北極海洋紅球菌（Rhodococcus sp.）B7740產(chǎn)類胡蘿卜素的提取條件優(yōu)化及甲基萘醌類類胡蘿卜素鑒定

陳亞淑，汪 榮，謝筆鈞，楊季芳，陳吉?jiǎng)?，孫智達(dá),*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.浙江萬(wàn)里 學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

北極海洋紅球菌（Rhodococcus sp.）B7740產(chǎn)類胡蘿卜素的提取條件優(yōu)化及甲基萘醌類類胡蘿卜素鑒定

陳亞淑1，汪 榮1，謝筆鈞1，楊季芳2，陳吉?jiǎng)?，孫智達(dá)1,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.浙江萬(wàn)里 學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

利用酶的高效性和專一性破裂細(xì)菌細(xì)胞壁，實(shí)現(xiàn)對(duì)類胡蘿卜素的溫和提取并鑒定。以加酶量、酶解時(shí)間和料液比作為單因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出最優(yōu)提取條件為：菌粉與溶菌酶配比1∶10（mg/mL）、酶解時(shí)間80 min、料液比1∶80（mg/mL），此條件下類胡蘿卜素提取量為675 μg/g。采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)進(jìn)行類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)鑒定，液相色譜-質(zhì)譜條件為：色譜柱YMCC30（4.6 mm×150 mm，5 μm）、檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm、大氣壓力化學(xué)電離源、正離子模式、離子源溫度230 ℃、充電電壓2 000 V、質(zhì)荷比掃描范圍200～1 200，鑒定出分子式分別為C51H76O2和C51H74O2的2 種甲基萘醌類胡蘿卜素。

類胡蘿卜素；酶法提??；高效液相色譜；液相色譜-質(zhì)譜；紅球菌B7740

紅球菌屬是一類廣泛分布于自然界的革蘭氏陽(yáng)性菌，在土壤、海底沉積物和食草動(dòng)物中含量豐富，且多數(shù)為營(yíng)腐生生活。紅球菌屬（Rhodococcus sp.）是在1891年由Zoof建立的，從建立至今，分類地位一直不確定。目前，紅球菌歸屬于放線菌門(mén)（Actinobacteria），放線菌綱（A c t i n o b a c t e r i a），放線菌亞綱（Actinobacteridae），放線菌目（Actinomycetales），棒桿菌亞目（Croynebacterineae），諾卡氏菌科（Nocardiaceae），紅球菌屬（Rhodococcus）[1]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅平紅球菌的研究較多，主要集中在其生物降解能力研究和分子學(xué)研究。胡曉靜[2]研究了紅平紅球菌H-412在油中的生物脫硫途徑和機(jī)理，Hibino等[3]研究發(fā)現(xiàn)疏水性的紫紅紅球菌能很好地分散于有機(jī)溶劑中，有很好的生物轉(zhuǎn)化活性，而一些放線菌、綠硫菌和光合細(xì)菌能夠產(chǎn)生類胡蘿卜素，紅球菌屬是放線菌中能產(chǎn)生類胡蘿卜素的一個(gè)屬[4-5]。類胡蘿卜素是廣泛存在于自然界中的脂溶性色素，至今已發(fā)現(xiàn)了600多種。類胡蘿卜素是由異戊二烯烴長(zhǎng)鏈為主體衍生而來(lái)極性較小的色素[6]。為了保證結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，類胡蘿卜素中的共軛碳碳雙鍵處于反式構(gòu)型，自然界中幾乎所有的類胡蘿卜素都是反式結(jié)構(gòu)。光、熱或酸、堿等因素會(huì)使類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)發(fā)生異構(gòu)化，產(chǎn)生順式構(gòu)型的類胡蘿卜素。

陳梅雪等[6]分析了細(xì)菌細(xì)胞中類異戊二烯醌的結(jié)構(gòu)，主要有2 種結(jié)構(gòu)類型：萘醌和苯基醌，其中萘醌可進(jìn)一步分為2 種類型：葉綠醌和甲基萘醌。見(jiàn)圖1A，葉綠醌通常存在于植物的綠色部分，很少在細(xì)菌中存在；如圖1B所示，甲基萘醌的通式為MKn(Hm)，其中：n表示側(cè)鏈中異戊二烯單元的確定數(shù)目；m表示聚異戊二烯鏈中氫原子的飽和度（如MK8或MK8(H2)等）。

