四神丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γmRNA和蛋白表達(dá)的影響*

郭 敏，潘 政，張彤哲

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030

四神丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γmRNA和蛋白表達(dá)的影響*

郭 敏，潘 政△，張彤哲

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030

目的：觀察四神丸對(duì)三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonicaci d，TNBS）/乙醇灌腸所致潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerati vecolitis，U C）模型大鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γmRN A和蛋白表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。方法：將Wistar大鼠60只隨機(jī)分為空白組、模型組、四神丸組（5 g/kg）及柳氮磺吡啶（SA SP，0.3 g/kg）組，采用TN BS/乙醇灌腸法復(fù)制U C大鼠模型，灌胃給藥后肉眼觀察結(jié)腸大體形態(tài)損傷并評(píng)分，采用RT-PCR和免疫組化法檢測(cè)PPAR-γm RN A和蛋白的表達(dá)。結(jié)果：模型組大鼠結(jié)腸組織黏膜層可見炎癥和潰瘍形成；與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織PPAR-γmRN A和蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，四神丸組PPAR-γmRN A和蛋白的表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：四神丸對(duì)TN BS/乙醇法所致U C大鼠模型結(jié)腸黏膜PPAR-γmRN A和蛋白的表達(dá)有上調(diào)作用，提示四神丸治療U C的作用機(jī)制可能與調(diào)控PPAR-γ相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。

潰瘍性結(jié)腸炎；蛋白；基因；四神丸

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種主要局限于結(jié)腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎癥性腸病。以腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重等為主要癥狀，屬中醫(yī)“久瀉”“久痢”“腸風(fēng)”等范疇。因其發(fā)病機(jī)制不明，發(fā)病環(huán)節(jié)多，纏綿難愈，易癌變，治療棘手，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量而被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治疾病之一［1］。近年來，有關(guān)UC發(fā)病機(jī)制的研究以及特異性治療藥物的研發(fā)成為前沿?zé)狳c(diǎn)。在臨床中中藥復(fù)方治療UC的顯著療效已被證實(shí)，但其作用機(jī)制不明。本研究以治療UC有顯著療效的經(jīng)典方四神丸為干預(yù)藥物，與西藥柳氮磺吡啶對(duì)比，觀察其對(duì)UC大鼠模型結(jié)腸組織過氧化物酶體增殖激活受體-γ(PPAR-γ)水平的影響，探討四神丸治療UC的療效機(jī)制，為開發(fā)防治UC的中成藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)［2］。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)W i star大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(180±10)g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(甘)2004-0006。

1.2 藥物試劑及儀器 2，4，6-三硝基苯磺酸(TN BS)(美國(guó)Si gm a公司提供，批號(hào)：2008-16-2)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：0000007526)、PCR試劑盒(Promega Corporation，批號(hào)：108030404)、TRl zol試劑(批號(hào)：19919)和瓊脂糖(批號(hào)：0000101394)均購(gòu)自Invitrogen公司；SP-9001免疫組化染色試劑盒、DAB染色試劑盒和一抗PPAR-γ均購(gòu)自北京博奧森生物工程開發(fā)有限公司；四神丸由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑室制備；柳氮磺吡啶(SASP，上海三維制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H 32020026，0.25 g/片)；核酸定量分析儀(美國(guó)BIO-RAD)；S1000TM型PCR儀(美國(guó)BIO-RAD)；凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD)；3-16PK型通用臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó))；O LYM PUS CX-212型攝像顯微鏡(日本)；BI-2000型醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)(成都泰盟)。

1.3 造模方法 采用參考文獻(xiàn)［3］TN BS/乙醇溶液灌腸法復(fù)制UC大鼠模型：Wistar大鼠60只，禁食不禁水24小時(shí)，用10%水合氯醛腹腔麻醉后，將直徑為2m m聚丙烯管插入大鼠肛門上段8cm后，用1m L注射器一次性將TN BS/乙醇溶液(100 m g/kg TN BS+50%的乙醇0.25 mL)注入，然后抽取一定量的空氣，用同樣的方法注入大鼠腸腔，并提起大鼠尾部倒立30s，以防藥液外漏，造模結(jié)束后保持大鼠平躺姿勢(shì)，待自然清醒，空白組大鼠用等量的生理鹽水灌腸。

