腹腔注射不同劑量DON對(duì)肉雞免疫功能及血液生化指標(biāo)的影響

黃　凱，朱風(fēng)華，宋明明，徐　丹，王　赫，張瑞星，朱連勤

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

腹腔注射不同劑量DON對(duì)肉雞免疫功能及血液生化指標(biāo)的影響

黃凱，朱風(fēng)華，宋明明，徐丹，王赫，張瑞星，朱連勤

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

本試驗(yàn)對(duì)腹腔注射不同劑量的脫氧化雪腐鐮刀菌烯醇（DON）對(duì)肉雞的毒性作用進(jìn)行了研究。將32只AA肉公雞隨機(jī)分為4組，每組8只。1組為對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水，2～4組為試驗(yàn)組，分別腹腔注射含10、50、100 μg/mL的DON生理鹽水溶液1 mL。每天注射1次，試驗(yàn)期35 d。結(jié)果顯示，DON中高劑量組IL-4、IL-6、IgA、IgM、ND和IBD抗體水平、GSH-Px活性、總抗氧化能力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），各試驗(yàn)組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），DON高劑量組脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著低于其他各組（P＜0.05）。由此可見(jiàn)DON對(duì)肉雞具有明顯的氧化損傷和免疫毒性，且呈劑量相關(guān)性。

DON；腹腔注射；肉雞；氧化損傷；免疫功能

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是存在于糧食和飼料中的主要真菌毒素之一［1］。杜妮［2］在2013年檢測(cè)動(dòng)物配合飼料，發(fā)現(xiàn)DON檢出率達(dá)98.02%、最高值為5 665.30 μg/kg、平均值為1 195.50 μg/kg，均高于豬配合飼料限量標(biāo)準(zhǔn)（1 000 μg/kg）。王金勇等［3］在2013年檢測(cè)了豬禽飼料，發(fā)現(xiàn)豬飼料DON最高值為4 773 μg/kg、平均值為592 μg/kg；禽飼料最高值為2 838 μg/kg、平均值為616 μg/kg。DON在飼料中的污染狀況引起了飼料和養(yǎng)殖業(yè)界的高度關(guān)注。許多研究證明，DON具有免疫毒性和氧化損傷作用。但是，關(guān)于DON對(duì)家禽毒性研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)采用腹腔注射的攻毒方式，探討DON對(duì)肉雞的免疫毒性及氧化損傷，進(jìn)一步闡釋DON致肉雞中毒的機(jī)理。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物與處理選32只1日齡健康A(chǔ)A肉雞隨機(jī)分為4組，1組為對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水1 mL；2、3、4組為試驗(yàn)組，分別腹腔注射含DON 10、50、100 μg/mL的生理鹽水溶液1 mL，每天注射1次。試驗(yàn)期35 d。

1.2飼養(yǎng)管理飼喂全價(jià)顆粒料，自由采食和飲水。7日齡，接種新城疫Ⅳ系、傳支H120二聯(lián)凍干苗，雙倍點(diǎn)眼滴鼻免疫；14日齡，接種傳染性囊病疫苗，雙倍飲水。21日齡，接種新城疫Ⅳ系疫苗，雙倍飲水。

1.3試劑與藥品DON純品、ConA和MTT，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640，購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；胎牛血漿，購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）、IgG、IgM、IgA、IL-2、IL-4、IL-6檢測(cè)試劑盒、二甲基亞砜，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。新城疫抗體（NDV-Ab）、傳染性囊病抗體（IBDV-Ab）檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海勁馬生物科技有限公司。

1.4檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1血漿中免疫指標(biāo)的測(cè)定對(duì)32只肉雞進(jìn)行心臟采血，肝素鈉抗凝，3 000 r/min離心15 min，取上層血漿，用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血漿中IL-2、IL-4、IL-6、IgA、IgG、IgM、NDV-Ab、IBDV-Ab的含量。

1.4.2血漿中生化指標(biāo)的測(cè)定用比色法檢測(cè)血漿中T-AOC、GSH-Px、ALT、AST的活性。

1.4.3外周血、脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)定每組隨機(jī)取4只雞，心臟無(wú)菌采血2 mL，肝素鈉抗凝，取1 mL用Hank′s液1∶1稀釋，用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞分離，分離的外周血淋巴細(xì)胞用PBS洗滌兩次，最后用RPMI 1640完全培養(yǎng)液洗滌一次，重懸，計(jì)數(shù)，并用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力大于95%，將外周血淋巴細(xì)胞的濃度調(diào)成2.0×106個(gè)/mL備用。接著無(wú)菌條件下，將雞的脾臟取出，放入盛有PBS的培養(yǎng)皿內(nèi)，用PBS輕輕清洗掉脾臟周圍的血液殘?jiān)?，剝離脾臟周圍的結(jié)締組織，將其放入200目篩網(wǎng)上，用鑷子撕碎，用20 mL一次性注射器的內(nèi)芯輕輕研磨、過(guò)濾，用淋巴細(xì)胞分離液分離脾臟淋巴細(xì)胞，分離的脾臟淋巴細(xì)胞用PBS洗滌兩次，最后用RPMI 1640完全培養(yǎng)液洗滌一次，重懸，計(jì)數(shù)，并用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力大于95%，將脾臟淋巴細(xì)胞的濃度調(diào)成2.0×106個(gè)/ mL。采用MTT法檢測(cè)雞外周血和脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。將淋巴細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，另設(shè)培養(yǎng)基空白對(duì)照組（無(wú)淋巴細(xì)胞，只含RPMI-1640和ConA），每孔加入10 μL 100 μg/ mL的ConA。設(shè)5個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)終止前4 h，每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT 10 μL，培養(yǎng)至終止，每孔加100 μL二甲基亞砜（DMSO），吹打混勻，靜置10 min，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶物完全溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD490nm值。計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率：