圖1 葉綠醌（A）和甲基萘醌（B）分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of phylloquinone and menaquinone

類胡蘿卜素的提取方法有很多種，不同的原料對(duì)應(yīng)的方法不同。目前，已有的類胡蘿卜素提取方法有酸熱法、有機(jī)溶劑提取法、研磨法、酶法、超聲波輔助萃取和超臨界流體法等[8-10]。酶法提取類胡蘿卜素是近幾年發(fā)展起來(lái)的生物提取技術(shù)。利用酶的高效性和專一性在短時(shí)間內(nèi)破裂組織或細(xì)菌細(xì)胞壁，實(shí)現(xiàn)類胡蘿卜素的溫和提取。趙功玲等[11]采用外加果膠酶及纖維素酶提取番茄中番茄紅素，大大提高了提取速率和效率。

類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)鑒定常用的方法是紫外、質(zhì)譜、核磁。由于類胡蘿卜素含量低、不穩(wěn)定、易降解和異構(gòu)化限制了核磁共振在類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)研究上的應(yīng)用。早期，在高效液相色譜中主要用C18反相色譜柱來(lái)分離物質(zhì)，然而C30反相色譜柱能夠分離同分異構(gòu)體的優(yōu)點(diǎn)使其在類胡蘿卜素的分析中越來(lái)越成為主流[12]。目前，有很多研究者使用C30反相色譜柱和大氣壓力化學(xué)電離源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）分析鑒定類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)和種類，如Inbaraj等[13]鑒定寧夏枸杞中類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)，Kao等[14]鑒定蒲公英中類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)。

類胡蘿卜素具有體內(nèi)清除自由基、抗氧化、抗癌等多重生理作用[15-19]，在已有的600多種類胡蘿卜素中有10多種已被多數(shù)國(guó)家批準(zhǔn)使用于各個(gè)領(lǐng)域[20]。本研究的原料是紅球菌（Rhodococcus sp.）B7740，是研究者于2008年7—9月中國(guó)第3次北極科學(xué)考察期間，用Seabird911 Plus CTD 系統(tǒng)從北冰洋B77站點(diǎn)（146°49.28′W，76°58.08′N）25 m深的表層海水樣品中分離得到[21]，寧波市微生物與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)16S rDNA序列BLAST在線比對(duì)，判定該菌為紅球菌屬。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，得到的凍干菌粉呈橘紅色。通過(guò)以往研究結(jié)果，推斷紅球菌B7740能夠產(chǎn)生胞內(nèi)色素類胡蘿卜素，具有成為天然色素生產(chǎn)資源的潛力和工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)探究其類胡蘿卜素產(chǎn)品的提取工藝以及組成，為實(shí)現(xiàn)紅球菌B7740的工業(yè)潛力和價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北極海洋紅球菌（Rhodococcus sp.）B7740凍干菌粉由浙江萬(wàn)里學(xué)院提供；溶菌酶（20 000 U/mg）、醋酸鋅、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正己烷、二氯甲烷、色譜級(jí)甲醇、色譜級(jí)甲基叔丁基醚、0.22 μm有機(jī)濾膜、進(jìn)樣瓶、氫氧化鉀、濃硫酸、三氯化銻、氯仿、無(wú)水硫酸鈉、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WH-3微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器有限公司；EL-104電子天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；WFZ UV-2100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司；UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Shimadzu公司；CR-30色度計(jì) 北京航軒科技發(fā)展有限公司；5810R臺(tái)式低溫離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；1100 Series液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；YMCC30色譜柱 安赫科學(xué)儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 類胡蘿卜素提取工藝流程