1.4 分組與給藥 將Wistar大鼠分為空白組、模型組、四神丸組及SASP組，每組15只。除空白組外均以100 m g/kg TN BS+50%乙醇0.25 m L的混合試劑灌腸。根據(jù)體表面積換算，四神丸組給予四神丸浸膏劑5g/kg灌胃(按照臨床成人用量的10倍折算)，SASP組按0.3g/kg劑量灌胃，灌胃體積均為10 m L/kg，空白組、模型組均用等體積的生理鹽水灌胃。各組均于造模后第2天開始灌胃，1次/d，連續(xù)3周。

1.5 標(biāo)本制備 各組大鼠末次灌胃結(jié)束后禁食不禁水24小時(shí)，行脫頸椎法處死大鼠，取出距肛門以上8 cm處的結(jié)腸段，沿腸系膜緣剪開腸腔，用預(yù)冷的PBS液沖洗腸腔內(nèi)容物，取病變最明顯處結(jié)腸組織大約1 cm，其中0.5 cm迅速移至液氮中保存，剩余組織置于4%中性多聚甲醛緩沖固定液中備用。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PPA R-γ 蛋白表達(dá)SP法：大鼠結(jié)腸組織常規(guī)石蠟包埋進(jìn)行切片，石蠟切片脫蠟至水，微波高壓熱修復(fù)抗原，待冷卻后滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；滴加5%正常山羊血清封閉液；滴加PPAR-γ一抗(濃度1∶100)，4℃冰箱過夜；滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，37℃孵育15分鐘；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育15分鐘；DAB顯色；蘇木素輕度復(fù)染；經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。陰性對(duì)照：同一組片中，用PBS液替代一抗，其余步驟相同。在生物顯微鏡下觀察并拍片，以黃色或棕黃色染色為陽(yáng)性表達(dá)，測(cè)定平均光密度值(mean density)。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)PPA R-γmRNA的表達(dá) 總RN A的提取采用經(jīng)典的Trizol法，應(yīng)用Bio-RAd核酸定量分析儀測(cè)定總RN A的濃度和純度，達(dá)到2.0＞A260nm/A280nm＞1.8。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，合成cDNA，用cDNA模板對(duì)大鼠內(nèi)參β-acti n及PPAR-γ基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由金唯智生物科技北京有限公司合成，內(nèi)參β-acti n引物序列為：上游引物：5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，下游引物：5′-AAGGGTGTAAAACGCAGCTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度292 bp；PPAR-γ引物序列為：上游引物：5′-CTCCGTGGATCTCTCCGTAA-3′，下游引物：5′-CGACATTCAATTGCCATGAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度281bp。擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在凝膠成像儀上成像，采用Q uanti tyO ne圖像分析軟件分析數(shù)據(jù)，獲得各電泳條帶的積分光密度(X)，用β-acti n的積分光密度(A)作為內(nèi)參，計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量(X/A)作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸黏膜損傷程度 與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜損傷嚴(yán)重，肉眼可見多處潰瘍，黏膜顯著充血水腫，腸壁變厚。經(jīng)四神丸及SASP治療后大鼠結(jié)腸黏膜損傷程度均有明顯減輕，其中四神丸組大鼠黏膜僅可見輕度充血水腫，其余損傷恢復(fù)正常。四神丸、SASP組與模型組比較評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。四神丸組與SASP組比較，結(jié)腸組織損傷情況恢復(fù)更好，但評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 四神丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γ蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值的影響(±s)

表1 四神丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γ蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值的影響(±s)

