零陵寬皮柑橘果皮中黃酮的提取工藝研究

李文藝　張　海

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零陵寬皮柑橘果皮中黃酮的提取工藝研究

李文藝張海

（湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南 永州 425199）

以零陵寬皮柑橘皮為原料，采用水浴浸提和超聲波輔助提取兩種方法來提取寬皮柑橘果皮中的黃酮，在使用單因素實驗方法的基礎之上，進一步采用正交實驗方法優(yōu)化提取工藝。其中，水浴浸提法的最佳工藝條件為：溫度55 ℃、乙醇濃度60 %、時間2.0 h、料液比1：30 (g/mL), 其黃酮提取率為8.5970 mg/g；超聲波輔助提取的最佳工藝條件為:乙醇濃度80 %，超聲時間35 min, 料液比1:40 (g/mL)，其黃酮提取率為9.5720 mg/g。通過對兩種實驗方法進行比較，得出超聲波法更加切實可行。

零陵寬皮柑橘；水浴浸提法；超聲波提取法；黃酮；工藝研究

零陵地處湖南永州市，氣候濕潤，光照時間長，非常適合柑橘生長。零陵出產(chǎn)的寬皮柑橘不僅表皮看起來顏色艷麗、非常誘人，而且嘗起來皮薄核少、酸甜適當。其果皮非常寬松，因此手撕起來，果皮果肉極易分離，手感很好。

黃酮有很多種功效，比如它有抗氧化性[1]；能夠加強血液循環(huán)[2]；能夠降低膽固醇[3]；有擴張冠狀血管活性，調(diào)節(jié)血管滲透性，降低血糖的作用[4]；也有防癌抗癌的效用[5]。目前黃酮的提取方法一般有：水提法[6]、有機溶劑提取法[7]、超聲波輔助提取法[8]、微波提取法[9]、超臨界流體提取法[10]等，黃酮的分析方法一般有：紫外分光光度法[11]、高效液相色譜法[12]、毛細管電泳法[13]等。

現(xiàn)今柑橘是世界上產(chǎn)量最高的水果之一，國際貿(mào)易金額高達近400億人民幣，成為第三大貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品[14]。隨著柑橘產(chǎn)量激增，也產(chǎn)生大量的皮渣。丟棄的橘皮會對環(huán)境造成污染，更浪費了一種很好的資源。本研究充分利用零陵地區(qū)的寬皮柑橘資源，以其果皮為原料，研究從寬皮柑橘皮中采用超聲波輔助提取和有機溶劑提取兩種方法提取黃酮的最佳工藝條件，對比兩種實驗方法，得出最佳工藝條件，為零陵寬皮柑橘果皮的開發(fā)利用提供理論和實驗基礎。

1　材料與方法

1.1 材料與試劑

零陵寬皮柑橘購買于在當?shù)毓r(nóng)處，隨后果皮分離，將其放入烘箱中，設定溫度為50 ℃，防止高溫引起成分變性，持續(xù)烘干24小時后，用高速多功能粉碎機將其粉碎，收藏至干燥環(huán)境中，以備使用；蘆丁標準品，上海強順化學試劑有限公司；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設備

SHZ-DIII型循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限公司；GS623型電子分析天平，新光電子株式會社；WG 71型電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；752型紫外分光光度計，上海舜宇恒平儀器有限公司；KQ2200型超聲波清洗機，江蘇省昆山市淀山湖鎮(zhèn)；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科貿(mào)有限公司；XY-100型高速多功能粉碎機，浙江省永康市松青五金廠。

1.3 試驗方法

1.3.1標準曲線的繪制 準確稱取蘆丁標準品10 mg，用60 %乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中并振蕩搖勻，靜置后即得0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液。分別吸取0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于10 mL容量瓶中，依次編號。首先加入60 %的乙醇溶液至5 mL，再加入0.3 mL的5 %的NaNO2溶液，振蕩搖勻，靜置6 min；再加入0.3 mL的10 %的Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min；再加入3 mL的1 mol/L的NaOH溶液，最后用60 %的乙醇溶液定容，振蕩搖勻，靜置15 min。在波長為510 nm處用紫外分光光度計測定，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.2水浴浸提法

1.3.2.1 單因素實驗 用乙醇溶液為提取劑，采用水浴加熱回流的方法進行實驗。每次都分別精密稱取1 g已經(jīng)處理好的零陵寬皮柑橘果皮粉末于圓底燒瓶中，依次編號，分別加入一定比例的乙醇溶液，水浴浸提。提取完后，抽濾，收集溶液并定容至50 ml，振蕩搖勻，靜置后，按標準曲線制備法, 測定其吸光度值。然后依次研究不同乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度對黃酮提取率的影響。

1.3.2.2 正交試驗 經(jīng)過單因素試驗后，綜合結(jié)論和因素，將乙醇濃度、提取時間、料液比和提取溫度設為4個因素，將黃酮提取率設為因素指標，在各個因素最佳條件影響范圍內(nèi)設計3水平4因素L9(34)的正交試驗。其因素水平表見表格1-1。