1 mg/mL溶菌酶水溶液配制：稱取0.1 g溶菌酶（20 000 U/mg）粉末，加水溶解，定容100 mL。

類胡蘿卜素的提取工藝：稱取0.1 g的紅球菌B7740凍干菌粉置于離心管中，加入0.5～4 mL溶菌酶溶液，渦旋30 s混合，在37 ℃水浴中保持20～100 min，加入2 mL預(yù)冷飽和醋酸鋅溶液，混勻，7 000 r/min離心10 min。除去上清液，加入5～9 mL甲醇與二氯甲烷（8∶2，V/V）混合均勻，7 000 r/min離心10 min。取出上清液，用甲醇與二氯甲烷（8∶2，V/V）定容至100 mL，測(cè)定吸光度A450nm并計(jì)算類胡蘿卜素產(chǎn)量，且保留下層沉淀作2 次提取用。2 次提取是指在一次提取結(jié)束后，將下層沉淀重新溶劑在甲醇與二氯甲烷（8∶2，V/V）混合均勻，7 000 r/min離心10 min。取出上清液，用甲醇與二氯甲烷（8∶2，V/V）定容至100 mL，測(cè)定吸光度A450nm并計(jì)算類胡蘿卜素產(chǎn)量，并保留下層沉淀作3 次提取用。3 次提取與2 次提取方法相同，3 次提取后B7740菌體基本無(wú)色。實(shí)驗(yàn)平行3 次，取平均值[22]。

1.3.2 提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定

選取加酶量、破壁時(shí)間和料液比做單因素試驗(yàn)，在試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果確定色素最優(yōu)提取條件。選取菌粉-加酶量比作為單因素時(shí)，破壁時(shí)間1 h、料液比1∶50 （mg/mL）；破壁時(shí)間作為單因素時(shí)，菌粉-加酶量比1∶10（mg/mL）、料液比1∶50（mg/mL）；料液比作為單因素時(shí)，菌粉-加酶量比1∶10 （mg/mL）、破壁時(shí)間1 h。參考以上單因素試驗(yàn)的結(jié)果，如表1所示，選取菌粉-加酶量比（A）、破壁時(shí)間（B）、料液比（C）這3 個(gè)因素做三因素三水平正交試驗(yàn)，以色度測(cè)量表征類胡蘿卜素提取量，根據(jù)分析結(jié)果和論證試驗(yàn)得出色素提取的最佳提取條件。

表1 正交試驗(yàn)因素水平TTable 1 Factors and their coded levels used in orthogonal array design

1.3.3 色素中類胡蘿卜素含量和提取率計(jì)算

色素提取液中類胡蘿卜素含量按照文獻(xiàn)[23]報(bào)道，按公式（1）計(jì)算：

式中：A為提取液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；D為稀釋的倍數(shù)；V為溶劑的體積/mL；w為菌粉的質(zhì)量/g；0.16為類胡蘿卜素摩爾消光系數(shù)。

細(xì)菌中類胡蘿卜素的提取率參照黃德見(jiàn)[24]的方法，見(jiàn)計(jì)算公式（2）：

式中：A為提取液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；V為提取劑體積/mL。

1.3.4 高效液相色譜條件

取10 mL紅球菌B7740類胡蘿卜素提取液，用氮?dú)獯蹈扇軇?，加入甲?甲基叔丁基醚（1∶1，V/V）混合液和0.1%的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚溶液，將溶液過(guò)0.22 μm的有機(jī)濾膜，裝入進(jìn)樣瓶中備用。

液相色譜條件：e2695高效液相色譜，2998二極管陣列檢測(cè)器，色譜柱YMCC30（4.6 mm×150 mm，5 μm），進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm。色譜分離程序參考文獻(xiàn)[25]的方法稍有改動(dòng)如下：梯度洗脫流動(dòng)相A為甲醇，B為甲基叔丁基醚，分離程序?yàn)椋?～30 min，A由95%變?yōu)?0%，30～50 min，A由70%變?yōu)?0%，平衡10 min。

