下降趨勢，這可能是因為液料比達(dá)到50∶1（mL/g）時，黃酮類物質(zhì)已基本溶出，繼續(xù)增加溶劑用量反而會促使其他雜質(zhì)的溶出，使得黃酮得率下降?？紤]到節(jié)約成本和后續(xù)回收操作，確定液料比為40∶1（mL/g）比較合適。

2.1.3 超聲時間對黃酮得率的影響

圖3 超聲時間對黃酮得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on flavonoid yield

由圖3可知，隨著超聲提取時間的延長，黃酮得率呈上升趨勢，但當(dāng)超聲提取時間達(dá)到85 min后，此時繼續(xù)延長超聲提取時間，黃酮得率略呈緩慢下降趨勢。分析原因，可能在于當(dāng)超聲時間達(dá)到85 min，黃酮類物質(zhì)已大部分溶出，繼續(xù)延長超聲時間，有可能使黃酮類物質(zhì)發(fā)生降解或也伴隨著其他雜質(zhì)的溶出。因此，選擇超聲時間為85 min為宜。

2.1.4 超聲功率對黃酮得率的影響

圖4 超聲功率對黃酮得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on flavonoid yield

由圖4可知，當(dāng)超聲功率在150～300 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增加，黃酮得率也不斷增加，但當(dāng)超聲功率達(dá)到300 W后，此時繼續(xù)增加超聲功率，黃酮得率反而呈下降趨勢。這可能是因為超聲功率較高時，使得溶液溫度也較高，導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)穩(wěn)定性下降，部分被氧化，得率降低。因此，超聲功率選為300 W較合適。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

利用Design-Expert 8.0軟件的Box-Behnken設(shè)計，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時間和超聲功率為響應(yīng)變量，黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗，結(jié)果如表2所示，對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，建立提取工藝參數(shù)回歸模型?；貧w方程為：

表2 Box-Behnken試驗方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

由表3可知，二次回歸模型的F值為1 0.9 9，P＜0.000 1，表明模型達(dá)到了極顯著水平；失擬項是模型中數(shù)據(jù)的變異，失擬項P=0.253 3＞0.05，說明失擬項差異不顯著，試驗無失擬因素存在，能充分反映實際情況，回歸模型是適合的；試驗?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2=0.916 6，說明黃酮得率的結(jié)果與模型預(yù)測結(jié)果有著良好的一致性，試驗?zāi)Ｐ偷男Ｕ禂?shù)R2Adj=0.833 2，試驗結(jié)果有83.32%受試驗因素的影響。因此，結(jié)果可靠，此模型可以對黃酮得率結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。回歸方程各項方差分析中F檢驗可以判斷自變量對因變量的影響，由此得到各因素對黃酮得率影響的主次順序為B＞C＞D＞A，即液料比對黃酮得率的影響最大，其次是超聲時間和超聲功率，最后是乙醇體積分?jǐn)?shù)。由回歸方程和方差分析還可知，模型中一次項B、C、D對黃酮得率的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；模型中交互項BD對黃酮得率的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），CD對黃酮得率的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；模型中二次項A2、B2、C2、D2對黃酮得率的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

2.3 響應(yīng)面分析

通過Box-Behnken試驗得到的多元二次回歸模型所作的響應(yīng)面圖，響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各試驗因素A、B、C、D所構(gòu)成的三維空間的曲面圖。在其他試驗因素固定不變的情況下，考察交互項對得率的影響，響應(yīng)面分析圖可用于評價試驗因素對黃酮得率影響的兩兩交互作用[21-22]。各因素交互作用對響應(yīng)值的影響如圖5所示。響應(yīng)面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對于操作條件的改變越敏感，該因素對黃酮得率的影響越大；反之則表明因素對黃酮得率的影響越小[23-24]。在交互項對得率的影響中，液料比與超聲功率和超聲時間與超聲功率之間交互作用明顯，其他因素之間交互作用不明顯，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對對黃酮得率的影響Fig.5 Response surface graphs showing the effect of extraction conditions on the yield of flavonoid

利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，得到預(yù)測的黃酮提取的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75.23%、液料比42.31∶1（mL/g）、超聲時間82.56 min、超聲功率222.95 W，此時黃酮的得率最高，達(dá)到11.66%。但為了驗證模型的有效性，考慮到實際情況將最佳工藝條件修改為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、液料比40∶1（mL/g）、超聲時間80 min、超聲功率220 W，在此工藝條件下，黃酮得率為11.53%，與預(yù)測值總體吻合，說明模型能較好預(yù)測半枝蓮中黃酮得率，優(yōu)化工藝條件較可靠。