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=（試驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/空白對(duì)照組OD值

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）對(duì)各均值進(jìn)行多重比較，結(jié)果用±SD表示。

2　結(jié)果

2.1注射不同劑量DON對(duì)肉雞血漿細(xì)胞因子和抗體水平的影響腹腔注射含DON 10-100 μg/mL的生理鹽水溶液組，肉雞血漿IL-2、IL-6、IgA和IgM含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。腹腔注射含DON 50、100 μg/mL組，肉雞血漿IL-4含量和NDV-Ab水平顯著低于對(duì)照組和腹腔注射含DON 10 μg/mL組（P＜0.05）。腹腔注射含DON 50、100 μg/mL組，IBD-Ab水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2注射不同劑量DON對(duì)血漿生化指標(biāo)的影響

試驗(yàn)至42 d，腹腔注射含DON 50 μg/mL和100 μg/mL組，肉雞血漿T-AOC水平顯著低于對(duì)照組和腹腔注射含DON 10 μg/mL組（P＜0.05）。腹腔注射含DON 10-100 μg/mL組，肉雞血漿GSH-Px活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），肉雞血漿ALT水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1　不同注射劑量DON對(duì)肉雞血漿細(xì)胞因子和抗體水平的影響

表2　不同注射劑量DON對(duì)血液生化指標(biāo)的影響單位：U/L

2.3注射不同劑量DON對(duì)肉雞脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率以及外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響腹腔注射含DON 100 μg/mL組，肉雞脾臟和外周血LTR顯著低于其他各組（P＜0.05），其他各組差異不顯著（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3　不同注射劑量DON對(duì)肉雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

3　討論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給肉雞連續(xù)35 d腹腔注射1 mL含DON 10、50、100 μg/mL的生理鹽水溶液，NDV和IBDV抗體水平呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；注射1 mL含DON 50 μg/mL和100 μg/mL的生理鹽水溶液時(shí)，NDV抗體水平顯著下降；注射1 mL含DON 100 μg/mL的生理鹽水溶液時(shí)，IBDV抗體水平顯著下降。Harvey等［4］給肉雞飼喂含DON 50 mg/kg的日糧，降低肉雞血清NDV和IBDV抗體濃度。D?nicke等［5］報(bào)道，用主要含DON（含量分別為3.5、7.0、10.5 mg/kg和14.0 mg/kg）的小麥飼喂肉雞，發(fā)現(xiàn)血清NDV抗體滴度明顯降低，且呈明顯的濃度依賴性。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，給肉雞連續(xù)35 d腹腔注射1 mL含DON 10、50、100 μg/mL的生理鹽水溶液，顯著降低血漿IgA和IgM含量。Warner等［6］通過(guò)鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外試驗(yàn)也證明，培養(yǎng)基質(zhì)中DON濃度在10 μg/mL～1 000 μg/mL時(shí)，能降低培養(yǎng)基質(zhì)中IgA、IgG、IgM的含量。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，注射1 mL含DON 100 μg/mL的生理鹽水溶液時(shí)，脾臟淋巴細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著降低。Ouyang等［7］研究顯示，培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞在DON（50～500 μg/mL）作用下，低濃度DON（50 μg/mL和100 μg/mL）能延遲或損害細(xì)胞增殖，而高濃度下DON（250～500 μg/mL）能完全抑制細(xì)胞增殖。Harvey等［4］給肉雞飼喂含DON 50 mg/kg的日糧，發(fā)現(xiàn)DON能夠抑制促進(jìn)淋巴細(xì)胞分裂的有絲分裂原的產(chǎn)生。Warner等［6］通過(guò)體外試驗(yàn)也證明，培養(yǎng)基質(zhì)中DON濃度在10～1 000 μg/mL時(shí)，能抑制鼠脾臟淋巴細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)的合成。給肉雞連續(xù)35 d腹腔注射1 mL含DON 10、50、100 μg/mL的生理鹽水溶液，顯著降低肉雞血漿IL-2、IL-4和IL-6含量?？梢钥闯觯瑖I吐毒素對(duì)肉雞細(xì)胞免疫和體液免疫產(chǎn)生不利影響，染毒劑量越高越嚴(yán)重。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給肉雞連續(xù)35 d腹腔注射1 mL含DON 50和100 μg/mL的生理鹽水溶液，肉雞血液總抗氧化能力顯著降低，血漿GSH-Px活性顯著下降，血漿AST和ALT活性顯著升高。Kouadio等［8］用DON（5-40 μmol/L）處理Caco-2細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)DON可以阻斷Caco-2細(xì)胞鞘磷脂代謝，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，使細(xì)胞MDA增加，細(xì)胞抗氧化能力下降。Chen等［9］試驗(yàn)結(jié)果顯示，給仔豬連續(xù)6周飼喂含DON 1 mg/kg飼料，明顯提高AST和ALT活性。由此可見(jiàn)，DON具有明顯的氧化損傷作用并造成肝臟損害。