1.3.5 液相色譜-質(zhì)譜分析條件

1100 SeriesLC-MSD-Trap-XCT，色譜柱YMCC30（4.6 mm×150 mm，5 μm），進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm。液相色譜分離程序如1.3.4節(jié)所述。液相色譜-質(zhì)譜條件參考文獻(xiàn)[26]的方法稍有改動(dòng)如下：APCI離子源，正離子模式，離子源溫度230 ℃，毛細(xì)管電壓2 000 V，充電電壓2 000 V，碰撞電壓2 000 V，電暈電壓4 V，干燥氣流量7 L/min，溫度330 ℃，霧化器電壓10 psi，質(zhì)荷比掃描范圍200～1 200。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 破壁時(shí)間對(duì)色素提取的影響

如圖2所示，菌粉-加酶量比1∶10（mg/mL）、料液比1∶50（mg/mL），破壁時(shí)間在20～60 min之間時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)紅球菌B7740類胡蘿卜素的提取量增加。在60 min時(shí)細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂完全，故紅球菌B7740類胡蘿卜素的提取量達(dá)到最大。隨著破壁時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，由于類胡蘿卜素對(duì)熱敏感，溫度易使類胡蘿卜素氧化降解使產(chǎn)量降低，故60～100 min時(shí)間范圍內(nèi)紅球菌B7740類胡蘿卜素的提取量逐漸降低。由此選擇40、60、80 min作為破壁時(shí)間正交試驗(yàn)的3 個(gè)因素水平。

圖2 不同破壁時(shí)間下提取物中類胡蘿卜素的提取量Fig.2 Effect of cell disruption time on the yield of carotenoids from Rhodococcus sp. B7740

2.1.2 加酶量對(duì)色素提取的影響

圖3 不同加酶量條件下提取物中類胡蘿卜素的提取量Fig.3 Effect of lysozyme dose on the yield of carotenoids from Rhodococcus sp. B7740

溶菌酶能破裂革蘭氏陽(yáng)性菌紅球菌B7740的細(xì)胞壁，在酶活和破壁時(shí)間一定的情況下，酶量決定細(xì)胞壁的破裂率。從圖3可看出，破壁時(shí)間1 h、料液比1∶50 （mg/mL），在菌粉與加酶量的比例在1∶5～1∶20（mg/mL）之間時(shí)，隨著加酶量的增加，細(xì)胞壁的破裂率增加，類胡蘿卜素的提取量增加，在1∶20時(shí)細(xì)胞壁的破裂率達(dá)到最大，此時(shí)類胡蘿卜素的提取量達(dá)到最大。此后，加酶量進(jìn)一步增加，細(xì)胞壁的破裂率保持不變，故紅球菌B7740類胡蘿卜素的提取量變化不大。由此選擇1∶10、1∶20、1∶30（mg/mL）作為菌粉-加酶量比正交試驗(yàn)的3 個(gè)因素水平。

圖4 不同料液比條件下提取物中類胡蘿卜素的提取量Fig.4 Effect of material/solvent ratio on the yield of carotenoids from Rhodococcus sp. B7740

2.1.3 料液比對(duì)色素提取的影響以甲醇-二氯甲烷（8∶2，V/V）混合液作為提取溶劑、菌粉-加酶量比1∶10（mg/mL）、破壁時(shí)間1 h，隨著溶劑體積的增加，紅球菌B7740類胡蘿卜素的提取量增加，如圖4所示，當(dāng)料液比達(dá)到1∶70時(shí)，提取量達(dá)到最大值。隨后即使溶劑體積增加，但由于1∶70時(shí)細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素幾乎被提取出，故類胡蘿卜素的提取量沒(méi)有增加。由此選擇1∶60、1∶70、1∶80 （mg/mL）作為料液比正交試驗(yàn)的3 個(gè)因素水平。

2.2 色素提取條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results of orthogonal array experiments

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇表1中的因素和因素水平設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)。根據(jù)表2正交試驗(yàn)結(jié)果可知，理論上紅球菌B7740類胡蘿卜素提取的最優(yōu)條件是：菌粉與溶菌酶比1∶10（mg/mL）、溶菌酶破壁時(shí)間80 min、料液比1∶80（mg/mL），即正交試驗(yàn)中的試驗(yàn)3，此條件下類胡蘿卜素提取量為675 μg/g。而且對(duì)提取量影響從大到小依次是料液比，菌粉與溶菌酶比和破壁時(shí)間。二次提取總提取率高于92%。