注：與空白組比較，*表示P＜0.01，☆表示P＜0.05；與模型組比較，★表示P＜0.01。

-1

2.2 PPA R-γ蛋白表達(dá) 空白組可見PPAR-γ蛋白大量表達(dá)；模型組PPAR-γ蛋白表達(dá)減弱，數(shù)量減少；SASP組和四神丸組PPAR-γ蛋白表達(dá)增強(qiáng)，數(shù)量增多。各組陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值見表1，陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果見圖1。

圖1 SP法檢測(cè)結(jié)腸組織中PPA R-γ的基因表達(dá)

2.3 RT-PCR半定量檢測(cè) 空白組大鼠結(jié)腸黏膜PPAR-γ基因有較高水平的表達(dá)，模型組的表達(dá)水平降低(P＜0.01)，與模型組相比，四神丸組和SASP組PPAR-γ的基因表達(dá)水平升高(P＜0.01)，見圖2、表2。

圖2 RT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸組織中PPA R-γ的基因表達(dá)

表2 四神丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜PPA R-γ基因表達(dá)的影響(±s)

表2 四神丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜PPA R-γ基因表達(dá)的影響(±s)

注：與空白組比較，*表示P＜0.01；與模型組比較，☆表示P＜0.01。

組別 只數(shù) 劑量/（g·kg-1） PPA R-γ相對(duì)表達(dá)量空白組 15 0 0.44±0.05模型組 15 0 0.19±0.02*四神丸組 15 5 0.39±0.03☆SA SP組 15 0.3 0.41±0.05☆

3 討論

UC是發(fā)病原因不明的炎癥性腸病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC的發(fā)生與感染、環(huán)境影響、精神因素、免疫因素、遺傳等密切相關(guān)，尤其是腸道免疫功能紊亂被公認(rèn)為是本病發(fā)生的重要機(jī)制。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的發(fā)生多由濕邪熱毒侵及，恣食生冷、肥甘之品及郁怒思慮，情志不遂等因素所致五臟功能失調(diào)引起［4-7］。脾主運(yùn)化為后天之本，泄瀉的發(fā)生多因飲食、勞倦損傷脾胃，臨床所見UC病程長(zhǎng)，纏綿難愈，基于中醫(yī)脾腎相關(guān)理論，“五臟所傷、窮必及腎”，所以本病發(fā)病日久，“脾虛及腎”易引起腎虛。所以從“腎虛”論治UC是重要思路。四神丸是治療五更瀉的名方，臨床用于治療UC療效顯著。

四神丸是由《普濟(jì)本事方》五味子散(五味子、吳茱萸)和二神丸(補(bǔ)骨脂、肉豆蔻)相合而成，配伍精當(dāng)，藥少力專。查閱期刊文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)研究四神丸的報(bào)道文獻(xiàn)有兩百余篇，涉及理論探討、臨床觀察、實(shí)驗(yàn)研究，從研究結(jié)果分析證實(shí)四神丸是治療脾腎兩虛型潰瘍性結(jié)腸炎的代表方［7］。四神丸針對(duì)脾腎兩虛所致UC，暖脾溫腎，澀腸止瀉，可謂桴鼓相應(yīng)，故此方備受歷代醫(yī)家推崇?，F(xiàn)代多單獨(dú)或加減化裁后用于治療UC，但其調(diào)控UC腸道免疫的分子機(jī)制鮮見報(bào)道［8］。