表格 1-1 正交試驗因素水平表

水平A乙醇濃度（%）B料液比（g/mL）C提取時間（min）D浸提溫度（℃） 1501:201.055 2601:301.560 3701:402.065

1.3.3超聲波輔助提取法

1.3.3.1 單因素實驗 用乙醇溶液為提取劑，采用超聲波輔助提取的方法進行實驗。每次都分別精密稱取1 g已經(jīng)處理好的零陵寬皮柑橘果皮粉末于圓底燒瓶中，依次編號，分別加入一定比例的乙醇溶液，超聲波水浴下提取。提取完后，抽濾，收集溶液并定容至50 ml，振蕩搖勻，靜置后，按標準曲線制備法，測定其吸光度值。然后依次研究不同乙醇濃度、料液比和提取時間對黃酮提取率的影響。

1.3.3.2正交試驗 經(jīng)過以上單因素試驗后，綜合結(jié)論和因素，將乙醇濃度、提取時間和料液比設為3個因素，將黃酮提取率設為因素指標，在各個因素最佳條件影響范圍內(nèi)設計3水平3因素L9(33)的正交試驗。其因素水平表見表格1-2。

表格1-2 正交試驗因素水平表

水平A乙醇濃度（%）B料液比（g/mL）C提取時間（min） 1701：3525 2801：4030 3901：4535

2　結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

根據(jù)之前的實驗，對其結(jié)果進行處理作圖，用蘆丁的質(zhì)量濃度作為標準曲線的橫坐標 (X)，用所對應實驗測得的吸光度（A）作為標準曲線的縱坐標 (Y)。如圖2-1所示，兩者呈線性關系，其方程為:Y=10.185x+0.0115，R2=0.9991。

圖2-1 蘆丁標準曲線

2.2 樣品中黃酮類物質(zhì)含量的測定

取一定體積的提取液，按照上述方法測定吸光度，對照標準曲線，計算出樣品中黃酮含量，按下列計算公式[15]計算：黃酮提取率=（C×V×D）/M 單位：(mg/g)。

式中，C為按照線性回歸方程而計算得到的黃酮濃度（mg/mL），V為待測液體積（mL），D為樣品稀釋倍數(shù)，M為柑橘皮粉末重量（g）。

2.3水浴浸提法提取零陵寬皮柑橘果皮中黃酮的結(jié)果分析

2.3.1單因素試驗結(jié)果

2.3.1.1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響分析。由圖 2-2可知，黃酮提取率隨著乙醇濃度的加大逐漸上升，當濃度為60%時，提取率最大，其值為7.5158mg/g。隨后，提取率隨著乙醇濃度的增大反而下降。可能是隨著乙醇濃度的增大，粉末中更多的雜質(zhì)隨之溶出，使得黃酮提取率有所下降。所以，乙醇濃度以60%為宜。

圖2-2乙醇濃度對黃酮提取率的影響

2.3.1.2 料液比對黃酮提取率的影響分析。由圖 2-3可知，隨著提取液體積的增加，黃酮提取率呈現(xiàn)出先增大后平穩(wěn)的趨勢。先是隨著乙醇濃度的增大，黃酮在溶液中快速溶出，當料液比為1:30 (g/mL)的時候，黃酮基本擴散完全，圖中1:30-1:50 (g/mL)之間增長趨勢很平緩，即使料液比再增大，黃酮提取率增長也不明顯，又考慮到溶液容量過多會給后續(xù)操作帶來不便，因此，料液比以1:30 (g/mL)為宜。

圖2-3 料液比對黃酮提取率的影響

2.3.1.3 提取溫度對黃酮提取率的影響分析。由圖2-4可知，黃酮的提取率隨著溫度的升高而上升，當溫度達到60 ℃時，黃酮的提取率為最大，其值是7.5435 mg/g。隨后，黃酮的提取率隨著溫度的升高而下降。其原因應該是溫度的過高導致己溶出的黃酮發(fā)生氧化，受到破壞，從而使黃酮提取率下降。因此，提取溫度以60 ℃為宜。

圖2-4 提取溫度對黃酮提取率的影響

2.3.2正交試驗結(jié)果 通過表格2-6的極差值R可以看出，各因素對提取率的影響順序為：乙醇濃度>料液比>提取溫度>浸提時間。乙醇濃度和料液比均對黃酮提取率影響較大，而提取時間和溫度對提取率的影響較小。分析可得水浴提取黃酮的最佳工藝條件為：A2B2C 3Dl，即乙醇濃度為60 %、料液比為1:30 (g/mL)、提取時間為2 h、提取溫度為55 ℃。

2.3.2驗證試驗 在最佳條件下進行3次平行驗證實驗，其黃酮的提取率分別為: 8.7121 mg/g、8.6435 mg/g、8.7882 mg/g，平均值為8.7146 mg/g，表明該工藝條件穩(wěn)定，切實可行。