2.3 色素提取液的色度

表3 不同提取次數(shù)下提取液的色度Table 3 Chrominance of extracts obtained at different extraction cyclesTable 3 Chrominance of extracts obtained at different extraction cycles

從表3可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，提取液的黃色變淺，這也說(shuō)明提取出來(lái)的類胡蘿卜素含量減少。

2.4 高效液相色譜分離色素

如圖5所示，使用高效液相色譜和YMCC30色譜柱能從提取液中分離得到22 種物質(zhì)，每種物質(zhì)在450 nm波長(zhǎng)左右有3 個(gè)吸收峰，確定紅球菌B7740產(chǎn)生的色素是類胡蘿卜素。

圖5 紅球菌B7740類胡蘿卜素提取液色譜圖Fig.5 HPLC of carotenoids in Rhodococcus sp. B7740

2.5 液相色譜-質(zhì)譜分析色素

圖6 紅球菌B7740類胡蘿卜素液相色譜-質(zhì)譜的總離子流圖Fig.6 LC-MS total ion chromatogram of carotenoids from Rhodococcus sp. B7740

從圖6可看出，用本實(shí)驗(yàn)的液相色譜-質(zhì)譜條件，分別在15 min和21 min左右有類胡蘿卜素被離子化并被檢測(cè)到，且在21 min處的信號(hào)強(qiáng)度大于15 min處。

對(duì)圖6保留時(shí)間15.5 min處峰的分析結(jié)果如圖7所示。

圖7 15.5 min處峰的紫外吸收?qǐng)D（A）、一級(jí)質(zhì)譜圖譜（B）和二級(jí)質(zhì)譜圖譜（C）CFig.7 UV-visible absorption spectrum, primary mass spectrum and secondary mass spectrum of peak at 15.5 min

圖7A保留時(shí)間15.5 min處的紫外吸收?qǐng)D中有2 個(gè)最大吸收峰，分別是450 nm和480 nm，另一個(gè)肩峰不太明顯。圖7B峰的一級(jí)質(zhì)譜圖譜中721.6是分子的加氫離子峰M+H，物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量是720.6。圖7C峰的 二級(jí)質(zhì)譜圖譜顯示了該分子的鏈斷裂的規(guī)律。相應(yīng)的碎片離子的質(zhì)量數(shù)為703.4、679.5、665.3、639.3、625.4、611.3、597.2、571.2、543.3、529.3、515.8、503.2、461.1、433.3、409.3、369.2、313.0，斷裂碎片的m/z分別為18、14、15、26、40、56、82、187，表示它們分別失去了一個(gè)H2O，—CH2—、—CH3、—CH=CH—、—C3H4—、—C6H10、—C12H10O2+H，具有典型的甲基萘醌異戊二烯斷裂模式，通過(guò)與文獻(xiàn)[6]的比對(duì)顯示，該化合物具有典型的甲基萘醌異戊二烯結(jié)構(gòu)，再與文獻(xiàn)[27]比對(duì)，推斷該化合物為甲基萘醌類類胡蘿卜素，其化學(xué)分子式是C51H76O2，聚異戊二烯鏈中的氫飽和度為4，簡(jiǎn)稱MK8(H4)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖8所示。

圖8 2-甲基-3-四氫聚異戊二烯基-1,4--萘醌Fig.8 Chemical structure of 2-methyl-3-tetrahydropolyisoprene-1,4-napthoquinone

對(duì)圖6保留時(shí)間21.2 min處峰的分析結(jié)果如圖9所示。

圖9 21.2 min處峰的紫外吸收?qǐng)D（A）、一級(jí)質(zhì)譜圖譜（B）和二級(jí)質(zhì)譜圖譜（C）CFig.9 UV-visible absorption spectrum, primary mass spectrum and secondary mass spectrum of peak at 21.2 min