PPAR-γ是核激素受體家族中的配體激活受體之一，控制許多細(xì)胞內(nèi)的代謝過程，屬于配體誘導(dǎo)核受體。PPAR-γ是重要的細(xì)胞分化核轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物的心肌、血管平滑肌以及脂肪組織中均有表達(dá)，活化后可調(diào)控多種核內(nèi)靶基因的表達(dá)，具有多種生物學(xué)效應(yīng)［9］。PPAR-γ具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、脂肪代謝、細(xì)胞分化、免疫功能等作用，參與多種慢性免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。尤其是PPAR-γ在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中的作用是近年研究的熱點(diǎn)。PPAR-γ在腸道上皮特別是結(jié)腸的隱窩上皮明顯表達(dá)［10-11］，PPAR-γ是調(diào)控眾多基因表達(dá)所必需的核受體。PPAR-γ的配體噻唑烷二酮類藥物對(duì)UC的治療作用在動(dòng)物模型及臨床患者中均得到證實(shí)［11］。PPAR-γ調(diào)控UC的炎癥反應(yīng)和免疫功能的分子機(jī)制不十分清楚，目前認(rèn)為PPAR-γ主要通過抑制N FκB的活化發(fā)揮其在炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)中的抗炎作用。最初認(rèn)識(shí)的主要功能在于調(diào)節(jié)脂肪代謝，最近的研究表明它也參與炎癥的調(diào)節(jié)［12］。PPAR-γ激活后可通過與N F-kB、AP-1、STATS信號(hào)通路相互作用而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄［13］。有研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ在UC中結(jié)腸黏膜中的表達(dá)明顯低于正常組［14］。還有實(shí)驗(yàn)顯示T、B淋巴細(xì)胞中表達(dá)的PPAR-γm RN A、PPAR-γ及其相關(guān)配體在免疫中起重要作用［15-16］。

本研究發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠結(jié)腸黏膜中PPAR-γ蛋白和基因表達(dá)均較強(qiáng)，模型組大鼠結(jié)腸黏膜中PPAR-γ蛋白和基因表達(dá)量降低(P＜0.01)，而SASP和四神丸組PPAR-γ蛋白和基因表達(dá)量又高于模型組(P＜0.05)。說明PPAR-γ參與了UC的發(fā)病過程，四神丸治療UC的作用機(jī)制可能是發(fā)揮溫腎健脾的整體調(diào)節(jié)作用，起到了類似PPAR-γ激動(dòng)劑的效用，通過升高PPAR-γ蛋白和基因的表達(dá)，調(diào)控PPAR-γ相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制腸黏膜免疫系統(tǒng)的過度激活，發(fā)揮其在UC中的抗炎作用。

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The Influence of SiShen Pills on the Expressions of PPAR-γmRNA and Protein in Colonic Mucosa of the Rats with Ulcerative Colitis

GUO Min，PAN Zheng△，ZHANG Tongzhe
Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030，China

Objective:To observe the effects of SiShen pills on the expressions of PPAR-γmRNA and protein in colonic mucosa of TNBS/alcohol enema-induced ulcerative colitis（UC）rats，and explore its mechanism.Methods: Sixty rats werer an domizedinto the blank group，the model group，SiShen pills group（5g/kg）and SASP group（0.3g/kg），UC rat model was replicated by TNBS/alcohol enema，gross morphological injuries of the colon were observed under the naked eyes and scored，the expressions of PPAR-γ mRNA and protein were detected by RT-PCR and immunohistochemical method.Results:The inflammation and ulceration could be seen in the mucous layer of colon tissue of the rats in the model group；compared with the blank group，the expressions of PPAR-γ mRNA and protein decreased notably in the colon tissue of the rats in the model group，and the difference presented statistical meaning（P＜0.01）；compared with the model group，the expressions of PPAR-γmRNA and protein raised evidently in SiShen pills group，and the difference demonstrated statistical meaning（P＜0.01）.Conclusion:SiShen pills could up-regulate the expressions of PPAR-γ mRNA and protein in colon mucosa of UC rats，which suggests that the mechanism of SiShen pills in treating UC might be related to PPAR-γ-related signal transduction pathway regulation.

ulcerative colitis；protein；the gene；SiShen pills

R574.6

A

1004-6852（2016）09-0015-04

2016-01-29

甘肅省自然科學(xué)基金（編號(hào)1107RJZA 222）。

郭敏（1962—），男，主治醫(yī)師。研究方向：急救醫(yī)學(xué)。

△通訊作者：潘政（1977—），男，博士研究生，副主任醫(yī)師。研究方向：危重病的教學(xué)、臨床診治與研究。