［1］Plattner R D，Maragos C M.Determination of deoxynivalenol and nivalenol in corn and wheat by liquid chromatography with electrospray mass spectrometry［J］.Journal of AOAC International，2003，86（1）：61-65.

［2］杜妮.2013年我國(guó)部分地區(qū)飼料及原料霉菌毒素污染調(diào)査報(bào)告［J］.今日養(yǎng)豬業(yè)，2014，3：48-52.

［3］王金勇，劉穎莉，關(guān)舒.2013年中國(guó)飼料和原料霉菌毒素檢測(cè)報(bào)告［J］.國(guó)外畜牧學(xué)-豬與禽，2014，34（2）：49-51.

［4］Harvey R B，Huff W E，Elissalde M H，et al.Heamatologic and immunologic toxicity of deoxynivalenol（DON）-contaminated diets to growing chickens［J］.Bull Environ Contam and Toxicol，1991，46（3）：410-416.

［5］D?nicke S，Matthes S，Halle I，et al.Effects of graded levels of Fusarium toxin contaminated wheat and of a detoxifying agent in broiler diets on performance，nutrient digestibility and blood chemical parameters［J］.Poultry Science，2003，44（1）：113-126.

［6］Warner R L，Brooks K，Pestka J J.In vitro effects of vomitoxin（deoxynivalenol）on T-cell interleukin production and IgA secretion［J］.Food and Chemical Toxicology，1994，32（7）：617-625.

［7］Ouyang Y L，Azcona-Olivera J I，Murtha J，et al.Vomitoxin-mediated IL-2，IL-4，and IL-5 superinduction in murine CD4+T cells stimulated with phorbol ester and calcium ionophore:relation to kinetics of proliferation［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，1996，138（2）：324-334.

［8］Kouadio J H，Mobio T A，Baudrimont I，et al.Comparative study of cytotoxicity and oxidative stress induced by deoxynivalenol，zearalenone or fumonisin B1 in human intestinal cell line Caco-2［J］.Toxicology，2005，213（1-2）：56-65.

［9］Chen F，Ma Y L，Xue C Y，et al.The combination of deoxynivalenol and zearalenone at permitted feed concentrations causes serious physiological effects in young pigs［J］.Journal of Veterinary Science，2008，9（1）：39-44.

TheEffect of Intraperitoneal Injection of Deoxynivalenol on Biochemical and ImmuneIndexes of Plasma in Broiler Chickens

HUANG Kai，ZHU Feng-hua，SONG Ming-ming，XU Dan，WANG He，ZHANG Rui-xing，ZHU Lian-qin
（College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

This trial was conducted to determine the effect of intraperitoneal injection of the deoxynivalenol on broiler chickens.A total of 32 male broiler chicks were randomly divided into 4 treatments with 8 broiler chickens per treatment.Treatment one was the control group injected with normal saline.The broiler chickens in treatment two to four were intraperitoneally injected with 1 mL deoxynivalenol containing deoxynivalenol 10，50 and 100 μg/mL，respectively，once a day for 5 weeks.The results showed that the concentration of IL-4，IL-6，IgA and IgM，the antibody level of NDV and IBDV，the activity of GSH-Px，and the level of T-AOC in serum in the broiler chickens intraperitoneally injected with 1 mL the deoxynivalenol containing the deoxynivalenol 50 or 100 μg/mL were significantly lower than that in the control group（P＜0.05）.In broiler chickens injected with 1 mL the deoxynivalenol containing the deoxynivalenol 10～100 μg/mL，the activity of AST in serum was significantly higher than that in the control group（P＜0.05）.In broiler chickens injected with 1 mL the deoxynivalenol containing the deoxynivalenol 100 μg/mL，LTR of spleen and peripheral blood was significantly lower than other treatments（P＜0.05）.In conclusion，the deoxynivalenol has significantoxidative damage and immunotoxicity to broilers in a dose-dependent manner.

Deoxynivalenol；Intraperitoneal injection；Broiler chicken；Oxidative stress；Immunity

ZHU Lian-qin

S858.31

A

0529-6005（2016）04-0033-03

2014-10-14

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-13-011-07）；青島科技局項(xiàng)目（12-1-2-32-nsh）

黃凱（1988-），男，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病與中毒病，E-mail：945044149@qq.com

朱連勤，E-mail：lqzhu@qau.edu.cn