表2-6 正交試驗表格

實驗號水平黃酮提取率 ABCD 乙醇濃度(%)料液比（mL/g)提取時間(h)提取溫度（℃） （mg/g） 111117.8577 212226.7690 313336.0948 421238.0635 522318.5970 623127.6540 731326.2956 832135.8211 933215.3041 K120.748522.216821.332821.7588 K224.314521.214120.136620.7186 K317.420819.052920.987419.9794 R6.89373.16391.19621.7794

2.4 超聲波提取法提取零陵寬皮柑橘果皮中黃酮的結(jié)果分析

2.4.1單因素試驗結(jié)果

2.4.1.1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響分析 由圖2-7可知，黃酮提取率隨著乙醇濃度的增大呈而增大，當乙醇濃度為80 %時，黃酮提取率最高，其值為8.0357 mg/g，隨后降低。這應該是由于高濃度的乙醇使更多的雜質(zhì)溶出，從而導致黃酮提取率下降。所以，選濃度為80 %的乙醇為宜。

圖2-7 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

2.4.1.2 料液比對黃酮提取率的影響分析 由圖2-8可知，黃酮的提取率隨著料液比的增加而增大，在料液比為1:10-1:20（g/mL）范圍內(nèi)，黃酮提取率增長迅速，在料液比為1:20-1:50（g/mL）范圍內(nèi)，黃酮提取率緩慢增大。黃酮在乙醇溶液中先是快速溶出，然后當黃酮基本擴散完全后，圖中增長趨勢很平緩，料液比再增大，黃酮提取率增長不明顯，又由于溶液容量過多會給后續(xù)操作帶來不便，因此，選取料液比為1:40 (g/mL)為宜。

圖2-8 料液比對黃酮提取率的影響

2.4.1.3 提取時間對黃酮提取率的影響分析 由圖2-9可知，在時間范圍內(nèi)，黃酮提取率出現(xiàn)了先增大后減小再增大的變化趨勢。其中10-30 min黃酮提取率增加迅速，兩處提取率相差l.7122 mg/g，而40 min-60 min處的黃酮提取率相差0.6732 mg/g。由于長時間提取可能破環(huán)黃酮結(jié)構(gòu)和溶出更多雜質(zhì)，所以為了提高效率，減小誤差，故超聲時間以30 min為宜。

圖2-9 提取時間對黃酮提取率的影響

2.4.2正交試驗結(jié)果 由表格3-10的極差值R可知，影響因素順序為：乙醇濃度>料液比>超聲時間。分析得出超聲輔助提取法的最佳提取工藝條件為因素A2B2C3，即乙醇濃度為80 %，料液比為1:40 (g/mL)，超聲時間35 min。

表 3-10 正交試驗結(jié)果

實驗號水平黃酮提取率 ABC 乙醇濃度(%)料液比（g/mL)提取時間(h) （mg/g） 11113.8687 21225.8501 31335.2629 42126.5316 52239.5720 62318.0690 73137.4545 83228.5355 93317.7576 K114.981717.854819.6953 K224.172623.957620.9172 K323.747621.089522.2894 R9.19096.10282.5941

2.4.3驗證試驗 在該最佳條件進行3次平行驗證實驗，其黃酮的提取率分別為：9.5978 mg/g、9.6013 mg/g、9.6247 mg/g，平均值為9.6079 mg/g，表明該工藝條件穩(wěn)定可行。

3　小結(jié)與討論

寬皮柑橘皮中富含精油、維生素、果膠、類黃酮等物質(zhì)，是既營養(yǎng)又保健的食品原料。并且我國柑橘種植面積遼闊，資源十分豐富，開發(fā)利用寬皮柑橘果皮資源具有廣闊的前景。本研究首次以零陵寬皮柑橘地方品種為試驗材料，系統(tǒng)研究了零陵寬皮柑橘果皮中黃酮類化合物的提取工藝。

本研究在單因素實驗的基礎上，通過正交試驗設計和方法，確定了水浴浸提法和超聲波輔助提取法對零陵寬皮柑橘果皮中黃酮的提取的最佳工藝條件。水浴浸提法的最佳工藝條件為：乙醇濃度60 %，浸提時間2.0 h，浸提溫度為55 ℃，料液比1:30 g/mL，黃酮提取率為8.5970 mg/g；超聲波輔助提取法的最佳工藝條件為：乙醇濃度80 %，超聲時間35 min，料液比1：40 g/mL，黃酮提取率為9.5720 mg/g。

對比兩種提取方法，綜合黃酮提取率、實驗時間的長短、經(jīng)濟條件、實驗效率等因素，超聲波輔助提取法比水浴浸提法更加切實可行。但本研究由于實驗裝置的原因，沒有考慮超聲頻率、超聲溫度等因素，所以外部因素影響條件的確定范圍過于窄小。

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（責任編校：何俊華）

2015－05－22

湘南優(yōu)勢植物資源重點實驗室項目（項目編號XNZW15C07）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目（項目編號15B095）。

李文藝（1982－），女，博士，講師，研究方向為藥物提取。

Q94-3

A

1673-2219（2016）05-0047-05