2.4 黃酮抗氧化活性測定結(jié)果

2.4.1 半枝蓮黃酮提取物清除DPPH自由基效果

圖6 半枝蓮黃酮提取液對DPPH自由基的清除效果Fig.6 DPPH free radical scavenging capacity of flavonoid from Soutellaria barbata

由圖6可知，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著黃酮提取液、對照品VC和BHT質(zhì)量濃度的增加，三者對DPPH自由基的清除率均在增加。當(dāng)質(zhì)量濃度比較低時，黃酮提取液對DPPH自由基的清除率低于對照品VC和BHT；當(dāng)黃酮提取液質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 mg/mL后，它對DPPH自由基的清除率略高于BHT，而當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL時，黃酮提取液對DPPH自由基的清除率與對照品VC對DPPH自由基的清除率相當(dāng)。

2.4.2 半枝蓮黃酮提取物的還原力

吸光度的變化可以反映出樣品還原力的高低，吸光度越大，則樣品的還原力越強(qiáng)[25]。由圖7可知，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，半枝蓮黃酮提取物的還原力隨著質(zhì)量濃度的升高也在不斷增強(qiáng)。在質(zhì)量濃度較低時，黃酮提取液的還原力也較低，當(dāng)黃酮提取液質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/mL時，隨著質(zhì)量濃度的升高，還原力也呈大幅增長趨勢，甚至接近于對照品VC的還原力。但整體來說，半枝蓮黃酮提取液的還原力低于對照品VC的還原力。

圖7 半枝蓮黃酮提取液的還原力Fig.7 Total reducing power of flav onoid from Soutellaria barbata

2.4.3 半枝蓮黃酮提取物清除羥自由基效果

圖8 半枝蓮黃酮提取液對羥自由基的清除效果Fig.8 Hydroxyl free radical scavenging capacity of flavonoid from Soutellaria barbata

由圖8可知，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著黃酮提取液和對照品VC質(zhì)量濃度的增加，二者對羥自由基的清除率均在增加。在質(zhì)量濃度較低時，半枝蓮黃酮提取液清除羥自由基的效果遠(yuǎn)差于VC，但當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL時，半枝蓮黃酮提取液對羥自由基的清除能力大幅增強(qiáng)，只略低于VC的清除能力。

3 結(jié) 論

以半枝蓮為原料，通過有機(jī)溶劑提取法從中提取出黃酮，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲溫度和液料比進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計，使用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，得到最佳工藝提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、液料比40∶1（mL/g）、超聲時間80 min、超聲功率220 W，在此工藝條件下，黃酮得率為11.53%?？寡趸匝芯勘砻?，黃酮提取物具有較強(qiáng)的還原力，對DPPH自由基和羥自由基均具有一定的清除能力，可以作為抗氧化劑的新型來源。

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Optimization of Extraction Process for Flavonoid from Soutellaria barbata by Response Surface Methodology and Evaluation of Its Antioxidant Activity

CHEN Hongmei, XIE Ling*
(School of Life Science, Anqing Normal University, Anqing 246011, China)

Flavonoid with antioxidant activity was extracted from Soutellaria barbata based on single factor experiments. A Box-Behnken design involving four factors at three levels each was used to determine the optimum extraction conditions using fl avonoid yield as the response. The optimal extraction conditions were obtained as follows: extraction solvent, 75% ethanol; liquid to material ratio, 40:1 (mL/g); extraction time, 80 min; and ultrasonic power, 220 W. Under the optimized conditions, the yield of fl avonoid was 11.53%. The antioxidant activity was evaluated based on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacity, hydroxyl free radical scavenging capacity and reducing power. The results showed that the fl avonoid from S. barbata had good antioxidant activity.

Soutellaria barbata; fl avonoid; response surface analysis; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201602008

Q946.5

A

1002-6630（2016）02-0045-06

陳紅梅, 謝翎. 響應(yīng)面法優(yōu)化半枝蓮黃酮提取工藝及體外抗氧化性分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 45-50. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201602008. http://www.spkx.net.cn

CHEN Hongmei, XIE Ling. Optimization of extraction process for flavonoid from Soutellaria barbata by response surface methodology and evaluation of its antioxidant activity[J]. Food Science, 2016, 37(2): 45-50. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602008. http://www.spkx.net.cn

2015-05-12

安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項目（KJ2015A185）

陳紅梅（1980—），女，副教授，碩士，研究方向為植物生物化學(xué)。E-mail：hongmeichen2000@163.com

*通信作者：謝翎（1980—），男，副教授，博士，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：xxvexl9@163.com