圖9A在保留時(shí)間21.2 min峰的紫外吸收?qǐng)D中有3 個(gè)明顯的最大吸收峰，即380、400 nm和430 nm。圖9B的一級(jí)質(zhì)譜圖譜中719.6是加氫離子峰M+H，物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量是718.6。圖9C中的二級(jí)質(zhì)譜圖譜顯示該分子的鏈斷裂規(guī)律與15.5 min處物質(zhì)的斷裂規(guī)律相同，這說(shuō)明2 種物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似且只比15.5 min處物質(zhì)少2 個(gè)氫原子，其聚異戊二烯鏈中的氫飽和度為2。以上推斷得出該物質(zhì)為甲基萘醌類類胡蘿卜素，其化學(xué)分子式是C51H74O2，簡(jiǎn)稱MK8(H4)，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖10所示。

圖10 2-甲基-3-二氫聚異戊二烯基-1,4--萘醌Fig.10 Chemical structure of 2-methyl-3-dihydropolyisoprene-1,4-napthoquinone

3 結(jié) 論

在酶法提取的基礎(chǔ)上優(yōu)化提取條件，通過(guò)正交試驗(yàn)確定了最佳的色素提取條件為：菌粉與溶菌酶比1∶10（mg/mL）、溶菌酶破壁時(shí)間80 min、料液比1∶80（mg/mL）。通過(guò)色度測(cè)量對(duì)最優(yōu)提取條件下提取液的顏色進(jìn)行表征。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜確定了2 種萘醌類類胡蘿卜素，相對(duì)分子質(zhì)量分別為718.6和720.6，化學(xué)分子式是C51H74O2和C51H76O2。這2 個(gè)物質(zhì)都是類胡蘿卜素的衍生物——甲基萘醌類類胡蘿卜素，液相色譜-質(zhì)譜結(jié)果中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素和葉黃素等常見(jiàn)類胡蘿卜素的存在。這可能說(shuō)明生長(zhǎng)的極端環(huán)境使得北極海洋紅球菌B7740細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的色素結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜，不再是共軛雙烯與β-紫羅酮環(huán)的簡(jiǎn)單拼接，而是在類胡蘿卜素的基礎(chǔ)上衍生化。

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Optimization of Extraction of Carotenoids and Identification of Menaquinone Carotenoids from Rhodococcus sp. B7740

CHEN Yashu1, WANG Rong1, XIE Bijun1, YANG Jifang2, CHEN Jigang2, SUN Zhida1,*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. College of Biological and Environmental Science, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China)

The mild extraction of carotenoids from Rhodococcus sp. using lysozyme, which can break down the bacterial cell wall efficiently and specifically, was achieved. An orthogonal array design was employed to determine the optimal hydrolysis conditions as follows: bacterial cell powder/lysozyme ratio, 1:10 (mg/mL); hydrolysis time, 80 min; and solid/ liquid ratio, 1:80 (mg/mL). The extracted carotenoids were identified by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). The samples were separated on a YMCC30column (4.6 mm × 150 mm, 5 μm) and detected at 450 nm. LC-MS conditions were set as follows: atmospheric-pressure chemical ionization (APCI) source, positive ion mode, ion source temperature of 230 ℃, charging voltage of 2 000 V and scanning range for mass-to-charge ratio of 200–1 200. The results showed that two kinds of carotenoids were identified and their chemical formulas were C51H76O2and C51H74O2, respectively.

carotenoid; enzymatic extraction method; high-performance liquid chromatography (HPLC); liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS); Rhodococcu sp. B7740

10.7506/spkx1002-6630-201602005

TS266.25

A

1002-6630（2016）02-0025-06

陳亞淑, 汪榮, 謝筆鈞, 等. 北極海洋紅球菌(Rhodococcus sp.)B7740產(chǎn)類胡蘿卜素的提取條件優(yōu)化及甲基萘醌類類胡蘿卜素鑒定[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 25-30. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602005. http://www.spkx.net.cn

CHEN Yashu, WANG Rong, XIE Bijun, et al. Extraction of carotenoids and identification of menaquinone carotenoids from Rhodococcus sp. B7740[J]. Food Science, 2016, 37(2): 25-30. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602005. http://www.spkx.net.cn

2015-05-08

公益性行業(yè)（海洋）科研專項(xiàng)（201405015-5）

陳亞淑（1993—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：489540930@qq.com

*通信作者：孫智達(dá)（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：sunzhida@mail.hzau.edu.cn